体内肿瘤血管系统成像的制作方法

专利名称：体内肿瘤血管系统成像的制作方法
体内肿瘤血管系统成像本发明涉及对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法和用途，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。在又一方面，本发明涉及在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的非侵入性方法和用途，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。另外，提供了在本发明的方法中使用的试剂盒，其包含经荧光标记的抗⑶31抗体和用于近红外荧光成像以检测受试者中的该抗体的手段。血管形成经由血管生成(vasculogenesis)和血管发生(angiogenesis)过程发生。血管生成是胚胎发育期间血管内皮细胞自前体细胞(称为成血管细胞)的重新分化。此过程与血管发生过程不同，血管发生过程是一种以自先前存在的血管萌发新血管为特征的重塑过程(Folkman 和 D，Amore，Cell 1996 ；第 87 卷1153-1155 ；Risau,Nature 1997;第386卷671-674)。始终广泛认为，血管生成仅在早期胚胎发生期间发生。最近的研究揭示了内皮祖干细胞的存在，而且已经发现这些骨髓衍生细胞掺入成人中的新血管病灶(包括受损伤的角膜、缺血性下肢和肿瘤血管系统)中，提示血管生成可以在成人中发生 (Asahara 等，Science 1997 ；第 275 卷964_967 ；Shi 等，Blood 1998 ；第 92 卷362_367)。然而，血管发生在胚胎发生期间，并且以有限的程度在成人中，例如在女性生殖系统中、在生理性伤口愈合中及在病理性疾病过程诸如癌症中发生(Klagsbrun和Moses， Chemistry&Biology 1999 ；第 6 卷217_224)。血管发生是由各种生长因子诸如血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)刺激的。对血管发生刺激因子的早期应答是蛋白酶诸如基质金属蛋白酶(MMP)家族成员对内皮细胞基底膜的降解。MMP降解胶原和其它胞外基质组分(见

图1)。破坏基底膜屏障让内皮细胞自先前存在的血管向血管生成刺激迁移并增殖(Marsh，Stem Cells 1997 ；第15卷180-189)。血管细胞粘着分子通过介导细胞-胞外基质相互作用来促成内皮细胞迁移。主要的介导物之一是整联蛋白α νβ3，即蛋白质诸如纤连蛋白的一种受体。整联蛋白α νβ3的拮抗剂抑制新血管的生长，提示细胞粘着是血管发生中的一个至关重要的步骤(Brooks等，Cell 1994 ；第79卷1157_1164)。在迁移和增殖后，内皮细胞装配成具有开放腔的管。生成成熟血管中的一个重要步骤是间充质细胞的募集及其随后分化成平滑肌细胞样周细胞，认为所述平滑肌细胞样周细胞稳定化新形成的血管系统。这些周细胞逐渐被内皮丛吸引，导致血管树的进行性覆盖(Benjamin等，Development 1998 ；第125卷 1591-1598)。在此期间，未覆盖的毛细管发生消退，这在获得周细胞包被后停止。因此，血管形成的此较晚期阶段以重塑步骤为特征，其中切除不受保护的血管，并且经周细胞覆盖的血管变得稳定，而且不太易于脱稳定化和消退。大概自内皮细胞来源衍生的血小板衍生生长因子(PDGF)募集周细胞以与内皮细胞联合，从而提高血管稳定性(Lindahl等，Science 1997 ；第277卷242-245)。图1中也显示了上文所描述的血管发生中的过程。血管生成和血管发生，特别是新血管发生是不仅在正常的发育中，而且在异常发育中诸如在肿瘤形成中发生的过程。也就是说，肿瘤细胞的增殖和存活依赖于生长因子的足够供应和毒性分子的除去。在实体组织中，例如氧可以自毛细管放射状扩散仅150至 200 μ HIo
