专利名称：一种培育单穗粒数或主穗粒数增多的转基因植物的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种培育单穗粒数或主穗粒数增多的转基因 植物的方法。
背景技术：
旱稻是水稻的一个变种，由水生变为旱生。在旱作土，特别是碱性的旱作土，铁、锌 等微量元素的有效性非常低，成为影响旱稻等作物生长发育及产量的限制因素。旱稻栽培 有悠久的历史，但由于传统的旱稻品种品质差，产量低等特点使其种植面积较小。经过育种 家的选育，新型旱稻品种在品质和产量方面虽已有明显改进，但从审定公告看，各旱稻品种 的亩产大致在300 350公斤左右，其产量潜力远不及目前生产上常用的水稻品种。因此， 提高单位面积产量是旱稻的主要育种目标。旱稻产量由每亩穗数，穗粒数和千粒重三者构 成，通过遗传育种或生物技术改良旱稻的产量构成三因素中的任何要素(如穗粒数)都可 实现增产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培育转基因植物的方法。本发明提供的培育转基因植物的方法，是将如下a)或b)蛋白的编码基因导入目 的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物与所述目的植物相比，单穗粒数、主穗粒数和/ 或饱粒数增多a)序列表中序列3所示蛋白；b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过 一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗粒数相关的由a)衍生的 蛋白质。进一步，上述序列表中序列3所示蛋白的编码基因是序列表中序列1所示的基因。进一步，上述序列表中序列1所示的基因可以是通过重组表达载体导入目的植物 中的；上述重组表达载体是将序列表中序列2所示的启动子以及序列表中序列1所示的 基因分别插入载体PCAMBIA1381的BamH I、Pst I酶切位点间和Nco I、Spe I酶切位点间 构成的重组表达载体。上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。上述目的植物为旱稻，优选为旱稻297。实验证明2008年大田栽培下，转基因株系单株及主穗上的穗粒数及饱粒数确显 著高于野生型(图12e)。2009年重复试验中，转基因阳性株系单株及主穗上的平均穗粒数 及饱粒数(除转基因系Line85在单株平均穗粒数上并未与野生型有差异)，其他株系都显 著高于野生型旱稻297 (图15f，g)，该结果连续两年一致。
图1为重组载体的获得，重组载体的构建是以pCAMBIA系列载体pCAMBIA1381作为转化载体的骨架，以潮霉素作为筛选标记，以旱稻受低铁诱导基因OsIRTl (Ishimaruet al.，2006)的启动子来启动目标基因LeFER转录。图2为农杆菌转化再生旱稻植株的Southern验证，上图为BamH I酶切图谱，下图 为Pst I酶切图谱，数字表示不同再生植株编号，表示阴性对照，即为野生型旱稻297，+ 表示阳性对照，即为转化所用的质粒载体(没有经过酶切)。图3为转基因阳性株系与野生型旱稻297在低铁浓度(1 μ Μ)培养条件下处理两 周后根部的Northern杂交分析。第一泳道为野生型旱稻297，其余五道分别为五个不同的 转基因阳性株系。图4为转基因阳性株系与野生型旱稻297在低铁浓度(1 μ Μ)培养条件下处理两 周后根部组织的Western验证，第一泳道为野生型旱稻297，其余四道分别为四个不同的转 基因阳性株系。图5为转基因株系与野生型发芽一周后种子根上一级侧根及侧根原基观察，(a) 为整个种子根的全长，(b)为距根尖4. 1-根基部的位置，(c)为距根尖2. 1-4厘米的部位， (d)为距根尖0-2厘米的部位，bar = 2mm。图6为转基因株系与野生型旱稻发芽早期种子根上侧根发育情况(a)为选取发 芽5天及7天两个时间点统计的种子根上一级侧根及侧根原基数目；(b)为选取发芽7天 的不同转基因株系与野生型旱稻297种子根上的不同部位分段统计一级侧根及侧根原基 数目。图7转基因株系苗期低铁水培表型，(a)为正常水培与低铁水培四周后地上部表 型；(b)为处理四周后叶色比较；(c)为处理四周后地下部表型。