专利名称：一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测氢化酶活性的方法。
背景技术：
发酵法生物制氢技术主要是利用厌氧活性污泥发酵高浓度有机废水产生 大量氢气，测定微生物产氢代谢活性通常需要多项指标的综合考察，如测定总 产气量、气体成分分析、活性污泥的比产气氢速率等。活性污泥中的氢化酶是 一类存在于微生物体内的重要生物酶，根据氢化酶的催化功能可分为三类产 氢氢化酶、'耗氢氢化酶、双向性氢化酶，其中产氢氢化酶可以直观反映发酵生 物制氢系统中活性污泥的产氢活性。但是目前测定产氢氢化酶活性的方法普遍 存在检测灵敏度低的问题，待检测样品需要采用超声波进行前处理，易造成氢 化酶失活，导致检测的结果准确性差，且产氢氢化酶活性的检测过程需要在严 格的厌氧条件下进行，操作过程复杂；在测定产氢氢化酶活性的方法中普遍使 用的电子载体是有毒的甲基紫精，危害检测人员的身体健康，安全性差。
发明内容
本发明为了解决现有产氢氢化酶活性检测方法存在的灵敏度低，检测结果 准确性差，操作复杂以及安全性差的问题，而提供了一种检测厌氧活性污泥中 产氢氢化酶活性的方法。
本发明检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法按照以下步骤进行
一、预处理将活性污泥放入到厌氧管中，然后向厌氧管中依次加入磷酸盐缓 冲液、溶菌酶、二溴乙垸磺酸钠和铁粉，再向厌氧管中充N2后密封，其中每
lmL的活性污泥需要加入0.6mL、 pH值为7.3~7.7的磷酸盐缓冲液、lOOpL的 溶菌酶、0.2mL的质量浓度为2g/L的二溴乙烷磺酸钠和0.04mg的铁粉；二、 恒温培养将步骤一的厌氧管放置在36 45t:的水浴条件下培养30 50min; 三、加入电子载体将甘氨酸或者二甲基亚砜作为电子载体加入到步骤二培养后的厌氧管中，其中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL、质量浓度为10g/L 的甘氨酸或者加入0.2mL、质量浓度为0.25%的二甲基亚砜；四、预热处理 将步骤三中加入电子载体的厌氧管放置在38 42'C的恒温振荡水浴中预热处 理18 25min;五、酶反应向步骤四预热处理后的厌氧管中加入硫代硫酸钠 和硫化钠溶液在室温条件下酶促反应8 12min，其中每lmL的活性污泥需要 加入O.lmL、质量浓度为40g/L的硫代硫酸钠和0.1mL、质量浓度为40g/L的 硫化钠；六、终止反应向步骤五的厌氧管中加入三氯乙酸溶液终止反应，其 中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL、质量浓度为10%三氯乙酸溶液；七、
吸取步骤六厌氧管中的气体进行气相色谱分析，记录氢气百分含量，按照公式
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泥的氢化酶活性，B表示氢气百分含量，V表示从步骤五厌氧管中的气体体积， W表示步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量，即每lmL活性污泥含有的 挥发性悬浮固体的质量，t表示步骤五中酶反应时间。
本发明检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法优点如下
1、 本发明检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法操作简单，准确性 好。本发明方法以价格低廉且反应条件温和的溶菌酶对样品进行预处理，本发 明主要针对的是产氢系统的氢化酶，非产甲垸菌群占优势，因此在本发明的检 测方法加入了二溴乙垸磺酸钠作为产甲垸菌的抑制剂，以去除产甲垸菌氢化酶 活性，提高发酵生物制氢系统厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性检测的准确性。 本发明方法与现有的氢化酶活性检测方法相比较不需要进行超声波前处理，不 存在酶失活的情况，不需要在厌氧条件下进行，检测方法操作简单，准确性好。
2、 本发明检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法灵敏度好，本发明 检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性时加入金属元素，提高了检测的灵敏度， 又以微毒的二甲基亚砜或无毒的甘氨酸作为电子载体，检测范围大，与现有的
5甲基紫精做电子载体的方法相比，本发明的检测方法灵敏度提高了 30%以上，
灵敏度好。
