专利名称：：通过人工酶途径的生物制氢的制作方法
技术领域：
：本发明涉及农业和能源生产领域的生物技术。更具体地，本发明涉及通过将多糖基本上酶催化成氢和二氧化碳从可再生多糖生产氢。
背景技术：
：气候的变化和世界化石燃料储备的最终耗竭威胁着可持续发展(Morris，2006;Hoffertetal.，2002;Farrelletal.,2006)。氢是一种可移动的能源载体，其是充足、清洁的，并且显然不包含碳。根据美国能源部(2004),未来氢经济的研究与开发(R&D)重点包括(i)降低氢生产成本，(ii)发现用于高密度氢储存的可行方法，(iii)建立安全有效的基础设施，以用于从生产到储存到使用无缝地输送氢，(iv)显著降低燃料电池的成本，并改进其耐久性。与使用化石燃料相比，氢是很有前途的用于储存能源的替代品。氢可以在燃料电池中使用，燃料电池是一种将反应的化学能直接转化为电能的电化学装置。燃料电池是一种高效的产生动力和热量的装置。燃料电池提供了显著降低对化石燃料的依赖的可能性。然而，燃料供给是阻止这种装置广泛商业化的主要障碍之一。大部分燃津牛电池通过利用氢作为反应物来运行，所述氢通常通过转化(转化)氬化物制备。最经常利用催化蒸汽重整、自热重整或者催化部分氧化重整将富氢化石燃料重整。但是，对于维持我们能源需求的燃料电池技术来说，需要可再生的氢来源。非化石燃料类的氢产生实例包括利用太阳能或者风能、水电或者地热能电解水；热化学水分解；在工业场地的废气；生物质的气化；和在消化有机组分或者吸收日光时产生氢的生物或者光生物系统。与必须以其产生时使用的电不同，氢可以贮存直到需要。然而，氢的低密度意味着低的能量密度，尤其与传统燃料相比。即使考虑到与传统产能方法相比燃料电池更高的效率，氢的低能量密度有可能阻碍储存和运输方法。多糖是氢的良好储存方式，这是因为多糖包含约6.2质量％的H2/糖单位，并且当其与水反应时，它可以产生12摩尔的二氢。这样潜在的氢储存能力是大约15%。根据美国能源部的目标(SchlapbachandZuttel，2001),具有15%氢储存能力的材料甚至超过了氢储存技术的长期目标。为了从多糖和水真正的提取氢，需要发生总反应(6111005+7H20—6C02+12H2,其中C6Hi。Os表示包含于生物质，例如淀粉或者纤维素中的葡聚糖重复单元。已经存在几种将生物质转化成氢的范例(1)直接多糖气化(Antaletal.，2000);(2)直接葡萄糖化学催化(Cortrightetal"2002;Huberetal"2003);(3)厌氧发酵(DasandVeziroglu，2001;HallenbeckandBenemann，2002);和(4)乙醇发酵(Lyndetal"2002;Zhangetal.，2006;ZhangandLynd，2004)，然后乙西享重整(Delugaetal.，2004)。常规化学方法具有低的氢产率(<60%),，500-900K)(Antaletal.，2000;Cortrightetal.，2002;Huberetal.，2003)。厌氧氢发酵以具有33%的最大产率的低效率而众所周知，(DasandVeziroglu,2001;HallenbeckandBenemann，2002)。乙醇发酵和重整的组合可以产生IO112/葡萄糖单元(83%产率)。考虑到5-10%的发酵损失和大约5。/。的重整损失(Delugaetal.，2004),经过乙醇的实际氢产率可能为约最大产率的75%(最大产率是12H2/葡萄糖单元)。要转化为氢的固体多糖的储存和分配将解决现在氢领域的许多挑战。如果实用的方法和装置可以直接用于运载移动应用例如车辆，则可以解决数个与氢存储设备有关的问题。也就是说，将可以避免氢压缩或者液化的能量损失。此外，用于H2解吸的高温也不再是必需的。此外，固体氢储存材料的使用期限和氢补充时间不再是实际应用中的问题。同样，与气态氢相比，糖的储存和分配是非常安全的。从元素氢产生分子氢的生化途径是已知的。特别是通过光将光系统I(分离的光系统I或者类嚢体中的光系统I)上的电子激发至更高的能量，导致电子贡献给外源电子载体，其能够依次将电子转移给氢化酶。在这个过程中，然后，氧化的光系统I能够直接或者通过电子传递链(例如在类嚢体膜上发现的电子传递链)从电子供体提取一个电子。其中水作为电子供体，所述电子传递链包括光系统II。同时，两个被还原的电子载体分子可以给氢化酶提供电子。氢化酶将两个电子与两个质子结合以形成氢分子。以前已经-使用好氧产氧光合生物或者来自该生物的亚细胞组分以制备氢气(Benemannetal.,1973;RosenandKrasna，1980;Raoetal.，1978)。这些参考文献中报道的无细胞(即，体外)系统的组分需要分离的类嚢体或者来自类嚢体的溶解的光系统I;电子供体，例如水或者人工电子供体例如二碌b苏糖醇或者抗坏血酸；能够接受来自光系统I的电子的氢化酶，当电子来源于可以被氢化酶氧化的电子供体时，氬化酶可以催化两个电子和两个质子结合形成分子氢；以及能够从光系统I接受电子并且可以给氢化酶提供电子的外源电子载体。至少两组产氧光合生物能够在体内产生氩。这些光合生物包括蓝藻和绿藻。蓝藻通常使用固氮酶来产生分子氢。这种产生分子氢过程中使用的电子来源于储存的糖，并用于还原铁氧化还原蛋白，所述铁氧化还原蛋白是固氮酶的即时电子供体(Markovetal.，1995)。在蓝藻中氢化酶也能催化分子氢产生。在蓝藻中，分子氢产生被氧和/或光抑制。