专利名称：一种博莱霉素的精制方法
技术领域：
本发明涉及一种博莱霉素的精制方法。
背景技术：
由于环境的恶化和不健康的生活习惯，世界范围内的肿瘤发病率持续增
高。从1996年以来全球每年新确诊的肿瘤患者均在1030万人以上，到1999 年底全球肿瘤患者总数已逾4000万人。世界卫生组织2001年报道，世界癌 症发病率和死亡率比1990年上升了 22%,今后20年还将上升大约50%。
博莱霉素(Bleomycin)是一族具有独特结构和作用的广谱抗菌抗肿瘤 抗生素，对多种肿瘤疾病有效，并且不引起白细胞减少，不抑制机体免疫功 能，不损伤造血系统。博莱霉素杀伤肿瘤细胞的机制是在体内与铁和氧结合 形成复合物，然后与染色体作用进攻DNA靶点，引发DNA降解反应，从 而通过抑制肿瘤细胞DNA合成，达到抗肿瘤的效果。所以开发博莱霉素具 有重要的现实意义。
博莱霉素是一族抗生素，由5个氨基酸、2个六碳糖和1个氨基侧链构 成，各组分分子结构间差异仅在于氨基取代侧链的不同，其中目前临床使用 的博莱霉素主要成分为A2和B2组分。由于结构特殊和含有较多的同系物，
博莱霉素提取有一定难度。现有提取方法是经过粗提得到博莱霉素粗品后， 用凝胶层析进行精制，该精制方法收率较低(一般在70%左右)，且自动化 程度不高。
发明内容
因此，本发明要解决的问题就是提供一种博莱霉素的精制方法，该精制方法收率较高，制备用时较短，成本较低。
本发明人经过研究发现现有技术中采用高效液相色谱(HPLC)分析 技术检测博莱霉素单位，该HPLC技术可发展用以精制博莱霉素。但是现有 HPLC分析方法的流动相中添加的离子对试剂都价格昂贵，如美国药典中分 析博莱霉素的HPLC条件中流动相里加入戊垸磺酸钠，其价格一般在每100 克2000—3000元，故如果在工业生产中用其大规模的精制博莱霉素，成本 过高，是不可行的。本发明人经过大量的试验，惊喜地发现几种较常见且 价格低廉的可溶性硫酸盐类可替代该离子对试剂，大大降低了生产成本，因 而实现了本发明。
因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案可以是 一种博莱霉 素的精制方法，包括将博莱霉素粗品采用制备型HPLC技术纯化，其中制备 柱的固定相为Q或d8的硅胶柱，流动相为pH3.5 5的硫酸盐水溶液与极性 有机溶剂的混合液。
本发明所述的硫酸盐为电离时生成金属离子或铵根离子(NH4+)，以及硫 酸根离子(S04"的化合物，并可溶解于所述pH3.5 5的水溶液中。较佳的所 述硫酸盐可选自硫酸钾，硫酸钠和硫酸铵中的一种或多种。所述的硫酸盐的 用量较佳的为占所述水溶液的0.05-0.5% (g/100ml)。
较佳的，所述的pH3.5 5的硫酸盐水溶液是由溶有硫酸盐的水溶液用醋 酸调pH至3.5 5而成。
本发明所述的极性有机溶剂可为现有博莱霉素HPLC分析方法中所能 用的极性有机溶剂，较佳的可为乙腈和/或甲醇。
本发明所述的制备型HPLC技术的其余条件均可参照现有的分析型 HPLC技术，如检测波长可为现有能检测到博莱霉素的任何波长，优选分析 型HPLC技术经常选用的280 290nm或250 260nrn;流动相流速优选 10 20ml/min，更优选13-16 ml/min;流动相可以采用等度洗脱，更优选梯度 洗脱的方法极性有机溶剂在流动相中的比例逐渐由低到高，到一定比例后保持一段时间，通常在约25 35分钟的时间内有机相比例在10~20% (v/v) 范围内升高至25~40%，保持5 15分钟左右。
本发明所述的博莱霉素粗品为通过现有技术制备的博莱霉素发酵液经 初步纯化但未进一步如采用凝胶柱精制纯化得到的博莱霉素样品(Hamao Umezawa. Purification of bleomycins. The journal of antibiotics. Sept. 1966 p210-215)。
本发明的博莱霉素的精制方法，相比于现有技术有如下优点
1) 本发明采用制备HPLC技术可得到较高的收率(一般在85%)，现有 博莱霉素的凝胶层析精制方法收率一般在70%;
