专利名称：IRE-1α抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及IRE-la抑制剂及其治疗应用。
背景技术：
细胞内质网中的蛋白质折叠应激(protein folding stress)可引发称为解折叠蛋白质 效应或UPR的信号转导级联反应。需肌醇酶1 (IRE-1 a )是一种关键酶，其通过增强分 子伴侣活性来减轻蛋白质折叠应激，因而保护细胞免遭应激诱导的凋亡。IRE-la的抑 制剂至少可用于治疗B细胞自身免疫疾病、某些癌症和一些病毒感染。附图简述
图1.利用6-溴代邻-香草醛的细胞基IRE-1 a XBP_1_特异性核糖核酸内切酶 抑制的结果。12iiLDMS0是1.2%。图2.在人骨髓瘤细胞中的细胞基IRE-1 a XBP_1_特异性核糖核酸内切酶抑制的结果。图3.显示IRE-1 a抑制剂细胞试验的PCR产物的琼脂糖凝胶扫描图片，显示了 各种IRE-1 a抑制剂的剂量依赖性抑制细胞XBP-1剪接。XBP-lu、未剪接的XBP_1 ； XBP-ls,剪接的SBP-1; EC50, IRE-1 a抑制剂抑制50%的DTT-诱导细胞XBP-1剪接 时的浓度(P M)。泳道上的数值标出各化合物的浓度(以P M计)。用活性或无活性化 合物处理MM.ls骨髓瘤细胞2小时，然后用DTT处理1小时。利用侧接内含子区域的人 XBP-1特异性引物进行RT-PCR。DTT诱导UPR应激(S)导致26个核苷酸的片段被除 去，从而与未经应激细胞(U)(较高条带)相比，产生较低条带。EC5(I测定为抑制50% DTT诱导剪接XBP-1的浓度。化合物17-1的EC5(1约为2-3 u M。图4.显示IRE-1 a抑制剂可逆抑制细胞中活化形式的IRE-1 a。在HEK 293细 胞中利用10 y M化合物2检测XBP-1剪接的细胞抑制作用。图4A采用标准RT-PCR来 显示加入2mM DTT并维持在培养液中(▲)或在诱导后30分钟( )或1小时(■) 将DTT洗出后的剪接XBP-1的相对量。用DTT对细胞施加应激时，XBP-1信使RNA 快速转化成剪接形式。相反，去除应激时，细胞快速降解剪接的XBP-1并替换以未剪接 形式。图4B显示在DTT诱导前2小时(■)或在诱导后1小时(▲)将化合物2加入 DTT应激细胞时，与除去DTT应激类似，未剪接形式快速累积，提示该化合物抑制该酶 的活化形式。当将该化合物洗出而维持DTT应激，剪接的XBP-1在完成抑制后的数小 时内增加，提示抑制作用是可逆的(■，X，*) 通过扫描未剪接和剪接的XBP-1条 带的凝胶测定剪接百分比(如图3所述)。酶活性以剪接的XBP-1的百分比在Y轴上表 示(计算成剪接含量除以剪接和未剪接XBP-1的总量)。图5.显示了 IRE-1 a抑制剂11-28 (实施例11)对多发性骨髓瘤细胞增殖的抑 制作用。将RPMI-8226多发性骨髓瘤细胞以20,000细胞/孔接种在含有1 % FBS和所
9需抗生素的RPMI培养基中。该平板在37°C、95%空气、5% C02下温育过夜。第二 天，将化合物11-28或培养基单独加入各孔，达到终体积为100微升/孔。化合物浓 度为100iiM-0iiM，其中各化合物作4倍稀释。加入化合物后，该平板在37°C、95% 空气、5% C02下温育24小时。按照生产商的说明书，利用普罗麦格公司的CTG测定 (CellTiter-Glo assay, Promega)检测细胞增殖。图6.蛋白质印迹(图6A)和琼脂糖凝胶(图6B)显示用波特佐米(bortezomib) (MG-341 ； VELCADE )处理RPMI8226细胞24小时增加磷酸化IRE-1 a禾P XBP1-剪 接的水平。数值表明波特佐米的浓度(nM)。图7.显示通过相对胱冬酶活性(胱冬酶3和胱冬酶7的总活性)反映出利用蛋 白酶体抑制剂MG-132 (N-[(苯基甲氧基)羰基]_L-亮氨酰-N_[ (IS) 甲酰基_3_甲基 丁基]_L-亮氨酰胺)和IRE-1 a /XBP-1特异性抑制剂增强骨髓瘤细胞的凋亡。