在距离超过这点时，继之以细胞死亡(Vincent等，CANCER-Principles&Practice of Oncology，第5版；Lippincott-Raven)。如此，肿瘤块的扩大超出直径为2mm依赖于足够血供的形成。许多出版物描述了肿瘤血管发生的现象。可以将肿瘤植入无血管区，诸如角膜中，或者在特征性血管化表面，诸如鸡尿囊绒膜上植入，及在每种情况中形成新毛细管向内生长的观察结果提示了肿瘤释放血管发生的扩散性活化剂，其可以向静止的血管系统发信号以开始毛细管萌发(Hanahan和Folkman，Cell 1996 ；第86卷353_364)。在过去数年中，已经通过使用许多体外和体内生物测定法，诸如增殖测定法和趋化性测定法来鉴定血管发生的许多诱导物和抑制剂。增殖测定法使用培养的毛细管内皮细胞，并测量增加的细胞数目或经放射性标记的或经修饰的核苷的掺入以检测S期的细胞。相反，趋化性测定法通过多孔膜盘来分开内皮细胞和测试溶液，使得内皮细胞迁移穿过屏障指示测试溶液中存在的化学引诱物(Hanahan和Folkman，Cell 1996 ；第86卷 353-364)。通过使用体内测定法，诸如角膜中的植入物，可以补充体外测定法。已经使用这些测定法来鉴定血管发生的数种诱导物和抑制剂。要检测的第一种是成纤维细胞生长因子， 并且几乎同时，通过其引发血管通透性的能力鉴定一种分泌性蛋白质，称作血管内皮生长因子或血管通透性因子(VEGF) (Simpson-Haidaris和Rybarczyk，Annals of the New York Academy of Sciences2001 ；第 936 卷406_425)。已经显示了这两种蛋白质(VEGF，FGF)都能够增强毛细管生长，并且如此，是血管发生的有力诱导物。最近，已经鉴定出两种相关生长因子VEGF-B和VEGF-C，并且所有三种VEGF基因及FGF在小鼠和人的正常成年器官中广泛表达，提示在组织稳态及血管发生中的作用。FGF 和VEGF结合内皮细胞上的受体，其是跨膜酪氨酸激酶，并且如此经由信号转导级联与细胞调节网络偶联(Brown等，EXS1997 ；第79卷:233_269)。FGF和VEGF通常在极其多种人和动物癌症中表达，并且它们已经在显著分数的携带肿瘤的患者的尿液和血清中以升高的水平检出(Simpson-Haidaris和Rybarczyk， Annals of the New York Academy of Sciences2001 ；第 936 卷406_425)。在过去数十年期间，已经鉴定出数目日益增加的血管生成诱导物，而且还已经呈现了内源血管发生抑制剂的第一项证据。例如，研究人员分别使用基于体外趋化性的测定法和角膜袋体内测定法观察到α干扰素和血小板因子_4可以抑制内皮细胞趋化性和增殖(Brouty-BoyS和 Zetter, Science 1980 ；第 208 卷516_518)。上述段落汇总了如下的证据，即血管发生可以受到内皮细胞增殖和迁移的诱导物和抑制剂两者调节。目前，存在着提示抑制剂和诱导物的平衡决定血管生成开关的线索。数个线索为此假设提供了基础。第一个线索来自体外生物测定法。如提及的，使用增殖和趋化性测定法，FGF和VEGF可以引发来自毛细管内皮细胞的正响应。实验已经表明了，量增加的抑制剂诸如血小板反应蛋白-I(TSP-I)阻断血管发生，提示足够量的抑制剂压倒正活化剂的信号，将血管生成开关保持关闭(Dameron等，Science 1994 ；第265卷1582-1584)。