专利名称：用于预防和治疗再狭窄的包含异*唑衍生物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和治疗再狭窄的药物组合物，更具体说，涉及用于预防和治疗再狭窄的包含异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物。
背景技术：
经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)是一种用于治疗诸如心绞痛或心肌梗塞等缺血性疾病的方法，已广泛使用代替搭桥手术。在这种情况下，PTCA包括以下过程将前端连接有球囊的专用导管经皮插入并由外周动脉进入冠状动脉狭窄部位，通过膨胀球囊来扩张狭窄部位。采用球囊导管的冠状动脉血管成形术被评为出色的治疗手段，因为其在心绞痛的好转率方面相对较高，而诱导心肌梗塞发生的风险低。然而，采用球囊导管的冠状动脉血管成形术之后，有40-50％的患者在相同部位发生再狭窄。在这种情况下，应再次进行PTCA或搭桥手术。
为了解决上述问题，采用利用支架的方法来治疗狭窄血管和维持正常血流，该方法包括将不锈钢金属支架插入狭窄血管并使狭窄血管扩展至血管的原始大小。已报道该冠状动脉支架置入术可降低再狭窄率大约10％。然而，采用支架的方法也存在问题，即再狭窄复发频率高，并且由于支架缺乏弹性也难以将支架应用于弯曲血管。
研究支架内再狭窄的发生机制来解决上述问题。结果发现，不同于采用球囊的干预机制，支架置入术后再狭窄的机制是因为血管壁气压性损伤和外源性物质连续刺激导致的新内膜增生，支架置入术期间血管扩张不充分时可能发生假性支架内再狭窄。(参见Hoffman R等，Circulation，941247-1254，1966Dussainllant GR等，J.Am.Coll.Cardiol.，26720-724，1995)。近来发现，针对内皮细胞损伤的增生反应与血管紧张素转化酶(ACE)基因的多态性有关。在这种情况下，在80％的弥散性支架内再狭窄病损以及36％的局灶性病损中观察到D/D遗传性状，表明该遗传性状是影响再狭窄的因素之一(参见Ribichini F等，Circulation，97141-154，1998)。并且，预计血管介质中血管平滑肌细胞增殖以及血管平滑肌细胞迁移进入衬膜导致的新内膜形成在再狭窄机制中发挥最重要的作用。根据这些研究成果，近来认为干预后受损血管中血管平滑肌细胞的增殖，生长因子和胞质基质引起的新内膜增生，以及血管壁对血管动态变化的反应引起的血管重构等导致血管再狭窄的发生(参见Epstein SE.，等，J.Am.Coll.Cardiol.，231278-1288，1994；Glagov S，Circulation，8928888-28891，1994)。
正常血管平滑肌细胞不生长，但当支架置入术等导致内皮细胞介质受损时，通过信号转导级联反应可诱导血管平滑肌细胞的分裂、迁移和增殖。血管平滑肌细胞的增殖机制包括去除增殖抑制因子、正常内皮细胞受损导致增殖促进因子激活、通过血管平滑肌细胞的细胞表面受体转导增殖促进信号，以及增殖促进信号转导到血管平滑肌细胞核内导致细胞周期变化，等等。正常内皮细胞分泌能够抑制血管平滑肌细胞增殖的因子，但已报道当内皮细胞受损时，这些因子的分泌受到抑制，激活的血小板分泌的凝血酶、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)以及细胞受损产生的氧自由基可诱导血管平滑肌细胞的增殖(参见Palmer RMJ等，Nature，327524-526.1987；Kinsella MG，Wight TN，J.Cell Biol.，102678-682，1986McNamara CA，等，J.Clin.Invest.，9194-98，1993)。
引入新型PTCA设备如利用切割球囊的激光血管成形术、高速腔内斑块旋切术和冠状动脉血管成形术来预防再狭窄，也存在利用药物如抗血小板药、抗凝血药、血管扩张药、细胞生长抑制剂等在冠状动脉血管成形术后预防再狭窄的尝试。其中，已经证明用细胞生长抑制药如雷帕霉素或紫杉醇涂覆表面的药物洗脱支架是最有效的。这些药物能够强效抑制可能导致再狭窄的血管平滑肌细胞的分裂、迁移和增殖。已经证明两种药物洗脱支架具有抑制再狭窄的出色效果，这两种药物洗脱支架自从2004年在美国推出后即占据超过90％的美国冠状动脉血管成形术市场份额。
然而，已报道采用细胞生长抑制剂的药物洗脱支架在进行支架置入术一个或多个月后患者发生后期支架血栓形成的风险升高(2006巴塞罗那国际心脏病学年会(World Cardiology Congress))。因此，FDA推荐患者在支架置入术后至少1年内使用抗血栓药，追踪检查后期支架血栓形成的风险(参见http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/06/briefing/2006-4253b1_01.pdf)。药物洗脱支架的这些副作用可能由各种原因引起，但最重要的原因之一是支架植入手术期间支架植入部位中血管壁的损伤没有愈合或者其愈合被延迟(参见RenuVirmani，Circulation 2005；112；270-278)。药物本身被认为是血管壁伤口愈合延迟的原因。所有近来使用的药物均为细胞生长抑制剂，这些细胞生长抑制剂可抑制能使血管壁伤口愈合的血管内皮细胞的分裂、迁移和增殖，同时抑制导致再狭窄的血管平滑肌细胞的分裂、迁移和增殖。就是说，这些药物不能选择性靶向平滑肌细胞，因而在抑制再狭窄的同时也存在导致血管壁的伤口愈合延迟的副作用，因为药物对细胞没有特定的选择性(Sarembock，DrugDiscov TodayDis Mech(2007)，doi10.1016/j.ddmec.2007.10.007)。因此，急需开发能够预防再狭窄，同时不存在抑制血管壁伤口愈合的副作用的医药供应。
此外，已知″Wnt″蛋白是分泌性糖蛋白，其分子量约为40kDa且富含半胱氨酸，与包括细胞增殖与分化以及细胞极性在内的各种发育过程有关(MoonRT等，Science，2002；Reya T和Clevers H，Nature，2005)。已报道，人体中鉴定到19种Wnt蛋白，人体中也存在用作Wnt受体的10种卷曲蛋白和2种共受体(LRP5和6)(He XC等，Nat Genet，2004；Tamai K等，Mol Cell，2004；Tamai K等，Nature，2000)。
近来发现，Wnt信号转导途径在干细胞的维持、分化和生长促进中发挥重要作用(Reya T等，Nature.，2003；Trowbridge JJ等，NatuerMed.，2006)，因此进行了许多尝试以期将Wnt蛋白开发成能使组织再生，防止脱毛，造血，以及促进干细胞的生长、维持和分化的物质。
本发明热切地希望解决上述问题，发现用作能够激动Wnt/β-联蛋白信号转导作用的激动剂的异噁唑衍生物及其药学上可接受的盐能够有效预防和治疗再狭窄。因此，基于上述事实完成了本发明。
发明内容
技术问题 本发明设计用于解决现有技术的问题，因此本发明的目的是提供一种药物组合物，由于该药物组合物包含异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分而具有预防和治疗再狭窄的作用。
并且，本发明的另一个目的是提供预防或治疗血管再狭窄而没有血管内皮细胞中伤口愈合受抑制导致的任何后期支架血栓形成副作用的方法，该方法包括使用异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分来引出抗-再狭窄活性和加速再-内皮化。
技术方案 在本发明说明书的详细内容之前，限定了本申请中使用的一些术语。
a)烷基表示含有1-10个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和的烃，其中一个或多个氢可以被一个或多个选自下组的取代基取代至最大可能的数量而不考虑取代基的顺序和类型酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基和胍基。
b)环烷基表示饱和或部分不饱和的非芳族、单环或多环烃化合物，其包括3-12个环构成成员，其中包括0-5个诸如氧、硫、氮等杂原子。它可以是3-12-角形的单环化合物或稠合环化合物，其中一个或多个氢可以被一个或多个选自下组的取代基取代至最大可能的数量而不考虑取代基的类型和顺序酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基、胍基。