图7A， 100nM MG-132 ；图 7B，200nMMG_132。图8.小鼠组织中IRE-1 a抑制剂体内试验的结果。图8A，衣霉素和IRE_1 a抑 制剂处理的方案。图8B，显示IRE-1 a特异性XBP-1剪接在NOD-SCID小鼠的肾、肝 和脾中大部分失活的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶。图8C，用衣霉素处理6小时导致显著 水平的剪接XBP_l(Wu等，2007)。图8C，显示用衣霉素腹膜内处理后4小时用IRE_1 a 抑制剂处理的小鼠中剪接XBP-1水平降低的RT-PCR产物的琼脂糖凝胶。图8D，图示 了图8B和8C中每组两只小鼠的剪接XBP-1相对于总XBP-1的平均相对百分比。图8B 和图8C中括号上方的数字是小鼠编号(小鼠3、小鼠4，等等)。图8D，图示了图8B 和8C中每组两只小鼠的剪接XBP-1相对于总XBP-1的平均相对百分比。图9.用选择的IRE-1 a抑制剂抑制LPS刺激原代鼠B细胞后IgM的分泌。当在 刺激开始时和刺激后24小时加入时，化合物17-1在最低lOOnM的所有测试剂量下均阻断 IgM分泌。然而，在刺激后40小时加入时，化合物作用不大；在最高剂量也仅有略微抑 制。如以前Iwakoshi等(Nature4，321-29，2003)所述实施B细胞刺激、浆细胞分化和 IgM分泌的方法。利用小鼠CD43微珠(Miltenyi目录号130-049-801)从BALB/c脾脏分 离原代B细胞，每次处理lxlO6个细胞。在24-孔平板中，在终密度为lxlO6/毫升/孔的 B细胞培养液中用20 u g/ml LPS (Sigma目录号L4391)刺激纯化的B细胞。在指定的时 间点(t = 0、t = 24小时、t = 40小时，等等)加入各种浓度(50 10uM> 2 u M> 0.4 iiM和0.08 iiM)的IRE-1 a抑制剂化合物17-1。37°C，温育细胞48小时。温育结 束时，将细胞在平板中以1500rpm离心3分钟。收集上清液，利用小鼠IgM ELISA试剂 盒(Bethyl Labs目录号E90-101)定量测定IgM分泌。B细胞培养基包括补加了 NEAA、 HEPES、NaPyr、PSQ 和 3 _ 巯基乙醇的 RPMI+10% FBS。发明详述本发明提供IRE-la抑制剂化合物及其前药和药学上可接受的盐。本发明还提 供药物组合物和治疗性利用IRE-la抑制剂化合物、其前药和药学上可接受的盐治疗解 折叠蛋白质效应相关疾病的方法。可治疗的患者包括具有B细胞自身免疫疾病、某些癌 症和一些病毒感染的那些患者。本发明包括因结构和功能而相关的许多化学化合物以及它们的使用方法。可限 定包括这些化合物中一种到任意数量的它们的各种分组和应用，这些分组和应用构成本发明的各种实施方式。一些实施方式特意包括某些化合物，而其它实施方式特意排除某 些化合物。包括或排除的标准包括特定结构或结构特征，活性水平或范围(例如，IC5。 或EC5。)、通过特定给药途径给药的适合性、所治疗的疾病，等等。IRE-1 a抑制剂化合物本发明的IRE-1 a抑制剂化合物是直接抑制该酶的芳族和杂芳族羟 醛类。据信，这些化合物通过抑制酶的RNA酶活性而起作用。在本发明的具体实施方式
中，该活性检测为IRE-1 a对人小-XBP-lmRNA茎-环底物 5' -CAGUCCGCAGGACUG-3‘ (SEQ ID NO 1)的体外切割为至少 10、15、20、25、 30、40、50、60或75%。其它底物也可用于检测切割。参见US 20070105123。