绿藻还可以通过氢化酶光照析出(photoevolve)(即，产生)分子氢。电子传递的途径目前是未知的。已经证明用于该过程电子的来源是内源性发酵的糖(KleinandBetz，1978)。在二氧化碳存在的情况下氢产生停止(VatsalaandSeshadri，1985),提示二氧化碳还原的电子阱与氢化酶相比是光合电子流的更好竟争物。分子氢(H2)具有很多商业用途。分子氢可以用于生产氨；石油精炼，其中在典型的精炼过程中自始至终使用H2;化学合成工业，当需要碳-碳双键转化成碳-碳单键，或者将碳-碳三键转化成单键或者双键时；植物油氢化的食品工业；以及电子线路制备。现在氢还被广泛用于制造甲醇、肥料、玻璃、精炼金属、维生素、化妆品、肥皂、润滑剂和清洁剂。此外，在传统的燃烧引擎以及在燃料电池两者中，纯氢均是优良的燃料，并且用氧气氧化时，其只产生水汽。液态氢还可以在例如空间飞行器中用作燃料。目前生产氢燃料的现有技术还面临许多挑战，例如有限的产率，需要高能量的输入，高成本以及额外的纯化步骤以确保燃料是足够清洁的。所需要的是一种大量生产氢的廉价方法，其足以支持燃料电池的广泛使用以及氢的其他用途。尤其需要的是将可再生原料例如包含多糖的丰富生物质直接转换成氢的实用方法、组合物、试剂盒和装置。要求该方法具有对H2的高产率，良好的质量和能效，并且最终要求低成本。
发明内容本发明提供从生物质(biomass)产生氢的方法、组合物和试剂盒。这样产生的氢可用于很多用途，并且良好地适合用作产生能量的燃料。本发明至少部分地基于酶促反应的整合网络，所述反应可将来自多糖的葡聚糖单元和水转化成氢和二氧化碳(葡聚糖)n.^7H20—(葡聚糖)w+12H2+6C02其中(葡聚糖)是脱水葡萄糖单元-C6H!。05-。所述氢来自多糖和水。实质上，本发明依赖于多糖中储存的能量以分解水并产生氢。多糖可以包括(但不限于)淀粉、纤维素、半纤维素、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、0-1，4-葡聚糖、|3-1，3-葡聚糖、^1,6-葡聚糖、a-l，4-葡聚糖、a-l，6-葡聚糖或者任何其他通过糖苷键连接的单体糖单元的低聚物。在第一方面，本发明提供用于从多糖生产氢的工艺或方法。通常，该方法包括通过将多糖的至少一部分转化成6-磷酸葡萄糖(glucose-6-phosphate)来减少多糖的长度；从6-磷酸葡萄糖产生氢。该方法可以通过许多特异性的化学和酶步骤来进行。例如，减少多糖长度的方法可以包括将多糖的末端葡聚糖单元磷酸化，导致末端单元从其来源的多糖切割和释放。这种磷酸化作用可以通过任何数量的磷酸化酶实现，所述磷酸化酶可以将多糖中的糖苷键偶联切割以将磷酸基团引入释放的葡聚糖单元，从而形成6-磷酸葡萄糖。该方法不使用ATP或者其它高能磷酸键化合物。此外，可以通过任何合适的方法实现6-磷酸葡萄糖的生产。优选的，从多糖释放的葡聚糖单元是6-磷酸葡萄糖单元。但是，更典型地，当使用酶促反应时，所述葡聚糖单元是l-磷酸葡萄糖单元，其必须被异构化成6-磷酸葡萄糖单元。可以通过任何合适的化学或者酶法实现异构化。优选酶转化。同样地可以通过任何合适的化学或者生化方法从6-磷酸葡萄糖生产氢。根据优选的实施方案，6-磷酸葡萄糖通过酶法被转化成氢，所述酶法涉及6-磷酸葡萄糖典型地经由6-磷酸葡萄糖酸(6PG)向5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate)的转化。根据示例性的实施方案，6摩尔6-磷酸葡萄糖向6摩尔5-磷酸核酮糖的转化产生12摩尔分子氢。可以理解，不论是化学还是生化反应，都有平衡状态，一旦达到对于特定反应的平衡，净产物将停止形成。为了在本方法中促进并且最大化氢的产生，通过将5-磷酸核酮糖转化成各种产物以从所述反应方程式中去除5-磷酸核酮糖。根据本发明，所述产物可以差别很大，目的是驱动反应向使用5-磷酸核酮糖以允许连续的氩产生。减少系统中5-磷酸核酮糖量的方便方法是借助于戊糖磷酸途径的部分或者全部酶步骤将其除去，所述途径是本领域公知并被广泛了解的。显然，当方法包括氩的酶法生产时，所述方法包括氢化酶的使用。通过所述方法制备的氢可以释放到大气中，但优选将其收集，立即使用或者作为燃料源储存以用于以后的使用。例如，所述方法可以包括将氢从存在于反应容器中的二氧化碳中至少部分地分离。此外，可以将部分或者全部的氢进给入燃料电池以用于发电或者其他能量生产。因此，在示范性的实施方案中，所述方法可以包括(a)提供包括至少一种多糖和水的组合物(例如，混合物)；(b)提供一种以上具有磷酸化酶活性的酶；(c)将至少部分多糖磷酸化以减少多糖的链长并产生1-磷酸葡萄糖；(d)提供一种以上具有葡糖磷酸变位酶活性的酶；(e)将在步骤(c)中产生的l-磷酸葡萄糖至少部分异构化为6-磷酸葡萄糖；(f)提供多种有效催化戊糖磷酸途径步骤的酶；(g)提供一种以上具有氢化酶活性的酶；和(h)从至少部分步骤(e)中产生的6-磷酸葡萄糖形成氢。可以以任何方便的方式，以其常规、基本形式或者按照详述的实施方案中的描述进行本发明的方法。因此，全部的化学或者生化反应步骤可以在单个反应容器中进行。可选地，可以分别地进行一个或者一些反应。所述方法可以按照间歇法或者连续法进行，同时连续地除去氢和废物并引入新的原料。