环烷基的具体例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、吗啉基、高吗啉基、硫代吗啉基、高硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S，S-二氧化物、哌啶基、高哌啶基、哌嗪基、高哌嗪基、吡咯烷基、吡咯啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、噁唑烷酮基(oxazolidinonyl)、二氢吡唑基、二氢吡咯基、二氢吡嗪基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢呋喃基和二氢吡喃基。
c)芳基表示包括由5-15个环成员构成的芳族单环或稠合环烃在内的芳族基团，以及具有1-5个诸如氧、硫或氮等杂原子的杂芳族基团，其中一个或多个氢可以被一个或多个选自下组的取代基取代至最大可能的数量而不考虑取代基的顺序和类型酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基、胍基及其组合。
芳基的具体例子包括但不限于苯基、1-萘基、2-萘基、吡啶基、嘧啶基、喹啉基、苯并噻吩基、吲哚基、吡嗪基、异吲哚基、异喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、咪唑啉基、异噁唑基、吡唑基、噁唑基、噻唑基、中氮茚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、噁唑并吡啶基、咪唑并吡啶基、异噻唑基、噌啉基、咔唑基、异色满基、色满基、四氢异喹啉基、异二氢吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异苯并噻吩基、苯并噁唑基、吡啶并吡啶基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、嘌呤基、苯并间二氧杂环戊烯基、三嗪基、吩噁嗪基、吩噻嗪基、蝶啶基、苯并噻唑基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、二氢苯并异噁嗪基、苯并异噁嗪基、苯并噁嗪基、二氢苯并异噻喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、香豆素基、异香豆素基、色原酮基、二氢色原酮基、吡啶基-N-氧化物、四氢喹啉基-N-氧化物、二氢喹啉基、二氢喹啉酮基、二氢异喹啉酮基、二氢香豆素基、二氢异香豆素基、异吲哚酮基、苯并二噁烷基、苯并噁唑啉酮基、吡咯基-N-氧化物、嘧啶基-N-氧化物、吡嗪基-N-氧化物、喹啉基-N-氧化物、吲哚基-N-氧化物、二氢吲哚基-N-氧化物、吡嗪基-N-氧化物、异喹啉基-N-氧化物、喹唑啉基-N-氧化物、喹喔啉基-N-氧化物、酞嗪基-N-氧化物、咪唑啉基-N-氧化物、异噁唑基-N-氧化物、噁唑基-N-氧化物、噻唑基-N-氧化物、中氮茚基-N-氧化物、吲唑基-N-氧化物、苯并噻唑基-N-氧化物、苯并咪唑基-N-氧化物、吡咯基-N-氧化物、噁二唑基-N-氧化物、噻二唑基-N-氧化物、三唑基-N-氧化物和四唑基-N-氧化物。
d)卤素通常表示氟、氯、溴和碘。
为解释方便，本发明所用术语表示为以下限定的缩写形式 -N，N-二甲基甲酰胺DMF -四氢呋喃THF -1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC -1-羟基苯并三唑水合物HOBt -1，1’-羰基二咪唑CDI -二苯基磷酰基叠氮化物DPPA -三乙胺TEA -甲基Me -乙基Et 下面将更详细地描述本发明的示例性实施方式。
根据本发明的一方面，提供了用于预防和治疗再狭窄的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的式I所代表的异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐 式1
式中，R1是用至少一个取代基取代或未取代的苯基、呋喃基或噻吩基，所述取代基选自下组酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基和胍基， m是2或3， A是键、O、S、SO或S(＝O)2，和 R2是用至少一个取代基取代或未取代的咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基或吡啶基，所述取代基选自下组酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基和胍基。
除了化学式1所代表的化合物之外，其药学上可接受的酸或碱加成盐及其立体化学异构体也包括在本发明异噁唑衍生物的范围内。只要其在用药的对象中保留母体化合物的活性而没有不良反应，任何的盐均包括在本发明范围内，对其没有具体限制。盐可以是无机盐或有机盐。优选的是乙酸盐、硝酸盐、天冬氨酸盐、磺酸盐、硫酸盐、马来酸盐、谷氨酸盐、甲酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、酞酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、氢溴酸盐、丙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硬脂酸盐、乙磺酸盐(esyl)、乳酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、草酸盐、丁酸盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯苯甲酸盐、柠檬酸盐、依地酸盐、甲苯磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐(esylic)、富马酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptic)、双羟萘酸盐、葡糖酸盐、对羟乙酰氨基苯砷酸盐(glycollylarsanilic)、甲基硝酸盐、多聚半乳糖醛酸盐、己基间苯二酚盐(hexylresorcinoic)、丙二酸盐、哈胺盐(hydrabamic)、盐酸盐、氢碘酸盐、羟基萘酸盐、羟乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、扁桃酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐(estolic)、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐(napsylic)、粘康酸盐、对硝基甲磺酸盐、环己磺酸盐、泛酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、氨基磺酸盐、对氨基苯磺酸盐、甲磺酸盐或茶氯酸盐(teoclic)。
并且，碱性盐形式可包括例如铵盐，碱金属盐，碱土金属盐，例如锂、钠、钾、镁和钙盐；有机碱盐，例如苄星(bezathine)、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺(hydrabamine)的盐以及氨基酸如精氨酸和赖氨酸的盐。
同时，用合适的碱或酸处理可使盐形式转化为游离形式。
本文所用术语“加成盐”表示包括化学式1的化合物或其盐可形成的溶剂合物在内的盐。溶剂合物可表现为水合物和醇合物。
本文所用术语“化学式1化合物的立体化学异构体”表示化学式1的化合物可具有的所有可能的形式。除非另有说明或提及，化学式1的化合物的化学名称表示基本分子结构的所有可能的立体化学异构体，包括所有非对映体和对映体的混合物。
具体说，各个手性中心可具有R或S-构型，二价环状(部分)饱和基团上的子取代基可具有顺式或反式构型。如果存在，具有双键的化合物可具有E-或Z-立体化学结构。化学式1所代表的化合物的所有立体化学异构体包括在本发明的范围内。
根据本发明示例性实施方式的异噁唑衍生物中，异噁唑衍生物更优选的例子包括但不具体限于，以下衍生物(1)-(70)。