第二个线索来自人癌细胞的研究，其中P53肿瘤阻抑物功能的恢复导致TSP-I的上调，压倒细胞自身合成的血管发生诱导物及添加的FGF两者(Dameron等，Science 1994 ；第265卷 1582-1584)。这些和其它线索提示了正和负信号平衡的变化介导“血管生成开关”(见图2)。已知血管生成和血管发生，特别是新血管发生是肿瘤形成中的关键因素，研究人员对以最终杀死肿瘤为目的干扰这些过程感兴趣。因而，在超过30年前，研究人员假设为了存活和生长，肿瘤需要血管，并且通过切断血供，可以将癌症饥饿成消退。这种针对癌症的革命性方法已经发展成目前科学调查的最令人兴奋的领域之一。 在过去数十年中，研究人员已经分离出调节血管发生的蛋白质并解开调节血管发生的过程 (Ribatti,Angiogenesis 2008 ；第11卷3_10)。在理论上，血管生成级联的每个步骤是癌症疗法的一个潜在靶物。已经分离并表征了内皮增殖和血管发生的许多特异性和非特异性抑制剂。美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)协调临床试验中的19种潜在的血管发生抑制剂，而它们中的5种现在处于临床3期(NCI，国家癌症研究所的官方网站)。两种相当有希望的抑制剂血管他丁(angiostatin)和内皮他丁(endostatin)抑制内皮细胞的增殖。没有招致周细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞自身的增殖。血管他丁在前列腺癌异种移植物中显示99%肿瘤抑制，而内皮他丁在数种鼠肿瘤模型，诸如路易士(Lewis)肺癌和B16F10黑素瘤中揭示肿瘤消退(O'Reilly等，Cell 1994 ；第79卷:315_328 ；O'Reilly 等，Cell 1997;第88卷277-285)。现今，主要的制药公司已经认识到该有希望的主题，并且致力于开发抑制血管发生活化剂诸如VEGF、FGF或血管生成素的新抗体。已经开发并测试数种抗体，获得或大或小的成功。例如，安维汀(Avastin)(即一种为抑制血管内皮生长因子而设计的抗体)因其在乳腺癌和结肠癌患者中的抑制效果获得很大成功而驰名。发表了第一项研究，其中在恶性肿瘤的基因疗法中使用血管发生抑制剂。除了那点之外，在用特异性血管生成抑制剂的动物研究中，迄今为止尚未报告副作用(NCI，国家癌症研究所的官方网站)。已经对TNP-470仅部分报告了血管发生抑制剂也可以抑制重要的生理学功能，诸如伤口愈合的评价。已经显示了伤口愈合在小鼠中延迟 (0，Reilly等，Science 1999 ；第285卷1926-1928)。其它抑制剂如内皮他丁或血管他丁对小鼠中的伤口愈合或其它生理学功能没有显示负影响。总之，已经完成了许多努力来研究血管发生。研究人员已经分离出调节血管发生的蛋白质。已经实施了数项体外研究以研究内皮血管形成。在过去数十年中，研究人员认识到血管发生在肿瘤形成中确实也发挥主要的作用。使用动物中的植入物的早期研究报告了由肿瘤组织诱导的血管生成应答，即血管形成比由正常组织诱导的或伤口后的血管生成应答更实质性且更早。因为已经显示了肿瘤生长是血管发生依赖性的，所以各公司聚焦于开发针对血管生成生长因子的新药物以使肿瘤饥饿成消退。为了监测肿瘤血管发生，特别是在用抗血管生成药物的治疗期间，研究人员尝试并应用不同成像技术、不同血管靶物和染料。然而，迄今为止应用的成像技术不容许实时条件下的体内成像。例如，计算机断层摄影术(CT)、正电子发射断层摄影术(PET)、单光子发射计算机化断层摄影术(SPECT)和磁共振成像(MRI)是一些经典的非侵入性成像技术(见表1)。基于解剖学、形态学和生理学变化，这些技术容许诊断疾病，诸如癌症。然而，大多数这些建立的技术缺乏灵敏性，降低特异性靶向，而且不能展现出以分子为基础的功能变化，并且如此不是基础研究、临床前和转化应用中的合适工具。因此，仅可以在晚期、形态学可见的时间点时诊断出疾病。其它成像技术遭受不得不自受试者获得包括血管系统的肿瘤材料的缺陷。