在实施方案中，用于磷酸化多糖的至少一种酶是磷酸化酶，例如l，4-a-葡聚糖磷酸化酶，a-葡聚糖磷酸化酶，支链淀粉磷酸化酶，淀粉磷酸化酶，葡聚糖磷酸化酶(glucanphosphorylase),葡聚糖磷酸化酶(glucosanphosphorylase)，糖原磷酸化酶，麦芽糖糊精磷酸化酶，麦芽糖磷酸化酶，纤维二糖磷酸化酶，纤维糊精磷酸化酶和蔗糖磷酸化酶。在某些实施方案中，用于产生氢的至少一种酶是来自古纟田菌(archaebacterium)尸,ococcws的氛酵。可选的，可以将无机磷酸盐以超过在该方法中另外产生的无机磷酸的量加入至该方法中。在优选的实施方案中，磷酸盐在所述系统中不积聚。还优选的在所述方法中不产生或消耗ATP。当本发明的方法包括酶促反应时，还可以参考下列酶功能少部分多糖磷酸化以产生1-磷酸葡萄糖；(b)将至少部分l-磷酸葡萄糖异构化为6-磷酸葡萄糖；和(c)从至少部分6-磷酸葡萄糖形成氢。有利地，所述方法可以在低温至中等温度进行，例如10。C-100。C之间。在一些实施方案中，不添加外部化学能源(多糖除外)，向所述系统添加的唯一能量是热。即，通常，总反应是弱的吸热反应，因此需要少量的热输入。例如，添加的热能可以从燃料电池获得。优选地，考虑到温度是在特定系统中的底物浓度、反应净热和热损失的函数，将所述系统维持在恒温。在实施方案中，所述方法包括将反应加热至约10。C-约100。C之间。根据本发明，所述方法的氢产率典型地为至少10摩尔氢/摩尔包含于起始多糖中的脱水葡萄糖单元。在优选的实施方案中，氢的产率是约或至少ll，约或至少11.5,约或至少11.6，约或至少11.7,约或至少11.8，或者约或至少11.9摩尔氢/摩尔包含于起始多糖中的脱水葡萄糖单元。在特别优选的实施方案中，氢的产率是12摩尔H2/摩尔多糖中的脱水葡萄糖单元，相当于100%的理论产量。在本发明过程期间氢产生的最大速率不受限制。但是，其优选至少O.l，至少0.2，至少0.4，至少0.6,至少0.8或者至少1.0(或者更高)mmol/L/hr。在另一个方面，本发明提供用于在体外从多糖有效产生氢的组合物。通常，所述组合物包括(a)至少一种多糖；(b)水；(c)至少一种酶，所述酶能够催化多糖向6-磷酸葡萄糖的转化，6-磷酸葡萄糖向6-磷酸葡萄糖酸(6-phsphogluconate)的转化，以及6-磷酸葡萄糖酸向5-磷酸核酮糖的转化；(d)至少一种酶，所述酶能够将NADP+和6-磷酸葡萄糖和/或NADP+和6-磷酸葡萄12糖酸转化为NADPH和质子；和(e)至少一种酶，所述酶能够催化NADPH和质子向氢的转化。在优选的实施方案中，所述组合物还包括多种能够催化戊糖磷酸途径的部分或者全部步骤的酶。在某些实施方案中，所述组合物包括下列酶(通过EC编号表征)(i)与EC2.4.1.1具有至少80%，优选至少90%,更优选至少95%同一性的酶；(ii)与EC5.4.2.2具有至少80%，优选至少90%,更优选至少95%同一性的酶；(iii)与ECL1.1.49具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%同一性的酶；(iv)与EC1.1.1.44具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%同一性的酶；(v)与EC5.3.1.6具有至少80%,优选至少90%，更优选至少95%同一'I"生的酶；(vi)与EC5丄3.1具有至少80%，优选至少90%,更优选至少95%同一性的酶；(vii)与EC2.2.1.1具有至少80%，优选至少90%，更优选至少95%同一性的酶；(viii)与EC2.2.1.2具有至少80%，优选至少90%,更优选至少95%同一性的酶；(ix)与EC5.3.1.1具有至少80%，优选至少90%,更优选至少95%同一'性的酶；(x)与EC4.1.2.13具有至少80%,优选至少90%，更优选至少95%同一性的酶；(xi)与EC3.1.3.1l具有至少80%,优选至少90%，更优选至少95%同一性的酶；(xii)与EC5.3.1.9具有至少80%,优选至少90%,更优选的少95%同一性的酶；和(xiii)与EC1.12.1.3具有至少80%,优选的至少90%，更优选的至少95%同一性的酶。在优选的方法和组合物实施方案中，没有水解酶的存在。在另一方面，本发明提供从一种以上多糖生产氢的试剂盒。通常，本发明的试剂盒包括一个以上容器，各自独立地包含一种以上以下物质(a)—种以上能够磷酸化多糖的葡聚糖单元的酶；(b)—种以上能够将l-磷酸葡萄糖异构化为6-磷酸葡萄糖的酶；(c)一种以上能够从6-磷酸葡萄糖、6-磷酸葡萄糖酸或者这两者的氧化产生分子氢的酶。在实施方案中，所述试剂盒包括6-磷酸葡萄糖脱氬酶，6-磷酸葡糖酸盐脱氬酶，或者这两者。在实施方案中，所述试剂盒包括一种以上磷酸化酶，一种以上葡糖磷酸变位酶，以及一种以上氢化酶。本发明试剂盒还可以包含如上所述的酶纟且合物。本发明试剂盒还可以提供实施本发明方法(即，从生物质产生氢)需要的部分或者全部供给。因此所述试剂盒可以包含酶、缓冲液、溶剂、容器(例如，一个以上用于收集或者利用从本发明反应方法和系统析出的一些或者全部氢气)。图l描述根据本发明的用于将多糖和水转化为氢和二氧化碳的合成代谢途径。图2显示描述用于通过本发明方法和系统产生并监控H2生产的系统的示意图。图3显示在根据本发明方法中来自2mM淀粉的体积氢生成速率(mmolH2/L/M、时)。具体实施例方式下列说明提供关于本发明系统、方法、组合物和试剂盒的某些实施方案和特征的详细论述。