在一些实施方式中，化合物在体外试验中抑制IRE-la的平均IC5(1为约 20 u M (20,000nM)或更低(例如，20000、15000、10000、7500、7250、7000、6750、 6500, 6250, 6000, 5750, 5500, 5250, 5000, 4750, 4500, 4250, 4000, 3750, 3500、 3250、 3000、 2750、 2500、 2250、 2000、 1750、 1500、 1250、 1000、 950、 900、 850、 800、 750、 700、 650、 600、 550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 150、 100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5、2 或 InM 或更低)。在一些实施方 式中，化合物在体外XBP-1剪接试验(例如，骨髓瘤细胞)中抑制IRE-la的平均EC5(1 为 80 ii M (80,000nM)或更低(例如，80000、75000、70000、65000、60000、55000、 50000、 45000、 40000、 35000、 30000、 25000、 20000、 15000、 10000、 7500、 7250、 7000, 6750, 6500, 6250, 6000, 5750, 5500, 5250, 5000, 4750, 4500, 4250, 4000, 3750, 3500, 3250, 3000, 2750, 2500, 2250, 2000, 1750, 1500, 1250, 1000、 950、 900、 850、 800、 750、 700、 650、 600、 550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 150、 100、 90、 80、 70、 60、 50、 40、 30、 20、 15、 10、 5、 2 或 InM 或更 低)。IRE-la抑制剂化合物可符合这些标准中的任一种或全部。本领域熟知，这些化合物中的醛基可表示为下示三种等价形式中的任一种
权利要求
1. 一种如结构式(B)所示的直接抑制体外IRE-I α活性的化合物，或其前药或药学 上可接受的盐
2.—种如结构式(A)所示的直接抑制体外IRE-I α活性的化合物，或其前药或药学 上可接受的盐
3.所述杂原子独立选自氮、氧或硫，其中所述杂芳基是任选苯并稠合的，其中 所述杂芳基任选被独立选自下组的1、2或3个取代基取代
4. 一种如结构式(D)所示的直接抑制体外IRE-I α活性的化合物，或其前药或药学 上可接受的盐
5.—种如结构式(E)所示的直接抑制体外IRE-I α活性的化合物或其药学上可接受的
6.—种如结构式(F)所示的直接抑制体外IRE-I α活性的化合物或其药学上可接受的
7.—种药物组合物，其包含权利要求1-6中任一项所述的化合物和药学上可接受的运 载体。
8.一种治疗解折叠蛋白质效应相关疾病的方法，该方法包括给予有此需要的患者如 结构式⑴所示的直接抑制体外IRE-I α活性的化合物或其前药或药学上可接受的盐Rx式中OH取代基位于醛取代基的邻位；Q是芳族碳环或杂环系统，选自苯、萘、吡啶、吡啶N-氧化物、噻吩、苯并[b]噻吩、苯并[C]噻吩、呋喃、吡咯、哒嗪、嘧啶、吡嗪、三嗪、异噁唑啉、噁唑啉、噻唑 啉、吡唑啉、咪唑啉、芴、联苯基、喹啉、异喹啉、噌啉、2，3-二氮杂萘、喹唑啉、 喹喔啉、苯并呋喃、吲哚、异吲哚、异苯并呋喃基、苯并咪唑、1，2-苯并异噁唑和咔 唑；R\ R5^n Rz可以存在或不存在，独立选自氢、芳基、杂芳基、-A" R\ -OH、-OA" Ra、-NO2、-NH2、-NHA“ Ra、_N(A" Ra) (A“ ‘ Rb)、-NHCOA“ Ra、-NHCOOA “R\ -NHCONH2> -NHCONHA“ R\ -NHCON(A“ Ra) (A〃 ‘ Rb)、卤素、-COOH、-COOA 〃 R\ -CONH2、-CONHA 〃 R\ _CON(A〃 Ra) (A 〃 ' Rb)禾Π 卜丫丫 Ra 和 Rb 独立为氢、-COOH、-COOA、_CONH2、-CONHA> -CONAA'、-NH2 