肿瘤内的血管系统一般经历活跃的血管发生，导致新血管的连续形成以支持生长中的肿瘤。此类血管生成血管与成熟的血管系统的可区别之处在于血管生成血管系统表达独特的内皮细胞表面标志物，包括ανβ3整联蛋白(Brooks等，Cell 1994，第79 卷1157-1164 ；WO 95/14714)和血管生成生长因子受体(Mustonen 和 Alitalo, J. Cell Biol. 1995，第 129 卷895_898 ；Lappi, Semin. Cancer Biol. 1995，第 6 卷279_288)。此夕卜，肿瘤血管系统与一般的血管在组织学上的可区别之处在于肿瘤血管系统是有孔的 (Folkman, Nature Med. 1995，第 1 卷:27_31 ；Rak 等，Anticancer Drugs 1995，第 6 卷 3-18。如此，血管生成血管系统是一种用于靶向肿瘤归巢分子的特别有吸引力的靶物。因而，α νβ 3整联蛋白、血管生成生长因子诸如VEGF及其受体是用于对肿瘤血管系统成像的有吸引力的靶物。US 6，958，140提示了肝配蛋白(印hrin)-Β2为用于成像，特别地对肿瘤血管系统成像的血管靶物。US 6，051，230提示了 FGF为用于成像的靶物。EP 627 940 提示了 ELAM-1-1、VCAM-I、ICAM-I、LAM-I 或MHC II 类抗原。Citrin 等，Mol Cancer Ther. 2004，第 4 卷481-8 提示了内皮他丁。Bix 等，J Natl Cancer Inst. 2006，第 98 卷: 1634-1646提示了 Endor印ellin。其他作者提示了使用MPI造影剂，即钆(Saban等，BMC Cancer2007，第 7 卷:219_238)。此外，迄今为止没有发现成像技术、血管标志物和染料间的合适相互作用，其容许肿瘤血管系统的非侵入性体内成像或在受试者中在实时条件下监测抗血管生成剂的治疗功效。因而，研究人员停留于用于对肿瘤血管系统成像的已知技术，并且如此对肿瘤的冷冻切片应用免疫化学技术(参见Ninomiya等，J.Surg. Res. 2009，第154卷196-262)。一些研究人员通过使用⑶31抗体来应用对补充有Matrigel并植入小鼠中的HUVEC的命运的体内成像(Bogdanov 等，Pharm. Res. 2007，第 24 卷:1186_1192)。这些作者提示了使用 CD31 抗体来对人内皮细胞在小鼠中的过继转移体内成像及出于生物工程目的在确定人细胞在小鼠模型中的命运中以及在药物开发中使用⑶31抗体。具体地，这些作者想要追踪人细胞在小鼠中的命运，并且如此测定抗CD31抗体对小鼠中人内皮细胞的特异性。然而，这些作者没有通过使用经标记的CD31抗体使用小鼠肿瘤模型来显现肿瘤的血管形成。另外，这些作者提示了非侵入性成像可以充当一种重要的辅助以监测细胞过继及最后体内接受的命运。因而，他们进一步提示了如此，抗⑶31抗体可以是一种用于对人内皮细胞在小鼠中过继转移成像的潜在成像剂，以及这些抗体可以出于生物工程目的帮助确定人细胞命运及帮助药物开发。然而，这些作者没有提示使用抗⑶31抗体来在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效。Mitra和Foster，Neoplasia 2008，第10卷429_438应用体内共焦荧光成像来显现光敏剂单-L-天冬氨酰二氢卟酚_e6(NPe6)的摄取和肿瘤内分布。光敏剂在光动力疗法中使用。光动力疗法是一种第三水平的癌症治疗，其牵涉三种关键的组分光敏剂、光和组织氧。