它不是旨在穷举所有这类实施方案和特征，而是提出以让读者更好的理解所选择的示例性实施方案和特征。为了让读者更好的理解本发明，现在定义和/或讨论某些术语。此处未描述或者定义的术语应纟皮理解为按照本领域它们正常和习惯性的方式使用。关于"多糖"其表示任何比单体大的葡聚糖单元的低聚物或14者聚合物。多糖因此可以与"低聚糖"、"葡聚糖"、"糖低聚物"和"糖聚合物"互换使用。多糖可以包括(但不限于)淀粉、纤维素、半纤维素、果胶、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、p_i，4-葡聚糖、|3-1,3-葡聚糖、P-l,6-葡聚糖、a-l，4-葡聚糖、a-l，6-葡聚糖或者任何其他通过糖苷键连接的单体糖单元的低聚物。还可以使用任意数量多糖的混合物，并且这类混合物也包括在术语"多糖"中。如此处所用，"酶"是催化(即，加速)化学和生化反应的蛋白催化剂。如此处所用，，"酶"旨在包括单个酶、包括一种以上酶的混合物或者酶配合物。如此处所用，"酶单位，，(或者"单位")定义为每分钟催化l微摩尔(pm)底物转化的酶的量。用于定义酶单位的目的的条件是温度为30。C,以及产生最大底物转化率的pH值和底物浓度。酶委员会编号(EnzymeCommissionnumber)(EC编号)是基于酶催化的化学反应对酶的数字分类法。为了本发明的目的，也使用EC编号指定酶。当此处酶用EC编号表征时，应当理解可以有来自不同来源或者生物体的多种酶，所述酶均催化相同的反应。本发明不限于任何特定的酶或者酶的来源，而是途径中的特定酶催化反应，这将如下文所述。例如术语"用EC2.4.1.1表征的酶"是指至本申请提交日为止，根据至少一个本领域公认的酶信息系统(例如BRENDA或者KEGG)具有EC编号2.4.1.1的任何氨基酸序列。本领域已知，两种酶之间的"同一性"通过比4交一种酶的氨基酸序列与第二种酶的序列来确定。可以通过本领域公知的程序，例如利用BLAST(国家生物技术信息中心的BasicLocalAlignmentSearchTool)来确定同一性。当酶的同一性与酶EC编号一起叙述时，根据本说明，它应被理解为有许多不同的都具有相同的EC编号的氨基酸序列。因此，例如术语"与EC2.4.1.1具有至少90%同一性的酶，，是指至本申请提交日为止，根据计算与至少一个本领域公认的酶信息系统(例如BRENDA或者KEGG)的EC编号为2.4.1.1的至少一种氨基酸序列具有90%或者更高序列同一性的氨基酸序列。除非另外指出，用于说明书和权利要求中的所有表达组分浓度、反应条件、化学计算法等等的数字应被理解为在所有情况下都可以被术语"约"修饰，其表示该指定的值包括所有高于或者低于所述值5%和/或在获得所述值的方法固有的误差水平内的值。因此，除非相反的指明，在下面说明书和附属权利要求中提出的数字参数是近似值，该值可能至少根据特定的分析技术而改变。尽可能精确地报告提出的数值。但是，任何数值固有地包含由在它们各自试验测量中发现的标准偏差引起的一定的误差。在所述方法某些实施方案的典型酶使用以及本发明系统、组合物和试剂盒实施方案的使用中，本发明通过下列总(净)反应将可用葡聚糖重复单元-C6HK)Os-表示的多糖(可用葡聚糖重复单元-C6HK)05-表示)酶促地转化为氢和二氧化碳-C6H10O5-(s)+7H20(1)—12H2(g)+6C02(g)[Eq.la]注意5摩尔H2产自葡聚糖重复单元，而另夕卜7摩尔H2来自反应的水。标记(s)、(l)和(g)表示化学物质分别处于固相、液相和气相。应理解根据选择的特定多糖以及温度和其他条件，典型地将多糖悬浮于、基本溶解于或者完全溶于液相。图l显示包括13个可逆酶促反应的合成酶途径a)由磷酸化酶催化的链缩短磷酸化反应产生l-磷酸葡萄糖(Eq.2);b)通过葡糖磷酸变位酶催化l-磷酸葡萄糖(G-l-P)转化为6-磷酸葡萄糖(G-6-P)(Eq.3);c)包含10种酶的戊糖磷酸途径(Eq.4);和d)由氢化酶催化的从NADPH产生氢(Eq.5)。(C6H10O5)n+H20+Pih(C6H^05)n-卄G画1國P[Eq.2]G画l-P<■>G-6-P[Eq.3]G-6-P+12NADP++6H20"12NADPH+12H++6C02+Pi[Eq.4]12NADPH+12H+"12H2+12NADP+[Eq.5]在实施方案中，本发明的酶途径包括3个主要部分(a)(1)由磷酸化酶催化的多糖链缩短磷酸化，然后是(a)(2)由葡糖磷酸变位酶催化的从l-磷酸葡萄糖至6-磷酸葡萄糖的转化；(b)戊糖磷酸途径，包括氧化阶段，其将G-6-P转化为核酮糖-5-P、C02和NADHP;和非氧化阶段，其可将核酮糖-5-P再生为G-6-P;和(c)由氢化酶催化的乂人NADPH产生氢。通过葡聚糖磷酸化酶的链缩短和从G-1-P向G-6-P的转化的組合能够利用储存于多糖糖苷键中的能量。相反，多糖糖苷键的常规水解耗散了这种能量。因为可以同时从液体溶液中去除气态反应产物(H2和C02),所述反应可以被有效的驱动向产生氢的方向进行，而在并发反应途径中多糖链;波同时缩短。通常，总反应可以写作(葡聚糖)n+aH20—(葡聚糖)w+bH2+cC02[Eq.lb]其中系数b定义了从起始多糖获得的氢产量。热力学上，Eq.l表示的反应是自发过程(AG。=-48.9kJ/mol)，并且是吸热反应(AH。=595.6kJ/mol)(AtkinsandDePaula,2005)。