3、本发明检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法安全性好。本发明 方法以无毒的甘氨酸或微毒的二甲基亚砜作为电子载体，安全性好。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法 按照以下步骤进行 一、预处理将活性污泥放入到厌氧管中，然后向厌氧管 中依次加入磷酸盐缓冲液、溶菌酶、二溴乙烷磺酸钠和铁粉，再向厌氧管中充 N2后密封，其中每lmL的活性污泥需要加入0.6mL、 pH值为7.3~7.7的磷酸 盐缓冲液、lOOiuL的溶菌酶、0.2mL的质量浓度为2g/L的二溴乙烷磺酸钠和 0.04mg的铁粉；二、恒温培养将步骤一的厌氧管放置在36 45"C的水浴条件 下培养30 50min;三、加入电子载体将甘氨酸或者二甲基亚砜作为电子载 体加入到步骤二培养后的厌氧管中，其中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL、 质量浓度为10g/L的甘氨酸或者加入0.2mL、质量浓度为0.25%的二甲基亚砜； 四、预热处理将步骤三中加入电子载体的厌氧管放置在38 42'C的恒温振荡 水浴中预热处理18 25min;五、酶反应向步骤四预热处理后的厌氧管中加 入硫代硫酸钠和硫化钠溶液在室温条件下酶促反应8 12min，其中每lmL的 活性污泥需要加入O.lmL、质量浓度为40g/L的硫代硫酸钠和0.1mL、质量浓 度为40g/L的硫化钠；六、终止反应向步骤五的厌氧管中加入三氯乙酸溶液 终止反应，其中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL、质量浓度为10%三氯乙 酸溶液；七、吸取步骤六厌氧管中的气体进行气相色谱分析，记录氢气百分含
量，按照公式UI-^;;^^求出厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性，其中UI表
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示厌氧活性污泥的氢化酶活性，B表示氢气百分含量，V表示从步骤五厌氧管中的气体体积，W表示步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量，即每lmL 活性污泥含有的挥发性悬浮固体的质量，t表示步骤五中酶反应时间。
本实施方式取一定体积步骤一所用的活性污泥，将活性污泥用滤纸过滤， 滤纸截留下的滤渣放到105'C烘箱烘干至恒重，所得重量为悬浮固体，把悬浮 固体在马弗炉灼烧，即所失去的重量为挥发性悬浮固体的质量，按照W:M/V, 计算得到活性污泥的生物量，其中Vi表示活性污泥的体积，M表示挥发性悬 浮固体的质量，W表示本实施方式步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量。
本实施方式检测出的厌氧活性污泥中产氢氢化酶活力为 12.6 30.7fxmol/g.min。
具体实施方式
二:本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中每lmL 的活性污泥需要加入0.6mL、 pH值为7.4 7.6的磷酸盐缓冲液。其它步骤及参 数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二是在 38 42C的水浴条件下培养35 45min。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二 相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤四是在 39 4(TC的恒温振荡水浴中预热处理19 21min。其它步骤及参数与具体实施方 式三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一、二或者四不同的是步骤 五中在室温条件下酶促反应10min。其它步骤及参数与具体实施方式
一、二或 者四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤七中气相色 谱条件色谱柱为不锈钢填充柱Pompak.Q型，柱长为3m，色谱柱内径为3mm， 柱温为80°C，汽化室温度为80°C，检测室温度为80°C;检测器为热导检测器， 氮气作载气，柱前压力为0.14MPa;气体进样量为500jjlL。其它步骤及参数与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
七本实施方式检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法 按照以下步骤进行 一、预处理将活性污泥加入到厌氧管中，然后向厌氧管 中依次加入磷酸盐缓冲液、溶菌酶、二溴乙垸磺酸钠和铁粉，再向厌氧管中充 10min的N2后密封，其中每lmL的活性污泥需要加入0.6mL、 pH值为7.4的 磷酸盐缓冲液、100pL的溶菌酶、0.2mL的质量浓度为2g/L的二溴乙烷磺酸 钠和0.04mg的铁粉；二、恒温培养将步骤一的厌氧管放置在4(TC的水浴条 件下培养40min;三、加入电子载体将甘氨酸作为电子载体加入到步骤二培 养后的厌氧管中，其中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL的甘氨酸；四、预 热处理将步骤三中加入电子载体的厌氧管放置在4(TC的恒温振荡水浴中预 热处理22min;五、酶反应向步骤四预热处理后的厌氧管中加入硫代硫酸钠 和硫化钠溶液，进行酶促放H2反应10min，其中每lmL的活性污泥需要加入 O.lmL、质量浓度为40g/L的硫代硫酸钠和O.lmL、质量浓度为40g/L的硫化 钠；六、终止反应向步骤五的厌氧管中加入三氯乙酸溶液终止反应，其中每 lmL的活性污泥需要加入0.2mL浓度为10%三氯乙酸溶液；七、吸取步骤六 厌氧管中的气体进行气相色谱分析，记录氢气百分含量，按照公式