、-NHA、-NAA'、-NCOA、-NCOOA、-OH 或-OA ；Y是C1-Cltl亚烷基或C2-C8亚烯基，其中(a)l、2或3个CH2基团可以为O、S、 SO、S02、NH或NRe所替代，和/或(b) 1-7个H原子可以独立为F或Cl所替代； A和A'是(a)独立为Cl-ClO烷基或C2-C8烯基，其中⑴1、2或3个CH2基团可以为O、 S、SO、S02、NH或NRc所替代，和/或(ii) 1_7个H原子可以独立为F或Cl、芳基或杂芳基所替代；或(b)或者，A和A'—起形成C2-C7亚烷基，其中1、2或3个CH2基团可以为O、 S、SO、S02、NH> NRc> NCORc或NCOORc所替代，从而形成，例如亚烷基二氧基；A"、A"‘独立为(a)不存在，(b) Cl-ClO亚烷基、C2-C8亚烯基或C3-C7环烷 基，其中1、2或3个CH2基团可为O、S、SO、S02、NH或NRc所替代，和/或1_7 个H原子可为F和/或Cl所替代；或(C) 二者可一起形成C2-C7烷基，其中1、2或3 个 CH2 基团可以为 O、S、SO、S02、NH> NRc> NCORc 或 NCOORc 所替代，Rc是Cl-ClO烧基、C3-C7环烷基、C4-C8亚烷基环烷基或C2-C8烯基；其中1、2 或3个CH2基团可以为O、S、SO、S02、NH> NMe> NEt和/或-CH = CH-基团所 替代，1-7个H原子可以为F和/或Cl所替代，和/或1个H原子可以为Ra所替代；芳基是苯基、苄基、萘基、芴基或联苯基，其中各自可以是未取代的或为以下基团 所单取代、双取代或三取代卤素、-CF3、-Rf、-ORd、-N (Rd) 2、_N02、_CN、-CO ORd、CON (Rd) 2、-NRdCORe> -NRdCON (Re) 2, _NRdS02A、-CORd、_S02N(Rd)2、 -S(0)mRf、AA' 一起或 _0(芳基)， Rd和Re独立为H或C1-C6烷基； Rf是C1-C6烷基；杂芳基是具有1-2个N、O和/或S原子的单环或双环饱和、不饱和或芳族杂环，其 可以是未取代的或为以下基团所单取代或双取代羰基氧、卤素、Rf、-ORd、-N(Rd) 2 、-N02、-CN、-COORd、-CON (Rd) 2、-NRdCORe> -NRdCON (Re) 2, _NRfS02Re、-C ORd、_S02NRd 和 / 或-S(0)mRf;禾口 m是O、1或2。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括给予诱导或上调IRE-I α表达的治疗剂。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括给予在IRE-Iα表达时效力降低 的治疗剂。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述化合物是权利要求1-4中任一项所 述的化合物。
12.一种治疗解折叠蛋白质效应相关疾病的方法，该方法包括给予有此需要的患者权 利要求5或权利要求6所述的化合物。
13.一种治疗解折叠蛋白质效应相关疾病的方法，该方法包括给予有此需要的患者 直接体外抑制IRE-I α的化合物或其前药或药学上可接受的盐；和蛋白酶体抑制剂。
14.权利要求1-6中任一项所述化合物或如结构式⑴所示的直接抑制体外IRE-Iα 活性的化合物，或其前药或药学上可接受的盐在制备用于治疗解折叠蛋白质效应相关疾 病的药物中的应用
全文摘要
直接抑制体外IRE-1α活性的化合物，其前药和药学上可接受的盐。这种化合物和前药可用于治疗解折叠蛋白质效应相关的疾病，可用作单一药剂或用于组合治疗中。
文档编号C07C47/548GK102015606SQ200880019035
公开日2011年4月13日 申请日期2008年6月9日 优先权日2007年6月8日
发明者D·G·洛纳甘, J·B·帕特森 申请人:满康德股份有限公司