当从液体反应溶液中连续去除气体产物(H2和C02)时，根据勒夏特列原理(LeChatelier'sprinciple),总反应(Eq.1)(正向)变得有利。因此，优选当形成气体产物时去除至少一种气体产物；尤其优选以两种产物(H2和C02)形成的相同速率去除它们，以避免聚积并有利于多糖的完全转化。更多消耗的水(Eq.113中&〉7)不会产生更多的氢，反而会趋于引起常见的葡聚糖水解，产生更短的链，伴随能量耗散入溶液。多糖链缩短底物的磷酸化(Eq.2)利用储存于多糖糖苷键中的能量(15.5kJ/mol糖苷键)以产生活化的磷酸化单糖(G-l-P)而不消耗ATP。实质上，将储存于多糖的能量传递到水分子以将它们打断并以氢的形式释放能量。通过利用基本上不含水解酶(例如，用于淀粉的淀粉酶，或者用于纤维素的纤维素酶)的溶液，即使存在过量的水，多糖水解也可最小化。因此，在本发明优选的实施方案中，液体溶液不包含显著量的活性水解酶。两个糖香单元之间的任意糖苷键均包含化学键能。多糖和低聚糖的糖苷键的简单水解耗散糖苷键的键能。实质上，磷酸化酶可以通过底物磷酸化储存能量。磷酸化酶是催化l-磷酸葡萄糖产生的变构酶。更通常地，磷酸化酶是催化来自无机磷酸盐的磷酸基添加到受体的酶。磷酸化酶包括EC2.4.1.1(1，4-a-葡聚糖磷酸化酶，a-葡聚糖磷酸化酶，支链淀粉磷酸化酶，淀粉磷酸化酶，葡聚糖磷酸化酶(glucanphosphorylase),葡聚糖磷酸化酶(glucosanphosphorylase),糖原磷酸化酶，麦芽糖糊精磷酸化酶)；EC2.4.1.8(麦芽糖磷酸化酶)；EC2.4.1.20(纤维二糖磷酸化酶)；EC2.4.1.49(纤维糊精磷酸化酶)；和EC2.4.1.7(蔗糖磷酸化酶)。有效的磷酸化酶还可以选自与该^殳落描述的酶具有至少80%同一性，<尤选至少90%同一性的酶。对于包含a-1，4-糖苷4建的底物，例如淀粉，磷酸化反应如下(1，4-a隱D-葡糖基)n+Pi+H20—(1，4-a-D-葡糖基)n.i+G-1國P麦芽糖+Pi+H20—葡萄糖+G-1-P对于包含(3-l，4-糖苷键的底物，例如纤维素，磷酸化反应如下(1，4-P-D-葡萄糖基)n+Pi+H20—(1，4-P-D-葡萄糖基)n-i+G-1画P纤维二糖+Pi+H20—G-l-P+葡萄糖在一系列由磷酸化酶介导的磷酸解反应后，可逆地产生大量的G-1-P。G-l-P的去除将导致链缩短反应。葡糖磷酸变位酶是一种通过改变磷酸根离子的位置，在G-1-P和G-6-P之间进行转化的产生葡萄糖异构体的酶。葡糖磷酸变位酶的一个实例是用EC5.4.2.2表征的酶，或者与该酶具有至少80%同一性，优选至少90%同一性的酶。氢化酶是催化分子氢(H2)可逆氧化的酶。氢化酶在厌氧代谢中起着重要作用。氢吸收(H2氧化)与电子受体例如氧、硝酸盐、硫酸盐、二氧化碳和富马酸的还原有关，而质子还原(H2析出)在丙酮酸盐发酵方面以及在多余电子的清除方面非常重要。氢化酶可以按照下列反应从NADPH产生氢气NADPH+H+—NADP++H2氢化酶的一个实例是用EC1.12.1.3表4i的酶，或者与该酶具有至少80%同一性，优选至少90%同一性的酶。本发明的一些实施方案使用从超嗜热古细菌尸Fococcws/w/c^w分离的氩化酶(BryantandAdams,1989;MaandAdams,1994;Maetal.，1994;Ped醒ietal"1995;Maetal"2000)。尽管NADPH还原反应不是自发驱动的，但是特殊的尸;;racoccz^/wWosw氢化酶l可以在体外催化NADPH还原以产生氢。戊糖磷酸途径由将G-6-P转化为核酮糖-5-P的氧化阶段和将从核酮糖-6-P再生G-6-P非氧化阶段组成G-6-P+2NADP++H20—核酮糖-5-P+2H++C02+2NADPH核酮^f唐-5-P—5/6G-6-P通常，多种活化戊糖磷酸途径的酶的选择属于普通技术人员的技能。在实施例l中(参见表l)描述了一种特定的实施方式。其他实施方式使用相似的酶，例如与表1所列的戊糖磷酸途径酶(EC编号l.1.1.49,1.1.1,44,5.3.1.6，5.1.3.1,2.2.1.1,2.2.1.2，5.3.1.1,4.1.2.13，3.1.3.11和5.3.1.9)具有至少80%,优选至少90%序列同一性的酶。在一些实施方案中，直接向多糖水溶液中添加酶。要添加的酶量依赖于所期望的反应温度和停留时间。通常每种特定的酶都有一个浓度，在该浓度之上在反应速率方面不发生进一步的增加。根据整体经济性确定最佳酶量。可以将酶纯化(但纯化不是必须的)，并且它们可以以具有所期望功能的酶的混合物或者酶配合物的形式存在。可以以裂解细胞的形式添加酶，所述裂解细胞在先前的发酵过程中产生酶。在这种情况下，还存在向反应器中加入的细胞片段。在一些实施方案中，无机磷酸盐(Pi)和辅酶(NADPH)在系统中连续地循环。即，这些物质以相同的速率^皮产生和消耗。如果需要，在所述方法开始时可以添加少量无机磷酸盐以引发磷酸化。同样，如果需要(由于副反应或者其他原因)，在所述方法中的任一点都可以添力口额外的Pi和/或NADPH。不认为溶液的pH是特别重要的，但pH可能以潜在不同方式影响每种酶的活性。还注意到在本发明途径中产生H2的反应消耗质子，而质子的浓度受溶液pH的控制。指定特定选择的酶，根据H2产量或者生产速率，本领域普通技术人员可以轻易地进行常规实验来确定系统最适pH，或者确定优选的pH值范围。