衍生物15-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物25-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-2-基-乙基)-酰胺 衍生物35-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺 衍生物45-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物55-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺 衍生物65-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(2-甲基-咪唑-1-基)-乙基]-酰胺 衍生物75-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(5-甲基-咪唑-1-基)-乙基]-酰胺 衍生物85-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(4-甲基-咪唑-1-基)-乙基]-酰胺 衍生物95-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物105-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物115-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物125-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-2-基-乙基)-酰胺 衍生物135-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-四唑-2-基-乙基)-酰胺 衍生物145-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-四唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物155-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[3-(2-甲基-咪唑-1-基)-丙基]-酰胺 衍生物165-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-吡唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物175-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物185-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，3]三唑-2-基-丙基)-酰胺 衍生物195-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物205-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-四唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物215-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-四唑-2-基-丙基)-酰胺 衍生物225-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-丙基]-酰胺 衍生物235-苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物245-苯基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物255-邻甲苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物265-间甲苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物275-对甲苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物285-(2-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物295-(3-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物305-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物315-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物325-(2-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物335-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物345-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物355-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物365-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-2-基-乙基)-酰胺 衍生物375-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物385-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-四唑-2-基-乙基)-酰胺 衍生物395-(4-氯-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物405-(4-氯-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物415-(4-氯-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物425-(2-甲氧基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物435-(3-甲氧基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物445-(4-甲氧基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物455-(3-硝基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物465-(4-硝基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物475-(3-氨基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物485-(4-氨基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物495-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物505-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]-三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物515-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物525-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物535-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物545-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物555-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-2-基-乙基)-酰胺 