图8野生型与转基因株系低铁水培一个月内的各种生理指标测量，(a)为每隔两 周进行一次株高的测量；(b)为每隔一周进行一次相对叶绿素含量的测量；(c)和(d)为植 株在低铁处理第四周时进行的叶片元素含量的测定。图9低铁浇灌一个月石英砂培根系观察，其中HD297-l、HD297-2是野生型旱稻297 的两个植株。Line87-l、Line87-2是转基因株系Line87的两个植株。图10根系土壤栽培套管试验(a)为全植株及地上、地下部整体观察；(b)为野生 型和一个转基因株系植株完整根系观察；(c)为野生型和一个转基因株系单株平均根部干 重的比较。图11转基因株系T2代在大田碱性土壤中抽穗早期倒一叶和倒二叶的各项元素含 量测定结果，(a)为叶片中微量元素铁、锰、锌的含量；(b)为叶片中大量元素磷、钾、钙、镁 的含量；bar表示数据平均值士SE，星号表示转基因株系所测数据的统计结果在ρ < 0. 05 的条件下与野生型旱稻297相比差异显著。图12转基因株系T2代在大田正常土和碱性土壤中成熟期考种结果，(a)-(e)分 别是株高，单株与主穗的平均穗长，千粒重，总分蘖数与有效穗数，单株与主穗的穗粒数与 饱粒数的统计结果(η = 10) ；bar表示数据平均值士SE，星号表示转基因株系所测数据的 统计结果在ρ < 0. 05的条件下与野生型旱稻297相比差异显著。图13野生型旱297与转基因株系T3代在大田土壤中的生长情况，(a)为分蘖期 的旱稻297与转基因系Line40 ； (b)为孕穗期的旱297与转基因株系Line40 ； (c)为齐穗期 的野生型旱稻和转基因系。
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图14野生型旱297与转基因株系T3代在大田栽培中的生长指标(a)为植株倒 一叶与倒二叶在四个生长时期相对叶绿素含量的测量(η = 30) ； (b)-(e)为与叶片光合作 用和水分相关的生理指标，依次为净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度在倒一 叶与倒二叶中不同生长时期的测量统计结果(η = 15)。图15转基因株系Τ3代在大田土壤中成熟期考种结果，(a)-(g)分别为株高，主穗 平均长度，平均结实率，千粒重，总分蘖数及有效分蘖数，主穗的平均穗粒数，每穗的穗粒数 的统计结果(η = 40)，(h)是三个小区平均的籽粒重和草重，(每个小区为一平方米)，(i) 是由三个小区平均产量推测出的亩产。bar表示数据平均值士SE，星号表示转基因株系所 测数据的统计结果在ρ < 0. 05的条件下与野生型旱稻297相比差异显著。其中，图2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14 和 15 中HD297 是野生型旱稻 297 ； Line7、Line9、Line40、Line85、Line87 是不同转基因株系。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、转基因植物的获得及其检测一、转基因植物的获得1、目标基因的获得制备如下的引物对引物 1 (正向引物)5，-CCATGGATGGAAAATAATAATGTTAATGATATTG-3，；引物 2 (反向引物)5，-ACTAGTTTAGACCAACGGAGATGTC-3，。以低铁(0. 1 μ Μ)水培(Hoagland培养液)处理三天的番茄(品种是Moneymaker) (英国的Thompson & Morgan(Group)有限公司)根部的cDNA为模板，以上述的引物对进行 PCR扩增，测序结果表明扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，命名为LeFER，可 编码序列3所示的蛋白。2、重组载体的获得如图1所示，重组载体的构建是以pCAMBIA系列载体pCAMBIA1381 (购自 Clonetech公司)作为转化载体的骨架，以潮霉素作为筛选标记，以旱稻受低铁诱导基因 OsIRTl (Ishimaru et al. ,2006)的启动子来启动目标基因LeFER转录。