换言之，本发明方法可以包括在反应期间调节一种以上参数以保持参数或者最优化参数。对于一些实施方案优选的pH值示例性范围是pH二2-12,更优选4-9,和最优选中性pH,例如pH6-8。不认为温度对本发明非常重要。尤其当选择嗜中温的酶时，低至中等温度是合适的。通常可以在约10。C至约100。C,优选约2025。C至约75。C的一个以上温度下方便地实施本方法。选择的每种酶都具有其自身各自的温度-活性函数，并且整体最优化温度将是所选择特定酶的函数。本领域技术人员将意识到甚至可以使用10。C-100。C以外的温度，例如当选择嗜热或者嗜冷的酶时。在一些实施方案中，不添加外部能量，而温度将成为底物浓度、反应净热和系统热损失的函数。压力对于本发明来说也不重要，但技术人员将承认反应压力可以影响物质的平衡分布。高压例如数个大气压将趋于抑制气体产物析出。相反地，低的系统压力将趋于推动平衡移向产物(氢和二氧化碳)。为了方便起见，优选在大气压下进行反应。所述方法可以在真空下进行。同样，可以在除产生或者消耗的气体之外的气体，例如空气、氮、氦、氩等的存在下进行所述方法。所述方法可以在间歇反应器、连续反应器或者上述两者的一些组合中进行。可以使用各种搅拌(混合)方式，或者不含内混合的活塞流反应器也是有效的。本领域已知，可以将未转化的反应物(多糖)循环至反应器进口。根据Eq.lb[(葡聚糖)n+aH20^(葡聚糖)^+bH2+cC02],本领域普通技术人员将理解可以优化所述方法，而无需过度实验，这样在整体基础上系数a可以是约7，b可以是约12,和c可以是约6。在一些实施方案中，确实发生一些副反应，降低了H2的产率。在其他实施方案中，对H2的氢原子选择性非常高(至少约90%)，但多糖未完全转化为产物，导致较低的产率。有时经济性规定以稍微低于其可获得的最高产率来运行本方法。还可以进行优化以提高总反应速率和部分或者全部酶的稳定性。这种优化可以包括，例如，通过代谢工程和建才莫的酶组分优化；用重组的嗜热或者甚至超嗜热的酶代替嗜中温的酶；蛋白工程化以提高酶活性和/或选择性；更高浓度的酶和底物；方法参数例如pH和温度的改变；通过添加剂稳定酶；酶固定；开发最小微生物以建立产生H2的体内酶系统。进行这种优化属于酶领域普通技术人员的技能，本发明旨在包括这类实验。可以使用统计学实验设计来探究整体的响应面(globalresponsesurface),并建立Hs产率和速率相对于方法和酶因素的才莫型以及相互作用。如上所述，本发明的一个方面是用于实施本发明所述方法的试剂盒。通常，所述试剂盒是用于产生和收集氢气的试剂盒。本发明的试剂盒包括为实施本发明方法的一个以上实施方案所必需的部分或者全部组分。因此，本发明的试剂盒可以包括一种以上以下物质(a)—种以上具有部分磷酸化酶活性的酶；(b)—种以上具有部分葡糖磷酸变位酶活性的酶；(c)一种以上具有部分氢化酶活性的酶；(d)用于使多糖、水以及来自要素(a)、(b)和(c)的酶组合的容器；(e)用于将所述容器加热到约10至100。C的装置；和(f)收集或者利用从所述容器析出的部分氬气的装置。本发明试剂盒还可以包含如上所述的酶组合物。可将酶、试剂和添加剂(如果需要)和其他组分设置在所述试剂盒内的一个以上的合适容器中。所述试剂盒可以包括足够的组分以单次或者多次实施本发明方法。可以由任意合适的材料，例例如塑料、玻璃和金属制造试剂盒。氢具有许多潜在用途。可以将分子氲用于氨的生产；石油精炼，其中在典型的精炼过程中自始至终使用H2;化学合成工业，当需要碳-碳双键转化成碳-碳单键或者将碳-碳三键转化成单键或者双键时；用于植物油氢化的食品工业；以及电子线路制造。现在还将氢广泛用于制造曱醇、肥料、玻璃、精炼金属、维生素、化妆品、肥皂、润滑剂和清洁剂。此外，纯氢在传统的燃烧引擎和在燃料电池中均是优良的燃料，并且用氧气氧化时，其只产生水汽。液态氢还可以用作燃料，例如用于空间飞行器。可以从其他物质(例如，二氧化碳)完全或者部分地分离由本发明方法产生的氢，或者所述氢可以与其他物质联用。当需要从H2中分离至少部分C02时，各种分离技术是已知的。一种此类技术使用分子篩分离。例如还可以使用低温蒸馏从H2分离C02。如本领域已知，直接使用H2/C02混合物的实例是利用醋酸梭菌(C/oWnWz'wm"ce"cwm)从H2和(302产生乙酸盐。其他生物化学地或者化学地转化各种浓度的H2/CO2混合物的方法也是已知的。实施例现在将参考下列非限制性的实施例进一步表征和描述本发明，其仅仅旨在说明本发明，而不应被理解为以任何方式限制本发明。总之，下列段落将描述证明本发明实施方案的说明性的酶选纟奪和实验步骤。实施例1:从淀粉和水酶法生产H2和C02为了举例说明本方法、系统和组合物的实际性质，以根据本发明的方法将淀粉转化为氢和二氧化碳。在装备有用冰冷却的除潮器的连续流式系统中进行实验。除非另作说明，所有化学制剂和酶均购自Sigma-AldrichCo.(U.S.A.)。在表l中列出了所有的酶和它们的催化反应。常规反应器的工作体积是2mL。用氦以50mL/min的流速的连续地将所述系统净化。利用Polyscience(Niles，IL)循环式水浴锅将加套反应器的温度维持在30。C。表l:酶和催化反应<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>图2显示说明本发明氢电池系统的图，将其如此设计利用基于FigaroTGS822的传感器监控112，并利用改良的Hersh原电池监控02。