衍生物565-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺 衍生物575-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺 衍生物585-(5-溴-噻吩-2-基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物595-呋喃-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物605-呋喃-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]-三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物615-呋喃-3-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]-三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物625-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]-三唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物635-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 衍生物645-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物655-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]-三唑-1-基-乙基)-酰胺 衍生物665-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(吡啶-2-基-氧基)-乙基]-酰胺 衍生物675-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(吡啶-2-基-氧基)-乙基]-酰胺 衍生物685-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(1-甲基-1H-四唑-5-基-硫烷基)-乙基]-酰胺 衍生物695-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸[3-(4H-[1，2，4]三唑-3-基-硫烷基)-丙基]-酰胺 衍生物705-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(4-甲基-4H-[1，2，4]三唑-3-基-磺酰基)-乙基]-酰胺 根据本发明的另一方面，提供了用于预防或治疗血管再狭窄而没有任何后期支架血栓形成副作用的方法，该方法包括使用式1所代表的异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分来引出抗-再狭窄活性和加速再-内皮化。
血管再狭窄可包括但不具体限于经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后导致的冠状动脉再狭窄、大脑或外周血管疾病经皮干预后导致的再狭窄、各种血管手术后导致的血管狭窄、搭桥手术和动静脉瘘血管成形术后导致的血管狭窄、自体血管和人造血管移植后导致的狭窄以及动脉粥样硬化。
根据本发明一个示例性实施方式的式1的异噁唑衍生物可由已知化合物制备，或者采用本发明所涉及的化合物合成领域中任何普通技术人员已知的化合物制备的那些化合物进行制备。因此，本文所述异噁唑衍生物的制备方法的描述仅仅是一个优选的例子，仅仅出于解释说明的目的，而不是对本发明范围的限制，需要时可选择性地改变各操作单元的顺序。
首先，将参考以下方案1，详细地描述式1异噁唑衍生物的制备方法。
方案1
在无水乙醇溶液中，优选地用1.0M乙醇钠处理市售原料(1)，并与草酸二乙酯反应得到中间体(2)。然后，在无水乙醇溶液中，用羟胺处理中间体(2)，得到异噁唑中间体(3)。然后，在THF和甲醇溶剂的存在下，优选地用1N氢氧化锂水溶液处理中间体(3)，以合成羧酸中间体(4)。中间体(4)可与所需的胺反应，得到最终的异噁唑化合物(5)(式1所代表的化合物)。
并且，由后文描述的实施例的结果可见，根据本发明一个示例性实施方式的式1的化合物具有激动Wnt/β-联蛋白信号转导的作用。因此，本发明提供了具有激动Wnt/β-联蛋白信号转导作用的组合物，所述组合物大致包含治疗有效量的式1所代表的异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
在药物组合物的制备过程中，根据所要制备的制剂选择载体，通过将载体与活性成分，即式1的异噁唑衍生物以适当比率混合来制备制剂。
就是说，根据所需应用将活性成分配制成口服、胃肠外、可注射或经皮制剂，出于方便给药和剂量均一性考虑可制成单位剂型。
根据本发明一个示例性实施方式的药物组合物的给药可包括腹膜内，肌内、皮下给药和口服给药，但优选胃肠外给药。例如，通过将渗透泵插入人体内以便以控释方式给予药物组合物，也可以以涂覆试剂的形式将药物组合物经胃肠外局部给予支架。并且，优选将根据本发明一个示例性实施方式的药物组合物以涂覆试剂的形式，单独或与常规的其他药物联合局部给予。在这种情况下，涂覆方法遵循用药物涂覆支架的常规方法。可使用的涂覆方法包括例如将药物与用于涂覆支架的各种聚合物混合，采用诸如滴涂(drop)和旋涂等涂覆方法用药物混合物涂覆支架，并且对经涂覆的支架进行灭菌。
最优选地，根据本发明一个示例性实施方式的药物组合物可以支架涂覆试剂的形式胃肠外局部给予。
可使用常规药用载体来制备口服制剂。例如，对于口服液体制剂如混悬剂、糖浆剂、酏剂和溶液剂，可使用水、二醇、油、醇等作为载体，对于固体制剂如粉末剂、丸剂、胶囊剂和片剂，可使用淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等作为载体。考虑到方便给药，片剂和胶囊剂是最常规的剂型，更优选制备肠溶制剂形式的片剂和丸剂。
对于胃肠外制剂，通常使用无菌水作为载体。在这种情况下，胃肠外制剂还可包含其他组分如增溶剂。
可根据已知方法，用合适的分散剂、润湿剂或助悬剂制备可注射制剂如无菌可注射水性或油性混悬剂。本文可使用的溶剂包括水、林格溶液和NaCl等渗溶液，通常使用无菌非挥发油作为溶剂或混悬介质。为此可注射制剂可使用任何包含甘油单酯或甘油二酯的无刺激非挥发油，也可使用其他脂肪酸如油酸。
对于经皮制剂，可任选地使用浸润促进剂和/或合适的润湿剂作为载体，并使用对皮肤不会产生任何刺激的合适的添加剂。当添加剂有助于促进经皮给药或制备所需组合物时，对于添加剂没有任何具体限制。并且，可以各种形式给予经皮制剂，例如经皮贴片、乳膏或软膏。
同时，为了防止本发明活性成分从人体很快消除，可将根据本发明一个示例性实施方式的包含异噁唑衍生物的组合物配制成缓释制剂。在这种情况下，本文可使用的载体的具体例子包括本领域已知的植入物、微囊递送系统、可生物降解/生物相容的聚合物，等等。
术语“治疗有效量”表示有效缓解或减轻需要治疗的疾病症状的活性成分的量，或者降低或延迟需要预防的疾病临床表现或症状的发生。在针对需要治疗的疾病的已知的体内或体外(ex vivo)模型系统中对相应化合物进行实验，从而凭经验确定治疗有效量。
当根据本发明一个示例性实施方式的组合物中的活性成分，具体是式1的异噁唑衍生物出于临床目的给予时，可以单次或分多次给予宿主的活性成分每日剂量较优选为0.1-100毫克/千克体重，但在某些患者中该剂量可根据所使用的某些化合物、患者体重、性别和健康状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物混合物、疾病严重性等因素而改变。
需要时，可使用式1的异噁唑衍生物将有效的药物组合物配制成其前药形式，等等。