因而，Mitra和Foster调查NPe6光敏剂的分布及其动力学。出于所述目的，他们经由尾静脉对小鼠EMT6肿瘤模型系统性施用NPe6，并且通过使用缀合有Alexa Fluor 647的抗小鼠⑶31抗体就血管系统而言显现NPe6。然而，Mitra和Foster没有使用经标记的抗 CD31抗体来显现肿瘤血管系统。他们应用此类抗体来显现NPe6光敏剂的分布。Runnels等，Mol. Imaging 2006，第5卷31_40在小鼠中应用体内成像来显现血管内皮细胞的典型粘着分子的分子表达。因而，Runnels等施用针对例如⑶31 (PECAM-I)、E-选择蛋白、P-选择蛋白和VCAM-I的单克隆抗体，并调查这些蛋白质的时间和空间表达。 然而，Runnels等没有显现肿瘤血管系统，因为他们没有使用肿瘤模型，并且对显现血管系统根本不感兴趣，而是对显现例如CD31的表达感兴趣。TP 2009126864披露了一种血管成像剂，其能够显现膜中的血管，并目.其是一种与靶物定向基团和检测基团组合的聚合物。总之，尽管有可用于监测血管发生，特别地肿瘤血管发生的各种成像技术、各种血管靶物和许多染料的知识，据我们所知，仍需要寻找用于显现肿瘤血管发生和/对肿瘤血管系统体内成像，特别地在用治疗性抗血管生成药物治疗期间和/或之后的合适手段和方法。更具体地，仍需要提供用于对受试者中的肿瘤血管系统体内成像及用于对受试者中的抗血管生成剂的治疗功效成像的非侵入性手段和应用这些手段的方法。因此，本发明的技术问题遵照上文所描述的需要。本发明解决此需要，并且如此作为技术问题的解决办法提供关注通过检测经荧光标记的抗CD31抗体来对肿瘤血管系统体内成像及在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的手段，例如工具和试剂盒及应用这些手段的方法和用途的实施方案。这些实施方案在本文中表征并描述，在实施例中例示，并在权利要求书中反映。本申请的发明人以非侵入性研究肿瘤血管发生，优选地在实时条件下，特别地在用治疗性抗血管生成剂治疗期间和/或之后非侵入性研究肿瘤血管发生为目的应用不同成像技术、血管标志物、用于结合这些血管标志物的手段和便于显现所述手段结合这些血管标志物的染料。他们还以寻找对显现肿瘤血管最合适的成像剂、染料和成像技术为目的检查各种成像参数，由此对肿瘤血管系统成像。他们可以实现其目的及用于非侵入性显现并量化肿瘤血管发生的已建立的且评估的手段和方法。具体地，他们已经发现了，在已经尝试的不同成像技术、血管标志物、用于结合这些血管标志物的手段和便于显现所述手段结合这些血管标志物的染料中，应用抗 CD31抗体的基于荧光的监测方法对于通过检测经荧光标记的抗CD31抗体对肿瘤血管系统非侵入性成像和/或在受试者中监测抗血管生成剂的治疗功效是最合适的。本发明人惊讶的是，CD31是一种特别适合于肿瘤形成期间的血管发生的标志物，因为已经可以预期肿瘤特异性血管发生标志物更合适。此外，通常在内皮细胞、血小板、巨噬细胞和库普弗(Kupffer)细胞、粒细胞、T/NK 细胞、淋巴细胞、巨核细胞、破骨细胞、嗜中性粒细胞上找到⑶31。⑶31还在某些肿瘤，包括上皮样血管内皮瘤、上皮样肉瘤样血管内皮瘤、其它血管肿瘤、组织细胞性恶性肿瘤、和浆细胞瘤中表达。还可以在嗜中性粒细胞、单核细胞、骨髓细胞、未成熟的淋巴样细胞、髓样造血细胞和来自白血病和淋巴瘤患者的细胞的膜中以及在血小板和内皮细胞膜中找到CD31。如此，已经可以预期抗⑶31抗体会非特异性结合许多细胞/组织，由此产生太多的背景信号。然而，本发明人令人惊讶地观察到相反的事情。总之，开发的方法对于以高的信号-比-背景比率特异性监测肿瘤血管发生是可行的。它容许比较肿瘤血管系统，并且能够监测抗血管生成剂抑制肿瘤血管形成和/或对肿瘤血管施加异化影响的能力和/或功效。