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泥的氢化酶活性，B表示氢气百分含量，V表示从步骤五厌氧管中的气体体积，
W表示步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量，即每lmL活性污泥含有的
挥发性悬浮固体的质量，表示步骤五中酶反应时间。
本实施方式使用的是10mL厌氧管，活性污泥的加入量为lmL。 本实施方式取一定体积步骤一所用的活性污泥，将活性污泥用滤纸过滤， 滤纸截留下的滤渣放到105'C烘箱烘干至恒重，所得重量为悬浮固体；把悬浮 固体在马弗炉灼烧，即所失去的重量为挥发性悬浮固体的质量，按照W-M/Vi计算得到活性污泥的生物量，其中Vj表示活性污泥的体积，M表示挥发性悬 浮固体的质量，W表示本实施方式步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量。 本实施方式气相色谱条件色谱柱为不锈钢填充柱Pompak.Q型，柱长为 3m，色谱柱内径为3mm，柱温为80°C，汽化室温度为80°C，检测室温度为 80°C;检测器为热导检测器，氮气作载气，柱前压力为0.14MPa;气体进样量 为500^iL。
本实施方式步骤六厌氧管中吸取的气体体积V=7.4mL;步骤五中酶反应 时间t-10min;步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量W-4.2g/L;氢气百分 含量B=0.34%;本实施方式检测的产氢氢化酶活力为27.3pmol/g'min。
具体实施方式
八本实施方式检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法
按照以下步骤进行 一、预处理将活性污泥加入到厌氧管中，然后向厌氧管 中依次加入磷酸盐缓冲液、溶菌酶、二溴乙烷磺酸钠和铁粉，再向厌氧管中充
12min的N2后密封，其中每lmL的活性污泥需要加入0.6mL、 pH值为7.6的 磷酸盐缓冲液、100(iL的溶菌酶、0.2mL的质量浓度为2g/L的二溴乙烷磺酸 钠和0.04mg的铁粉；二、恒温培养将步骤一的厌氧管放置在39'C的水浴条 件下培养42min;三、加入电子载体将二甲基亚砜作为电子载体加入到步骤 二培养后的厌氧管中，其中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL的二甲基亚砜； 四、预热处理将步骤三中加入电子载体的厌氧管放置在39。C的恒温振荡水 浴中预热处理20min;五、酶反应向步骤四预热处理后的厌氧管中加入硫代 硫酸钠和硫化钠溶液，进行酶促放H2反应llmin，其中每lmL的活性污泥需 要加入O.lmL、质量浓度为40g/L的硫代硫酸钠和O.lmL、质量浓度为40g/L 的硫化钠；六、终止反应向步骤五的厌氧管中加入三氯乙酸溶液终止反应， 其中每lmL的活性污泥需要加入0.2mL浓度为10%三氯乙酸溶液；七、吸取 步骤六厌氧管中的气体进行气相色谱分析，记录氢气百分含量，按照公式ui-^ii^求出厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性，其中UI表示厌氧活性污
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泥的氢化酶活性，B表示氢气百分含量，V表示从步骤六厌氧管中吸取的气体 体积，W表示步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量，即每lmL活性污泥 含有的挥发性悬浮固体的质量，t表示步骤五中酶反应时间。
本实施方式使用的是20mL厌氧管，活性污泥的加入量为2mL。 本实施方式取一定体积步骤一所用的活性污泥，将活性污泥用滤纸过滤，
滤纸截留下的滤渣放到105'C烘箱烘干至恒重，所得重量为悬浮固体；把悬浮
固体在马弗炉灼烧，即所失去的重量为挥发性悬浮固体的质量，按照W^M/Vi
计算得到活性污泥的生物量，其中V,表示活性污泥的体积，M表示挥发性悬
浮固体的质量，W表示本实施方式步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量。
本实施方式气相色谱条件色谱柱为不锈钢填充柱Porapak.Q型，柱长为
3m，色谱柱内径为3mm，柱温为80°C，汽化室温度为80°C，检测室温度为
80°C;检测器为热导检测器，氮气作载气，柱前压力为0.14MPa;气体进样量
为500jxL。
本实施方式步骤六厌氧管中吸取的气体体积V=14.4mL;步骤五中酶反应 时间t^2min;步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量W-5.4g/L;氢气百分 含量8=0.43%;本实施方式检测出的产氢氢化酶活力为42.7nmol/g*min。