并且，根据本发明一个示例性实施方式的组合物还可包含不会抑制活性成分的作用，或者补充其作用的其他成分，并且高组合物可配制成本领域已知的其他各种形式。根据本发明一个示例性实施方式的组合物优选还包含现有技术已知的血管再狭窄抑制剂如雷帕霉素或紫杉醇。
有益效果 如上所述，根据本发明一个示例性实施方式的药物组合物可用于预防常规药物洗脱支架的副作用之一即后期支架血栓形成，因为该药物组合物具有抗-再狭窄活性并且能够加速再-内皮化。
图1显示了设计用于测定异噁唑衍生物对β-联蛋白活性的作用的基因结构。
图2是显示细胞系筛选系统的构想图，构建该系统来评价异噁唑衍生物对β-联蛋白活性的作用。
图3显示了采用Wnt/β-联蛋白信号转导的激动剂氯化锂来确定图2所示筛选系统的作用的结果。
图4显示了当用各种浓度的异噁唑衍生物处理HEK293细胞时，根据采用人β-联蛋白抗体的蛋白质印迹实验确定的细胞中β-联蛋白蓄积量的结果。
图5显示了根据本发明一个示例性实施方式的异噁唑衍生物以及常规再狭窄抑制剂紫杉醇和雷帕霉素对内皮细胞增殖和平滑肌细胞增殖的影响。
图6显示了联用异噁唑衍生物和雷帕霉素处理各细胞时对内皮细胞增殖和血管平滑肌细胞增殖的影响。
图7显示了联用异噁唑衍生物和紫杉醇处理各细胞时对内皮细胞增殖的影响。
图8显示了根据本发明一个示例性实施方式的各种异噁唑衍生物对内皮细胞增殖的影响。
图9显示了根据本发明一个示例性实施方式的各种异噁唑衍生物对内皮细胞增殖的影响。
图10显示了根据本发明一个示例性实施方式的各种异噁唑衍生物对内皮细胞增殖的影响。
图11显示了采用大鼠颈动脉损伤模型，联用异噁唑衍生物和雷帕霉素处理各细胞时对再狭窄抑制的影响。
图12显示了采用大鼠颈动脉损伤模型，根据本发明一个示例性实施方式的各种异噁唑衍生物对再-内皮化的影响。
图13显示了采用大鼠颈动脉损伤模型，联用异噁唑衍生物和雷帕霉素处理各细胞时对再内皮化的影响。
图14显示了采用猪冠状动脉支架模型，根据本发明一个示例性实施方式的异噁唑衍生物对再狭窄抑制的影响。
图15显示了采用猪冠状动脉支架模型，根据本发明一个示例性实施方式的异噁唑衍生物对再-内皮化的作用。
最佳实施方式 下面将更详细地描述本发明的示例性实施方式。然而，应理解这些描述只是优选的实施例，仅仅是为了解释说明而不构成对本发明范围的限制。
制备实施例1制备5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺 通过以下方案2所示途径制备5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺(衍生物1)。下面将更详细地描述各个反应步骤。
方案2
1)步骤1制备4-呋喃-2-基-2，4-二氧代-丁酸乙酯 0℃，向乙醇钠(6.81克)的无水乙醇(200毫升)溶液中缓慢加入2-乙酰基呋喃(5.01毫升)。将所得溶液在0℃搅拌2小时，并将草酸二乙酯(9.30毫升)缓慢加入该溶液中。所得溶液搅拌18小时，用1N盐酸溶液淬灭反应。所得混合物减压浓缩，然后用二氯甲烷萃取残留物。有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，然后减压浓缩，得到10.0克4-呋喃-2-基-2，4-二氧代-丁酸乙酯。该浓缩物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
1H-NMR(丙酮-d6，200MHz)，ppm(δ)8.02～7.99(m，1H)，7.62～7.55(m，1H)，6.98～6.94(m，1H)，6.83～6.77(m，1H)，4.40(q，2H)，1.38(t，3H) 2)步骤2制备5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸乙酯 将4-呋喃-2-基-2，4-二氧代-丁酸乙酯(10.0克)和羟胺盐酸盐在EtOH中的悬浮液在85℃搅拌2小时，所得混合物减压浓缩。将浓缩物溶解于二氯甲烷和蒸馏水中，分离有机相。有机相用无水硫酸钠干燥，硅胶垫过滤，然后减压浓缩，得到8.01克5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸乙酯(产率77％)。该浓缩物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
1H-NMR(丙酮-d6，200MHz)，ppm(δ)7.90～7.86(m，1H)，7.20(d，1H)，7.00(s，1H)，6.77～6.73(m，1H)，4.45(q，2H)，1.41(t，3H) 3)步骤3制备5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸 向5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸乙酯(4.14克)在THF(130毫升)和甲醇(25毫升)的溶液中缓慢加入1N氢氧化锂水溶液(80毫升)。所得混合物搅拌15小时，然后减压浓缩。剩余溶液用1N盐酸酸化形成固体，过滤该固体，用蒸馏水洗涤，干燥后得到3.22克白色固体5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(产率90％)。
1H-NMR(丙酮-d6，200MHz)，ppm(δ)7.90～7.86(m，1H)，7.19(d，1H)，7.00(s，1H)，6.77～6.73(m，1H) 4)步骤4制备5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺(衍生物1) 向5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(7毫克)和3-咪唑-1-基-丙胺(0.005毫升)的DMF溶液中加入HOBt(8毫克)、EDC(9毫克)和TEA(0.014毫升)。所得溶液在室温下搅拌18小时，然后减压浓缩。所得浓缩物用制备型HPLC纯化，得到4毫克5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺(产率35％)。
1H-NMR(丙酮-d6，200MHz)，ppm(δ)8.16(bs，1H)，7.86～7.84(m，1H)，7.65～7.61(m，1H)，7.19～7.12(m，2H)，6.97～6.89(m，2H)，6.78～6.71(m，1H)，4.18(t，2H)，3.48(q，2H)，2.24～2.07(m，2H)准确质量(理论值)286.11LC-MS(ESI+)m/e(M+1)+287 根据与异噁唑衍生物1相同的合成方式制备以下衍生物2-70，只是使用合适的原料。下表1列出了NMR结果。
表1
表1-续
表1续
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下面测试了制备实施例中合成的上述化合物对再狭窄抑制的影响。
实验实施例1用细胞系验证Wnt/β-联蛋白信号转导的活性物质 (1)利用细胞系构建wnt/β-联蛋白信号转导活性的测试系统 采用两种类型的人癌症细胞系HEK293和SW480来鉴定根据本发明一个示例性实施方式的化合物的体外活性。在这里，前者代表Wnt信号转导途径完整的细胞系，后者代表Wnt信号转导途径组成型上调的细胞系(APC基因突变)。
为了确定在各癌症细胞系中wnt/β-联蛋白信号转导的活性，本发明者将图1所示的基因引入细胞，该基因具有结合β-联蛋白的Tcf/Lef转录调节蛋白的结合位点(5X TCF)，并具有萤火虫荧光蛋白质萤火虫萤光素酶)作为标记物，用于确定Tcf/Lef转录调节蛋白的活性。然后，本发明者通过以下方式构建细胞基Wnt激动剂筛选系统用G418处理引入基因的细胞以获得细胞系单克隆，由于引入所述基因导致该细胞连续表达Tcf/Lef转录调节蛋白。然后，本发明者进行基于细胞的筛选，如图2所示，用筛选系统测定荧光蛋白表达量，间接确定β-联蛋白活性。
在细胞基Wnt激动剂筛选系统中用氯化锂(LiCl)(阳性对照)处理制备的细胞系作为对照用于确定根据本发明一个示例性实施方式的异噁唑衍生物的Wnt激动剂活性时，测定荧光蛋白的表达水平并在图3中作图绘制。