具体构建过程如下制备出扩增OsIRTl启动子的正向引物 5，-CGCCATTGGAATGATTCTTCT-3，，反向引物5，-CGTTCGTACACCACACTGGATTTTG-3，，用该引物 对从旱稻297 (北京北农睿丰农业科技有限公司)中扩增出长度为1694bp的OsIRTl启动 子(核苷酸序列如序列表中序列2所示)，再将该启动子以BamH I和Pst I两个限制性内 切酶位点按图1中方向连入载体PCAMBIA1381，并且将步骤1得到的LeFER以Nco I和Spe I两个限制性内切酶位点连入载体PCAMBIA1381。经检测构建正确的重组表达载体命名为 pCAMBIAl38I-LeFER03、将步骤2的重组载体导入旱稻中获得转基因旱稻将步骤2得到的重组表达载体pCAMBIA1381_LeFER利用农杆菌介导 的转基因方法引入到旱稻297基因组中，在经过PCR初步验证后(正向引物为5，-CAAAGGCACGAGGACTGAC-3，，反向引物为 5，-GCCAAAGTTTATGTCCACC-3，)，分别提取 18 个 转基因株系TO代和野生型旱稻297的叶片DNA，以PCR验证时的引物对扩增出来的约500bp 的LeFER片段为探针进行Southern杂交，显示外源FER基因整合到旱稻基因组中(图2)。 18个再生阳性植株中出现5不同的杂交带型，推测这18个转化株系可能是从5个独立转化 再生而来。进一步将18 个阳性株系中的 5 个株系(Line7、Line9、Line40、Line85、Line87) 和野生型旱稻297在低铁浓度(1 μ Μ)条件下培养两周后，提取根部的总RNA，以Southern 杂交时所用的探针进行Northern杂交，分析证实外源基因LeFER在转基因旱稻中在RNA水 平上得以表达(图3)。同时提取以上相同处理的4个转基因阳性株系(Line7、Line40、Line85、Line87) 和野生型旱稻297的根部总蛋白，以LeFER蛋白全长制备的兔源一抗，以辣根过氧化物酶标 记(HRP)的山羊抗兔的二抗进行Western杂交，结果表明外源蛋白LeFER在转基因旱稻中 在蛋白水平上得以表达(图4)。内标蛋白采用鼠源的β-TUBLIN为一抗，以辣根过氧化物 酶标记(HRP)的山羊抗鼠的二抗进行Western杂交。Tl代表示TO代转基因株系自交产生的种子及由它所长成的植株，T2代表示Tl代 株系自交产生的种子及由它所长成的植株，收集纯合的T2代纯系(Line7、Line40、Line87) 进行下面步骤二的1-4的实验。二、转基因旱稻的检测1、水培条件下的生长情况1)水培条件下的根系观察将转基因株系(Line7、Line40、Line87)和野生型旱稻297的种子在黑暗培养条件 下进行萌发(26°C)，用四唑氮蓝对旱稻种子根进行染色，观察侧根形成。选取了发芽早期 的两个时间点即发芽5天和发芽7天分别统计(样本数大于20个单株)转基因株系与野 生型旱稻种子根上的一级侧根及侧根原基数。无论是在发芽5天还是发芽7天，转基因阳 性株系种子根上的一级侧根及侧根原基数目都显著多于野生型旱稻297 (图5，图6)。进而对转基因阳性株系在发芽第7天的时候，其种子根上的一级侧根数目比野生 型旱稻297有明显的提高，一级侧根的长度也比野生型长(图5a)。进一步将种子根每间隔 2厘米分段，用莱卡体式镜进行观察，在距根尖0-2厘米处(图5b)，转基因阳性株系与野生 型的种子根上的侧根原基数都较少，但相比之下转基因株系的侧根原基要多一些；在距根 尖2. 14厘米处(图5c)，转基因阳性株系种子根上的一级侧根及侧根原基数目远远多于野 生型；同样这种情况在距根尖4. 1-根基部的位置上(图5d)也可以看到，并且在该部位还 可以看到转基因株系种子根上发育的一级侧根长度明显的长于野生型。2)水培条件下的低铁耐受性检测FER是番茄基因组中控制铁吸收和缺铁响应的关键调控基因。因此，也观察了转基 因株系的低铁耐受性。将转基因株系与非转基因旱稻发芽，在用木村营养液(溶剂是水，溶质如表1所 示)水培两周后，挑选长势一致的幼苗进行正常水培处理及低铁水培处理(正常水培处理 中的营养液是含40 μ M铁的木村营养液，其他元素浓度不变得到的溶液；低铁处理的营养 液是指将木村营养液中的铁浓度降低为ι μ Μ，其他元素浓度不变得到的溶液)，四周后比较其转基因株系的低铁胁迫耐受性。