在反应池和电解池之间连接有C02分析器(未显示)。在气流中监控氧以及氢和二氧化碳。利用FigaroTGS822氧化锡传感器测量氢析出，所述传感器通过桥式放大器与KeithleyModel2000万用表(KeithleyInstruments,Cleveland,OH)连4妻。利用与Keithley自变换量程皮安计连接的改良Hersh原电池监控氧浓度，所述原电池利用24%KOH作为电解质。利用与Keithley2000万用表连接的LI-CORC02AnalyzerModelLI-6252测量二氧化碳的产生。万用表和皮安计通过IEEE488通用接口板与电脑连接。按照电化学等价的法拉第定律，利用与串联电解池连接的Keithley220可编程电源进行用于标定氢和氧的电解。利用分析气体混合物进行用于二氧化碳的标定，所述混合物包括在氦中的735ppm二氧化碳和1000ppm氧(AirLiquideAmericaCorp.,Houston,TX)。利用ASYST4.0專欠4牛(ASYSTTechnologies,Inc.,Rochester,NY)进行数据收集和分析。如下所示计算氢(YH》和二氧化碳(Yc。2)的综合摩尔/摩尔产率<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>其中fH2和rco2是每小时每升反应体积以毫摩计的H2或者C02的体积产生速率，△GE是以mM计的葡萄糖当量的净消耗。可以利用Sigma葡萄糖HK试剂盒测量剩余的G-6-P。将混合物在35。C下孵育5分钟，测定340nm处吸光度的变化。通过添加稀H2S04并在12rC下水解l小时，将剩余的淀粉、G-l-P和G-6-P水解成葡萄糖。利用葡萄糖HK试剂盒测量中和的葡萄糖溶液。溶液包含在2.0mL0.1MHEPES緩冲液(pH7.5)中的l单位的各戊糖磷酸循环酶，约70单位的P.furiosus氩化酶，10单位的a-葡聚糖磷酸化酶，10单位的葡糖磷酸变位酶，4mM磷酸盐，0.5mM硫胺素焦磷酸，2mMNADP+，10mMMgCl2和0.5mMMnCl2。实验在大约30。C进行。图3显示来自2mM淀粉的体积氢产生速率(mmolH2/L/hr)。氢和C02的综合产率(mol/mol)分别是5.19112/葡聚糖单位和5.37C02/葡聚糖单元。来自淀粉的氢和C02产率大约是理论产率的43%和86%。一般认为氢产率的降低主要是由于不完全转化，和代谢产物例如NADPH的可能的积聚。尽管此处已经详细地描述了示意性实施方案及其各种改进，但本领域技术人员将理解本申请不需要限于这些精确的实施方案和所描述的改进，在不脱离所附权利要求限定的本发明范围或者精神的条件下还可以进行各种变化和进一步的改进。其他实施方案对本领域普通技术人员来说是显而易见的，包括未提供此处阐述的全部特征和优点的实施方案。参考文献AlperJ.，Science2003，299:1686-1687.AtkinsP.W.,PhysicalChemistry(fourthedition).NewYork:W.H.Freeman&Co.;1990.AtkinsP.W.andDePaulaJ.ElementsofPhysicalChemistry(4thedition).NewYork:W.H.Freeman&Co.(2005)，605-613.Benemannetal"Proc.Nat.Aead.ScLUSA70:2317，1973.BergJ.M.etal"Biochemistry(fifthedition).NewYork:W.H.Freeman&Co.;2002.BryantF,O.andAdamsM.W.W，J.Biol.Chem.1989，264:5070-5079.CortrightR.D.etal"Nature2002，418:964-967.DelugaG.A.etal"Science2004，303:993-997.FarrellA.E.etal.,Science2006，311:506-508.HoffertM丄etal.，Science2002，298:981-987.HuberG.W.etal"Science2003，300:2075-2077.KleinandBetz，PlantPhysiol.61:953,1978.LyndL.R.etal"Microbiol,Mol.Biol.Rev.2002，66:506-577.LyndL.R.etal"Curr.Opin.Biotechnol.2005,16:577-583.LyndL.R.etal.，inCellulosome.EditedbyKataevaIA:NovaSciencePublishers,Inc.;2006.MaK.andAdamsM.W.，J.Bacteriol.1994,176:6509-6517.MaK.etal,，FEMSMicrobiol.Lett.1994，122:245-250.MaK.etal"J.Bacteriol.2000,182:1864-1871.Markovetal.，AdvancesinBiochemicalEngineeringandBiotechnology52:60，1995.MorrisD.，J.Sci.FoodAgric.86:1743-1746(2006).MuirM.etal"J.Bacteriol.1985，163:1237-1242.NelsonD.L.andCoxM.M.