(2)异噁唑衍生物wnt/β-联蛋白信号转导活性的测定 将构建细胞基Wnt激动剂筛选系统的细胞系在RPMI 1640(SW480)或DMEM(HEK293)培养液(包含用青霉素-链霉素(100单位/毫升)处理和热处理灭活的胎牛血清)中以标准培养条件(5％CO2，37℃，100％相对湿度(RH))进行培养。然后，用胰蛋白酶消化和吹打制备单细胞悬液。用相同的培养液稀释单细胞悬液直到细胞数量为8,000-15,000个细胞/孔，转移至96-孔微量培养板。培育24-小时后，用各种浓度的制备实施例中制备的异噁唑衍生物处理细胞。培育24-小时之后，用萤光素酶分析试剂盒(普洛麦格公司(Promega)，美国)测定异噁唑衍生物的活性。根据说明书进行评价试验，表2-3中列出了制备实施例中制备的异噁唑衍生物的活性。使用已知对Wnt信号转导具有激动作用的氯化锂(LiCl，20mM)作为对照，以百分比表示相对于氯化锂激动作用的相对值。
表2 HEK293细胞系中异噁唑衍生物对β-联蛋白活性的作用
表3 SW480细胞系中异噁唑衍生物对β-联蛋白活性的作用
实验实施例2通过测定β-联蛋白的蓄积量体外验证异噁唑衍生物对Wnt/β-联蛋白信号转导活性的作用 将HEK293细胞系在DMEM培养液(包含用青霉素-链霉素(100单位/毫升)处理和热处理灭活的胎牛血清)中以标准培养条件(5％CO2，37℃，100％RH)进行培养。测试化合物溶解于二甲亚砜(DMSO)，最终使用浓度30或60μM。将HEK293细胞(3×107)分别在包含测试化合物的培养液以及不含测试化合物的培养液中培养24小时。为了选择性分离HEK293细胞的胞质，用高浓度盐溶液处理HEK293细胞使细胞裂解，并以200g的转速离心所得细胞悬液10分钟。然后，去除细胞核和膜的沉淀，回收上清液。
所得胞质溶液在10％PAGE凝胶中电泳，然后用β-联蛋白抗体(昂斯特生物科技有限公司(Upstate Biotechnology Inc.))进行探测。采用化学发光系统(ECL，安玛西亚(Amersham))进行该探测。使用肌动蛋白作为对照来比较等量的蛋白质。结果见图4。如图4所示，蛋白质印迹试验证实，用化合物处理细胞时，根据化合物的浓度，β-联蛋白在细胞中蓄积。
实验实施例3异噁唑衍生物对内皮细胞增殖和平滑肌细胞增殖的体外试验 (1)内皮细胞增殖试验 将3-10代的HUVEC(人脐静脉内皮细胞，美国坎布莱公司(Cambrex))细胞系在EGM2(内皮生长培养基，美国坎布莱公司)培养液中以标准培养条件(O2 95％，5％CO2，37℃，100％RH)进行培养。将1×104个细胞分到24-孔板中，培养1天使细胞在24孔板中贴壁。为使细胞进入分裂间期，用PBS洗涤细胞三次，用包含1％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂(美国吉布科公司(Gibco，US))的EBM2(内皮基础培养基，坎布莱公司)替换EGM2培养液，细胞培养1天。弃去用过的培养液之后，将补充有药物的包含1％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂(吉布科公司)的EBM2溶液加入细胞，然后将该细胞溶液培养2天。细胞培养之后，显微镜下观察细胞形态。然后，利用胰蛋白酶使细胞脱离培养板，用血球计计数。使用溶解在盐水中的0.1％DMSO作为运载体对照。
(2)血管平滑肌细胞增殖试验 将3-10代的SMC(大鼠主动脉平滑肌细胞)细胞系在包含5％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂(美国吉布科公司)的SmGM(平滑肌细胞生长培养基，美国坎布莱公司(Cambrex))培养液中以标准培养条件(O2 95％，5％CO2，37℃，100％RH)进行培养。将2×104个细胞分到24-孔板中，培养1天使细胞在24孔板中贴壁。细胞用PBS洗涤三次，置于包含5％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌剂(吉布科公司)的SmGM溶液中，培养1天。弃去用过的培养液之后，将补充有相应药物的包含5％胎牛血清的SmGM溶液加入细胞，然后将该细胞溶液培养2天。细胞培养之后，显微镜下观察细胞形态。然后，利用胰蛋白酶使细胞脱离培养板，用血球计计数。使用溶解在盐水中的0.1％DMSO作为运载体对照。
(3)结果 图5-10分别显示了测试结果。如图5所示，揭示了用提高浓度的抗狭窄药物处理细胞时，常规抗狭窄药物紫杉醇和雷帕霉素能抑制HUVEC的增殖，但根据本发明一个示例性实施方式的衍生物5能提高或维持HUVEC的增殖。并且，还观察到，随着根据本发明一个示例性实施方式的衍生物5的浓度的升高，在包含5％胎牛血清和1％抗生素抗真菌剂(美国吉布科公司)的SmGM(平滑肌细胞生长培养基，Cambrex)中以标准培养条件(95％O2，5％CO2，37℃，100％RH)培养的血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞数减少。并且，如图6所示，揭示了当本发明化合物与常规药物“雷帕霉素”联用时内皮细胞的增殖恢复，而仅用雷帕霉素处理时内皮细胞的增殖被抑制。并且，观察到雷帕霉素与本发明化合物联用比单用雷帕霉素对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用更加显著。类似地，如图7所示，观察到当常规药物“紫杉醇”与本发明化合物联用时内皮细胞的增殖恢复，而仅用紫杉醇处理时内皮细胞的增殖被抑制。
除了衍生物5之外，还测定了衍生物4、19、23、31、35、50、62、63、68、69和70对内皮细胞增殖的影响。结果揭示，本发明化合物能够抑制或维持内皮细胞的增殖，如图8-10所示。因此，揭示了本发明中使用的化合物是能够有效防止或治疗再狭窄的药物，因为该化合物能够抑制平滑肌细胞的增殖并提高内皮细胞的增殖。
实验实施例4大鼠颈动脉损伤模型中异噁唑衍生物对再狭窄的抑制作用 采用大鼠颈动脉损伤模型测定异噁唑衍生物对再狭窄抑制的影响。
重350-400克的白鼠用氯胺酮和二甲苯麻醉，其外科手术区域刮毛并用聚维酮碘消毒。在颈部皮肤上切开约2厘米的切口，用蚊式止血钳(mosquito)找出大鼠颈动脉。在颈动脉和颈内动脉上设置丝线(thread)阻断血流，然后用丝线结扎颈外动脉。将2F forgarty导管(美国霸司特(Baxter，US))插入颈外动脉和颈动脉之间的血管，损伤颈动脉区域三次。然后，用丝线结扎受损的颈动脉区域以允许血流通过颈动脉和颈内动脉，防止颈动脉和颈外动脉之间的出血，并用缝线缝合手术区域。在颈部后侧皮肤上切开约1厘米，将含药渗透泵插入血管并用缝线缝合。1周后观察内皮细胞并在2周后观察再狭窄，用灌注法抽去各个大鼠的所有血液，从大鼠获取颈动脉，制备其组织切片以观察其血管切片。用衍生物5(SKL-2020)作为实验组，用75％DMF(二甲基甲酰胺)(DMF∶H2O＝3∶1)作为运载体对照。实验结果如图11所示。如图11和图13所示，揭示了与不给予衍生物5相比，给予200微克/千克/天衍生物5两周后血管再狭窄面积更加显著地降低。并且，认为由于联用本发明化合物与雷帕霉素比单用本发明化合物具有更加显著的再狭窄抑制作用，所以根据本发明一个示例性实施方式的化合物与常规再狭窄抑制剂联用时具有协同作用。
实验实施例5大鼠颈动脉损伤模型中异噁唑衍生物处理后再内皮化的观察 为了观察药物对再内皮化水平的影响，用0.1％过氧化氢酶处理血管组织切片以去除内源性过氧化物酶，并在4℃与vWF(血管假性血友病因子，美国DC公司(DakoCytomation，US))Ab反应以便对小鼠内皮细胞进行染色。然后，用生物素化的抗-大鼠IgG(美国杰生免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch Laboratories))处理组织切片，用亲和素-生物素复合物(ABC)-过氧化物酶试剂盒(Elite试剂盒，载体实验室(Vector Laboratories))染色。显微镜下观察组织切片并拍照。用衍生物5作为实验组，用75％DMF(二甲基甲酰胺)(DMF∶H2O＝3∶1)作为运载体对照。实验结果如图12和图13所示。如图12所示，揭示了与不给予衍生物5相比，给予200微克/千克/天衍生物5两周后受损颈动脉表面发生更显著的再内皮化。如图13所示，认为由于联用本发明化合物与雷帕霉素比单用本发明化合物能更显著地加快再内皮化过程，所以根据本发明一个示例性实施方式的化合物与常规再狭窄抑制剂联用时具有协同作用。
实验实施例6猪冠状动脉支架模型中异噁唑衍生物对再狭窄抑制的影响 采用猪冠状动脉支架模型测定异噁唑衍生物对再狭窄抑制的影响。