表1.木村营养液的溶质 *Fe-EDTA 溶液溶解 5. 57g FeSO4 ·7Η20 于 200ml 蒸馏瓶内，溶解 7. 45gNa2EDTA 于 200ml蒸馏水。加热FeSO4 · 7H20溶液，加入Na2EDTA溶液不断搅拌。冷却后，定量到IL的 容量瓶中(2OmM FeEDTA)。如图7所示，四周后转基因株系无论是地上部还是地下部的长势均好于野生型， 不仅株高比野生型高，根长及根的数量都多于野生型，且叶色也比野生型绿很多，说明转基 因株系更能耐受缺铁，叶片失绿不严重。对野生型及转基因系进行一个月的低铁(1 μ Μ)处理(低铁处理的营养液是指将 木村营养液中的铁浓度降低为1 μ Μ,其他元素浓度不变得到的溶液)，每隔两周对株高进 行观测，在低铁处理的一个月内，转基因系的株高一直比野生型高，尤其是随着处理时间的 延长，这种优势更加明显(图8a)。同样每隔一周对叶片相对叶绿素含量进行测量，在低铁 处理一周时，转基因株系与野生型的SPAD-Value值都有大幅度降低，野生型下降得更为明 显；当低铁处理两周以后，转基因阳性株系的叶片的相对叶绿素含量开始恢复，直到低铁处 理第四周时，转基因株系已经比对照的SPAD-Value值有显著提高，叶色也绿很多(图8b)。 进而在低铁处理第四周时，分别对野生型及转基因系取材，进行叶片元素含量的测定，如图 8c, d所示，转基因株系叶片中的二价金属离子含量，如铁、锌、锰和钙的积累都显著的高于 野生型。这也从一个侧面反映了转基因株系在低铁水培条件下根部对二价金属离子吸收能 力的增强。2、砂培条件下的根系观察由于以上的根系观察试验及统计结果都是在水培条件下进行的，为了能够更好的 模拟土壤栽培环境，首先进行了根系的砂培观察实验。在黑暗条件下(26°C )，对转基因株系(Line7、Line40、Line87)和野生型旱稻297 进行萌发，三天后置于上述的木村营养液中培养一周，然后挑选长势一致的植株(每个株 系5个单株)栽种于放有石英砂的培养罐中(每个罐栽一株)，然后用低铁木村营养液(低 铁木村营养液是指将木村营养液中的铁浓度降低为1 μ μ,其他元素浓度不变得到的溶液)浇灌植株，四周后将野生型与转基因株系的根洗净，并用惠普扫描仪对植株根部进行扫描 观察，历经一个月的低铁培养，转基因株系植株冠根上的侧根比野生型有更加密集的分布 (如图9)。3、土壤栽培条件下的根系观察用土壤套管栽培试验最大限度的模拟旱稻植株在土壤环境中的生长状态，2009年 将转基因的受体旱稻297(阴性对照)和转基因系Line40和Line87的种子直接播种在直 径为11cm，长度为240cm装有土壤的塑料管中(每根套管播种3_5粒种子)，萌发两周后每 根套管保留长势良好且一致的两株苗，按正常田间管理生长两个月，待植株处于拔节期时 分别将野生型与转基因植株的根部进行仔细的冲洗，去除土壤，然后对其进行根观察及植 株干重测量。如图10所示，转基因株系显现出发达的侧根生长现象。4、大田栽培下的生长情况2008年5月，于中国科学院遗传与发育生物学研究所农场将野生型与转基因的4 个株系分别种植在碱性大田(PH8.5)与正常大田土(pH7.3)中。1)抽穗期地上部元素含量在抽穗早期采集转基因株系与野生型(不少于10株)的倒一叶和倒二叶，于80°C 杀青烘干，用硝酸和双氧水在180°C条件下消解40分钟，用等离子光谱仪(ICP-OES)测定元 素含量，每个株系重复3次，统计结果如图11所示，在所测的几种常见元素中，转基因阳性 株系的铁、锰、锌、钙等金属元素在倒一叶和倒二叶中的含量显著高于野生型，然而磷和钾 的含量却低于野生型，镁的含量差异不显著。2)成熟期单株以及主穗上的穗粒数和饱粒数测定10月份旱稻成熟时，随机抽取各转基因阳性株系和野生型的10个单株，对其各种 基本农艺性状进行了考察，统计结果显示，在株高、穗长、分蘖数及有效分蘖数、结实率等几 项指标转基因株系与野生型之间没有显著差异(图12a_d)。但是转基因株系单株及主穗上 的穗粒数及饱粒数确显著高于野生型(图12e)。5、2009年大田土壤栽培重复试验收集T3 代纯系(Line7、Line40、Line85、Line87)进行下面的实验。2009年5月，于中国科学院遗传与发育生物学研究所农场进行大田土壤栽培试 验，每个小区为lm2，种植36株，四次重复。分蘖期、孕穗期、齐穗期和灌浆期分别测量倒一 叶和倒二叶的相对叶绿素含量与光合作用相关指标，并于成熟时每小区取10株进行单株 考种，并测定小区产量。