，LehningerPrinciplesofBiochemistry(thirdedition).NewYork:WorthPublishers;2000.PedroniP.etal"Microbiol.1995，141:449-458.Raoetal"Biochimie60:291，1978.RosenandKrasna,Photochem.Photobiol.31:259，1980.UnitedStatesDepartmentofEnergy:"BasicResearchNeedsfortheHydrogenEconomy"(2004)publishedathttp:〃www.sc.doe.gov/bes/hydrogen.pdf.VatsalaandSeshadH,Proc.IndianNat'lScLAcad.B51:282,1985.WoodwardJ.etal"Nat.Biotechnol.1996，14:872-874.WoodwardJ.etal"Nature2000，405:1014-1015.WoodwardJ.etal"EnergyFuels2000,14:197-201.ZhangY.-H.P.andLyndL.R.,Appl.Environ.Microbiol.2004，70:1563-1569.ZhangY.-H.P.andLyndL.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2005,102:7321-7325.ZhangY.-H.P.andLyndL.R.，Appl.Microbiol.Biotechnol.2006，70:123-129，权利要求1.一种从多糖生产氢的体外无细胞方法，所述方法包括通过将至少一个葡聚糖单元转化为5-磷酸核酮糖来减少多糖的葡聚糖单元数量；和从将葡聚糖单元转化为5-磷酸核酮糖中产生氢。2.根据权利要求l所述的方法，其中将至少一个葡聚糖单元转化为5-磷酸核酮糖包括将葡聚糖单元酶促地转化为1-磷酸葡萄糖；将1-磷酸葡萄糖酶促地转化为6-磷酸葡萄糖；将6-磷酸葡萄糖酶促地转化为6-磷酸葡萄糖酸；和将6-磷酸葡萄糖酸酶促地转化为5-磷酸核酮糖。3.根据权利要求2所述的方法，其中氢的产生与6-磷酸葡萄糖向5-磷酸核酮糖的转化酶偶联。4.根据权利要求2所述的方法，进一步包括将5-磷酸核酮糖转化为一种以上反应产物。5.根据权利要求l所述的方法，其中通过氢化酶产生氢。6.根据权利要求l所述的方法，其中所有步骤在单个反应容器中进行。7.根据权利要求l所述的方法，其中所述多糖包括淀粉。8.根据权利要求l所述的方法，其中所述多糖包括纤维素。9.根据权利要求l所述的方法，其中所述多糖包括半纤维素。10.根据权利要求l所述的方法，其中所述多糖不是淀粉或者纤维素。11.根据权利要求l所述的方法，进一步包括至少部分地将所述氢从所述方法产生的二氧化碳中分离。12.根据权利要求ll所述的方法，进一步包括进给至少部分氢至燃料电池中。13.根据权利要求l所述的方法，进一步包括从氢发电。14.根据权利要求l所述的方法，其中氢的产率为至少IO摩尔氩/摩尔包含于起始多糖中的脱水葡萄糖单元。15.根据权利要求l所述的方法，其中氢产生的最大速率是至少0.4mmol/L/hr。16.根据权利要求l所述的方法，其中所述方法包括(a)提供包括多糖和水的混合物；(b)提供一种以上具有磷酸化酶活性的酶；(c)将至少部分多糖磷酸化以产生1-磷酸葡萄糖和缩短的多糖；(d)提供一种以上具有葡糖磷酸变位酶活性的酶；(e)将在步骤(c)中产生的至少部分l-磷酸葡萄糖异构化为6-磷酸葡萄糖；(f)提供多种有效催化戊糖磷酸途径步骤的酶；(g)提供一种以上具有部分氢化酶活性的酶；和(h)从至少部分在步骤(e)中产生的6-磷酸葡萄糖形成氢。17.—种用于在体外从多糖有效生产氢的组合物，所述组合物包括(a)多糖；(b)水；(c)能够催化多糖向6-磷酸葡萄糖转化的一种或多种酶；(d)能够催化NADPH和质子向氢转化的一种或多种酶；和(e)多种能够催化戊糖磷酸途径步骤的酶。18.—种用于从多糖生产氢的试剂盒，所述试剂盒包括(a)—种以上具有磷酸化酶活性的酶；(b)—种以上具有葡糖磷酸变位酶活性的酶；(c)一种以上具有氢化酶活性的酶；(d)用于使多糖、水以及来自要素(a)、(b)和(c)的酶组合的谷為，(e)用于将所述容器加热到10。C-100。C之间的装置；和(f)用于收集或者利用从所述容器析出的部分或者全部氢气的装置。19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中氢的产率为至少10摩尔氢/摩尔包含于起始多糖中的脱水葡萄糖单元。20.根据权利要求18所述的试剂盒，进一步包括用于从氢气发电的装置。全文摘要本发明包括一种体外酶法，该方法在温和条件下只利用酶和水将可再生多糖有效地转化成高产率的氢。该方法包括多种酶(1)磷酸化酶，(2)葡糖磷酸变位酶，(3)氢化酶和(4)参与戊糖磷酸途径的酶。该方法的优选实施方案只产生净产物氢和二氧化碳，即是从低成本原料以非常大的量产生氢的廉价方法。文档编号C07H1/06GK101490071SQ200780026279公开日2009年7月22日申请日期2007年5月12日优先权日2006年5月12日发明者乔纳森·米埃伦斯,珀西瓦尔·毅恒·张申请人:弗吉尼亚暨州立大学知识产权公司