外科手术一周前，用抗血栓药“氯吡格雷”(35毫克/天)和阿司匹林(100毫克/天)处理所有接受外科手术的猪。重30-40千克的猪用氯胺酮(20毫克/千克IM)和赛拉嗪(2毫克/千克IM)麻醉，耳静脉连接灌注设备并且根据麻醉状态将氯胺酮/赛拉嗪溶液(氯胺酮50克+赛拉嗪10克/500毫升盐水)输入耳静脉以维持其麻醉状态。猪外科手术区域刮毛，用聚维酮碘消毒。在颈部皮肤上切开约5厘米，用蚊式止血钳(mosquito)找出猪颈动脉，将1毫升肝素(5,000IU)给予猪。用SIREMOBIL 245B心血管造影装置(西门子公司(Siemens)销售)进行心血管造影。用支架(直径3.0mm；长度15mm)对LAD、RAD和RCX进行手术，即先用成像设备确定支架植入位置，以支架静脉直径1.3∶1的比率扩张支架。
28天后，在常规麻醉条件下用KCl(40毫当量/升)静脉内注射猪以诱导猪心脏停搏，切除猪的心脏。切除猪心脏后立即用稀释1毫升肝素(5000IU)制备的500毫升生理盐水灌注猪心血管，并通过灌注500毫升10％的福尔马林溶液固定。然后，将整个猪心脏浸没到用生理盐水缓冲的10％福尔马林溶液中进行固定。切除植入支架的LAD、RAD和RCX血管区域，用10％福尔马林溶液固定1天，用乙醇脱水，然后用甲基丙烯酸甲酯包埋1个月。包埋之后，用激光切割机将猪血管切割成10微米长度，用砂纸摩成5-7微米的大小，然后在光学显微镜下观察以确定再狭窄的存在。在该实验中，用PLGA聚合物涂覆的不含药物的支架作为阴性对照，除PLGA外包含雷帕霉素的支架用作阳性对照。包含180微克雷帕霉素和含量递增(45微克、90微克和180微克)的衍生物5的混合物的支架作为实验组。
实验结果如图14所示。如图14所示，揭示了与阴性对照相比，雷帕霉素处理组中血管再狭窄面积从2.74mm2显著降低至1.80mm2，还证实与雷帕霉素处理组相比，衍生物5处理组中血管内腔损失进一步降低。
实验实施例7猪冠状动脉支架模型中异噁唑衍生物处理后再内皮化过程的观察 为了观察药物对再内皮化水平的影响，猪血管组织切片在4℃与vWF(血管假性血友病因子，美国DC公司(DakoCytomation，US))Ab反应以便对小鼠内皮细胞进行染色。然后，用生物素化的抗-人IgG(美国杰生免疫研究实验室(Jackson Immuno Research Laboratories))处理组织切片，用亲和素-生物素复合物(ABC)-过氧化物酶试剂盒染色。荧光显微镜下观察组织切片并拍照。实验结果如图15所示。
如图15所示，揭示了用聚合物涂覆支架时，再内皮化率(愈合％)为80.2％，但用雷帕霉素处理时再内皮化率(愈合％)下降至67.9％。证实，给予猪衍生物5后四周，受损颈动脉表面再内皮化过程显著恢复至用雷帕霉素处理细胞的水平。认为当根据本发明一个示例性实施方式的化合物与常规再狭窄抑制剂联用时，该化合物能够通过抑制副作用导致的再内皮化过程减缓来防止后期支架血栓形成。
权利要求
1.一种用于预防和治疗再狭窄的药物组合物，所述组合物包含治疗有效量的下式I所代表的异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐
式1
式中，R1是用至少一个取代基取代或未取代的苯基、呋喃基或噻吩基，所述取代基选自下组酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基和胍基，
m是2或3，
A是键、O、S、SO或S(＝O)2，和
R2是用至少一个取代基取代或未取代的咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基或吡啶基，所述取代基选自下组酰基、氨基、烷氧羰基、羧基、羧基氨基、-O-氨甲酰基(-O-(C＝O)-NH2)、氰基、卤素、羟基、硝基、硫代、烷基、环烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、硫氧基和胍基。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述异噁唑衍生物选自以下化合物(1)-(70)
(1)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(2)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-2-基-乙基)-酰胺
(3)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺
(4)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺
(5)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺
(6)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(2-甲基-咪唑-1-基)-乙基]-酰胺
(7)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(5-甲基-咪唑-1-基)-乙基]-酰胺
(8)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(4-甲基-咪唑-1-基)-乙基]-酰胺
(9)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(10)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺
(11)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(12)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-2-基-乙基)-酰胺
(13)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-四唑-2-基-乙基)-酰胺
(14)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-四唑-1-基-乙基)-酰胺
(15)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[3-(2-甲基-咪唑-1-基)-丙基]-酰胺
(16)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-吡唑-1-基-丙基)-酰胺
(17)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，3]三唑-1-基-丙基)-酰胺
(18)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，3]三唑-2-基-丙基)-酰胺
(19)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]三唑-1-基-丙基)-酰胺
(20)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-四唑-1-基-丙基)-酰胺
(21)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-四唑-2-基-丙基)-酰胺
(22)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[3-(4-甲基-咪唑-1-基)-丙基]-酰胺
(23)5-苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(24)5-苯基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺
(25)5-邻甲苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(26)5-间甲苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(27)5-对甲苯基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(28)5-(2-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(29)5-(3-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(30)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(31)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]三唑-1-基-丙基)-酰胺
(32)5-(2-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺
(33)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺
(34)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺
(35)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(36)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-2-基-乙基)-酰胺
(37)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(38)5-(4-氟-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-四唑-2-基-乙基)-酰胺
(39)5-(4-氯-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]三唑-1-基-丙基)-酰胺
(40)5-(4-氯-苯基)-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(41)5-(4-氯-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(42)5-(2-甲氧基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(43)5-(3-甲氧基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(44)5-(4-甲氧基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(45)5-(3-硝基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(46)5-(4-硝基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(47)5-(3-氨基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(48)5-(4-氨基-苯基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(49)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(50)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]-三唑-1-基-丙基)-酰胺(51)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺
(52)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡唑-1-基-乙基)-酰胺
(53)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(54)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-2-基-乙基)-酰胺
(55)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，3]三唑-1-基-乙基)-酰胺
(56)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-3-基-乙基)-酰胺
(57)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸(2-吡啶-4-基-乙基)-酰胺
(58)5-(5-溴-噻吩-2-基)-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(59)5-呋喃-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(60)5-呋喃-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]-三唑-1-基-丙基)-酰胺
(61)5-呋喃-3-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]-三唑-1-基-乙基)-酰胺
(62)5-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-[1，2，4]-三唑-1-基-丙基)-酰胺
(63)5-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(3-咪唑-1-基-丙基)-酰胺
(64)5-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(2-咪唑-1-基-乙基)-酰胺
(65)5-噻吩-3-基-异噁唑-3-羧酸(2-[1，2，4]-三唑-1-基-乙基)-酰胺
(66)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(吡啶-2-基-氧基)-乙基]-酰胺
(67)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(吡啶-2-基-氧基)-乙基]-酰胺
(68)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(1-甲基-1H-四唑-5-基-硫烷基)-乙基]-酰胺
(69)5-噻吩-2-基-异噁唑-3-羧酸[3-(4H-[1，2，4]三唑-3-基-硫烷基)-丙基]-酰胺
(70)5-呋喃-2-基-异噁唑-3-羧酸[2-(4-甲基-4H-[1，2，4]三唑-3-磺酰基)-乙基]-酰胺
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含雷帕霉素或紫杉醇。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，使用所述组合物来预防和治疗选白下组的疾病经皮穿刺冠状动脉成形术(PTCA)后导致的冠状动脉再狭窄、大脑或外周血管疾病经皮干预后导致的再狭窄、各种血管手术后导致的血管狭窄、搭桥手术和动静脉瘘血管成形术后导致的血管狭窄、自体血管和人造血管移植后导致的狭窄以及动脉粥样硬化。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含适用于配制成口服制剂、胃肠外制剂、可注射制剂或经皮制剂的药学上可接受的载体。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物以支架涂覆试剂的形式经胃肠外局部给予。
7.一种预防后期支架血栓形成的方法，所述方法包括给予患者权利要求1所述的药物组合物以提供抗-再狭窄活性和加速再内皮化。
全文摘要
提供了用于防止和治疗再狭窄的包含异噁唑衍生物的药物组合物。药物组合物包含治疗有效量的式1所代表的异噁唑衍生物或其药学上可接受的盐。由于该药物组合物具有抗再狭窄活性并能加速再内皮化过程，所以该药物组合物可用于预防和治疗血管再狭窄。
文档编号C07D413/12GK101778845SQ200880103513
公开日2010年7月14日 申请日期2008年6月30日 优先权日2007年6月29日
发明者黄善宽, 崔相洛, 赵政宇, 裵成镇, 具胎成, 李素英, 赵庆哲, 权铉哲 申请人:Sk株式会社