在本发明其他步骤及参数均相同的情况下，采用不同的电子载体进行对比 试验，第一组为本发明的检测方法加入0.2mL、质量浓度为10g/L的甘氨酸作 为电子载体，向厌氧管中加入lmL的活性污泥，本组试验检测出的产氢氢化 酶活力为28.3pmol/gTnin;第二组为本发明的检测方法加入0.2mL、浓度为 0.25%的二甲基亚砜作为电子载体，向厌氧管中加入lmL的活性污泥，本组试 验检测出的产氢氢化酶活力为29.7^imol/g'min;第三组为现有的方法中加入 0.2mL、质量浓度为20g/L的甲基紫精作为电子载体，向厌氧管中加入lmL的活性污泥，本组试验检测出的产氢氢化酶活力为21.4iiimol/g.min。由此可见本 发明的方法与现有的以甲基紫精作为电子载体的方法相比较，灵敏度高，准确 性好，且本发明的方法以微毒的二甲基亚砜或无毒的甘氨酸作为电子载体，安 全，可靠。
权利要求
1、一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法，其特征在于检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法按照以下步骤进行一、预处理将活性污泥放入到厌氧管中，然后向厌氧管中依次加入磷酸盐缓冲液、溶菌酶、二溴乙烷磺酸钠和铁粉，再向厌氧管中充N2后密封，其中每1mL的活性污泥需要加入0.6mL、pH值为7.3～7.7的磷酸盐缓冲液、100μL的溶菌酶、0.2mL的质量浓度为2g/L的二溴乙烷磺酸钠和0.04mg的铁粉；二、恒温培养将步骤一的厌氧管放置在36～45℃的水浴条件下培养30～50min；三、加入电子载体将甘氨酸或者二甲基亚砜作为电子载体加入到步骤二培养后的厌氧管中，其中每1mL的活性污泥需要加入0.2mL、质量浓度为10g/L的甘氨酸或者加入0.2mL、质量浓度为0.25％的二甲基亚砜；四、预热处理将步骤三中加入电子载体的厌氧管放置在38～42℃的恒温振荡水浴中预热处理18～25min；五、酶反应向步骤四预热处理后的厌氧管中加入硫代硫酸钠和硫化钠溶液在室温条件下酶促反应8～12min，其中每1mL的活性污泥需要加入0.1mL、质量浓度为40g/L的硫代硫酸钠和0.1mL、质量浓度为40g/L的硫化钠；六、终止反应向步骤五的厌氧管中加入三氯乙酸溶液终止反应，其中每1mL的活性污泥需要加入0.2mL、质量浓度为10％三氯乙酸溶液；七、吸取步骤六厌氧管中的气体进行气相色谱分析，记录氢气百分含量，按照公式求出厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性，其中UI表示厌氧活性污泥的氢化酶活性，B表示氢气百分含量，V表示步骤五厌氧管中的气体体积，W表示步骤一中放入厌氧管中活性污泥的生物量，即每1mL活性污泥含有的挥发性悬浮固体的质量，t表示步骤五中酶反应时间。
2、 根据权利要求1所述的一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法，其特征在于步骤一中每lmL的活性污泥需要加入0.6mL、 pH值为7.4~7.6的磷酸盐缓冲液。
3、 根据权利要求1或2所述的一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性 的方法，其特征在于步骤二是在38 42°C的水浴条件下培养35 45min。
4、 根据权利要求3所述的一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方 法，其特征在于步骤四是在39 4(TC的恒温振荡水浴中预热处理19 21min。
5、 根据权利要求1、 2或4所述的一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活 性的方法，其特征在于步骤五中在室温条件下酶促反应10min。
6、 根据权利要求5所述的一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方 法，其特征在于步骤七中气相色谱条件色谱柱为不锈钢填充柱Porapak.Q型， 柱长为3m，色谱柱内径为3mm，柱温为8(TC，汽化室温度为80°C，检测室 温度为80°C;检测器为热导检测器，氮气作载气，柱前压力为0.14MPa;气 体进样量为500jjlL。
全文摘要
一种检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法，它涉及一种检测氢化酶活性的方法。本发明解决了现有产氢氢化酶活性检测方法存在的灵敏度低，检测结果准确性差，操作复杂以及安全性差的问题。本发明检测方法按照以下步骤进行一、样品预处理；二、恒温培养；三、加入电子载体；四、预热处理；五、酶反应；六、终止反应；七、吸取气体进行气相色谱分析，记录氢气百分含量，求出厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性。本发明检测厌氧活性污泥中产氢氢化酶活性的方法操作简单，准确性好，灵敏度高，本发明方法以微毒的二甲基亚砜或无毒的甘氨酸作为电子载体，安全性好。
文档编号G01N30/02GK101482546SQ200910071400
公开日2009年7月15日 申请日期2009年2月12日 优先权日2009年2月12日
发明者李建政, 硕 王, 凡 蒋, 郑国臣 申请人:哈尔滨工业大学