1)相对叶绿素含量、光合作用的测定为了考察转基因株系在大田生产中的应用价值，将转基因株系(Line7、Line40、 Line85、Line87)与野生型旱稻同时种于研究所农场，在分蘖期、孕穗期抽穗期及齐穗期都 可见转基因株系地上部叶色比野生型绿(图13a，b，c)。SPAD-502测量30个单株的倒一叶 和倒二叶的相对叶绿素含量，统计结果表明所有检测转基因株系的倒一叶的相对叶绿素含 量在分蘖期、孕穗期和齐穗期均显著高于野生型；而倒二叶在孕穗期和齐穗期转基因株系 的相对叶绿素含量同样也显著高于野生型(图14a)。进一步对田间植株与光合和水分相关 的一系列指标用Licor-6400光合仪进行测量，同样选取分蘖期、孕穗期、齐穗期和灌浆期 这几个时间点分别对倒一叶和倒二叶进行测量。如图14的b、c、d和e所示，虽然倒二叶在各个取材时间点上与光合作用和水分相关的一系列指标在野生型与转基因株系间并没有 测量出差异。但是，两者倒一叶在分蘖期和孕穗期时的净光合速率和蒸腾速率都有着显著 差异，转基因株系的净光合速率和蒸腾速率比野生型显著提高；同样，在分蘖期，转基因株 系倒一叶的气孔导度也比对照有明显的增加；而胞间二氧化碳浓度在倒一叶的各取材时间 点上并没有差异。 统计结果显示，在株高、穗长、分蘖数及有效分蘖数、结实率及千粒重等几项指标， 转基因株系与野生型的差异与2008年的考种结果一致(图15a_e)。但是转基因阳性株系 单株及主穗上的平均穗粒数及饱粒数(除转基因系Line85在单株平均穗粒数上并未与野 生型有差异)，其他株系都显著高于野生型旱稻297 (图15f，g)，该结果与前一年的结果一 致。对小区产量进行称量(图15h)，可见无论是小区经济学产量，即籽粒重，还是小区草重 (除去籽粒以外的地上部分重量)，除了 Line85之外的其他转基因系都比旱297有了不同 程度的增加，并达到显著水平。
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权利要求
一种培育转基因植物的方法，是将如下a)或b)蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物与所述目的植物相比，单穗粒数、主穗粒数和/或饱粒数增多a)序列表中序列3所示蛋白；b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗粒数相关的由a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述序列表中序列3所示的蛋白的编码基 因是序列表中序列1所示的基因。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述序列表中序列1所示的基因是通过重 组表达载体导入目的植物中的；所述重组表达载体是将序列表中序列2所示的启动子以及序列表中序列1所示的基因 分别插入载体PCAMBIA1381的BamH I、Pst I酶切位点间和Nco I、Spe I酶切位点间构成 的重组表达载体。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单 子叶植物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述目的植物为旱稻。
全文摘要
本发明公开了一种培育单穗粒数或主穗粒数增多的转基因植物的方法。所述方法，是将如下a)或b)蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物与所述目的植物相比，单穗粒数、主穗粒数和/或饱粒数增多a)序列表中序列3所示蛋白；b)将序列表中序列3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物穗粒数相关的由a)衍生的蛋白质。实验证明水培条件下、砂培条件下和土壤栽培条件下，采用本发明提供的方法后，得到的转基因植物与所述目的植物相比，单穗粒数、主穗粒数和或饱粒数均显著增多。
文档编号C07K14/415GK101914551SQ20101024011
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月28日 优先权日2010年7月28日
发明者凌宏清, 赵维娜 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所