2) 本发明采用制备HPLC技术，提高了自动化程度；
3) 本发明用几种较常见且价格低廉的可溶性硫酸盐作为离子对试剂， 硫酸盐价格大约在每500克IO元左右，大大降低了成本，可用于工业化生产。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。 下列实施例中使用的仪器为大连伊利特P270型制备液相。未注明具体
条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
其中收率(Q/0的计算公式为收集到的(A2+B2)组分/上样时的(A2+B2)
组分X100X。
实施例1
用ds硅胶柱(Hypersil填料，20mmx250mm， 10um)，检测波长254nm。 博莱霉素粗品用水溶解(200mg溶于10ml水中，每次进样lml)。流动相配 比硫酸铵1.0克，溶解在1000ml水中，用醋酸调pH至3.5，以甲醇为有 机相。流速15ml/min，有机相比例在30min内由15%上升到30% ，并保持 10min，博莱霉素各组分能被良好地分离，收率为87.2%。
5实施例2
用C8硅胶柱(Hypersil填料，20mm x250mm， 10um)，检测波长254nm。 博莱霉素粗品用水溶解(100mg溶于10ml水中，每次进样2ml)。流动相配 比硫酸钾5.0克，溶解在1000ml水中，用醋酸调pH至4.5，以乙腈为有 机相。流速16ml/min，有机相比例在30min内由12%上升到28%,并保持 10min，博莱霉素各组分能被良好地分离，收率88.7%。
实施例3
用ds硅胶柱(Hypersil填料，20mmx250mm， 10um)，检测波长280nm。 博莱霉素粗品用水溶解(150mg溶于10ml水中，每次进样lml)。流动相配 比硫酸钠0.5克，溶解在1000ml水中，用醋酸调pH至5，以甲醇为有机 相。流速13ml/min，有机相比例在35min内由18 %上升到35 % ，并保持10min， 博莱霉素各组分能被良好地分离，收率为85.3%。
权利要求
1、一种博莱霉素的精制方法，其包括将博莱霉素粗品采用制备型HPLC技术纯化，其中制备柱的固定相为C8或C18的硅胶柱，流动相为pH3.5～5的硫酸盐水溶液与极性有机溶剂的混合液。
2、 根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述的硫酸盐选自 硫酸钾，硫酸钠和硫酸铵。
3、 根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述的硫酸盐在水 溶液中的含量为0.05~0.5w/v%。
4、 根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述的pH3.5 5的 硫酸盐水溶液是由溶有硫酸盐的水溶液用醋酸调pH至3.5 5而成。
5、 根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述的极性有机溶 剂为乙腈和/或甲醇。
6、 根据权利要求1所述的精制方法，其特征在于，所述的制备型HPLC 技术中流动相采用梯度洗脱25~35分钟内流动相中有机溶剂比例在 10~20v/v %范围内升高至25~40v/v %,保持5~15分钟。
全文摘要
本发明公开了一种博莱霉素的精制方法，包括将博莱霉素粗品采用制备型HPLC技术纯化，其中制备柱的固定相为C<sub>8</sub>或C<sub>18</sub>的硅胶柱，流动相为pH3.5～5的硫酸盐水溶液与极性有机溶剂的混合液。本发明采用制备HPLC技术提高了博莱霉素活性成分A2和B2的收率(一般在85％)和自动化程度，大大降低了成本，可用于工业化生产。
文档编号C07K9/00GK101463076SQ200710172519
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者垚 刘, 李继安, 陈代杰 申请人:上海医药工业研究院