因而，在第一方面，本发明涉及对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。本文中所描述的方法和用途容许实时成像，即直接显现血管系统，特别是肿瘤血管系统，使得不需要显现照片等的延迟。因而，可以直接 (在线)显现血管系统，特别地肿瘤血管系统的任何变化。实时成像的优点在于可以在施用例如抗血管生成剂后不久监测此类药剂的效果。术语“对肿瘤血管系统体内成像”还包括对肿瘤形成期间发生的血管发生体内成像或体内监测。它还包括对血管，特别地肿瘤血管体内成像或体内监测。具体地，所应用的方法基于经荧光标记的抗⑶31抗体，其已经证明为靶物特异性的，并且适当地显现血管。如本发明人已经证明的，⑶31是一种用于显现肿瘤血管系统的特别有用的标志物，因为⑶31是一种在血管发生期间，特别地肿瘤形成中的血管发生期间表达的标志物。更具体地，对不同靶向剂、基于抗体的或非肽的分子检查对血管生长和分布成像。 所有药剂在血管发生中具有关键的作用，并且是药物开发的重要靶物。它们比体外试剂面临更严格的设计标准。基本的根本性困难是以高的靶物比背景比率设计它们。例如， 应当存在有最小的非特异性组织外渗、被巨噬细胞内在化、或肾或肝消除，但是应当在感兴趣的区域产生高的局部浓度。出于这些原因，单抗3-aleXa647、抗CD31-aleXa610和单抗7-aleXa700服从特定标记设计，尽管对单一抗体使用多拷贝alexa标记物(比率为约 1/3)。第四种成像剂IntegriSense 680是一种靶向性荧光成像剂，其包含一种有力的、选择性非肽的小分子整联蛋白α νβ3拮抗剂和NIR荧光染料。已经对它进行开发以显现整联蛋白α νβ 3表达，即一种通过在新血管系统中及在肿瘤细胞中介导细胞_胞外基质相互作用来促成内皮细胞迁移的细胞粘着分子。用单抗3-aleXa647的成像结果揭示了一种强烈的且肿瘤浓缩的信号，然而，Nuance成像研究指示抗体与肿瘤细胞结合，但是不可检出血管 (见图16A)。已经显示了单抗3生长因子复合物被猴视网膜切片中的肿瘤掺入。相反，抗 ⑶31-aleXa610成像在整个小鼠身体中展现出规则的抗体分布。这可以通过所使用的单克隆抗体(抗小鼠⑶31)和小鼠⑶31的最小程度表达解释。组织学检查显示血管毛细管的充分限定的轮廓(见图16B)。第三种成像剂单抗7-aleXa700及其血管生成生长因子靶物似乎经由整个血液系统循环，在肺和肝中结束。Nuance成像仅可以在鼠间质中检出弱的信号强度和少量的抗体。血管不可见(见图16C)。IntegriSenSe680(即认为能够显现新血管系统的非肽小分子)不是适合于监测所使用的异种移植物中的血管发生的成像剂。在体内，它以低的靶物比背景比率给出强烈的信号。然而，通过靶向肿瘤细胞，而不是期望的血管来产生此信号(见图16D)。为此，本发明人观察到，仅抗⑶31抗体以高的信号-比-背景比率特异性标记血管内皮细胞。可以在本发明的试剂盒、方法和用途中应用容许检测经荧光或近红外荧光标记的结构，例如器官或肿瘤的任何合适的成像系统。一种优选的成像系统是本文中所描述的MAESTRO系统(见图5)，其容许靶物特异性体内活体成像以检查肿瘤血管系统，包括肿瘤中的血管发生。除了这点外，有可能同时在仅一只小鼠中测定靶物特异性信号。该程序能够分开两个发射光谱，并以不同颜色显现这两种试剂。此外，可以比较信号强度，并且容许关于靶物浓度和分布的结论。用aleXa700标记赫赛汀(Herceptin)(即一种人源化的单克隆抗体，其结合HER2受体)，并将其以相等浓度与抗⑶31-aleXa610 —起注射以检查不同表达样式和成像系统的灵敏性(见图17)。可以分开荧光信号，并且信号强度的比较揭示了⑶-31信号比赫赛汀-aleXa700的信号弱百倍(见图17E-F)。通过离体Nuance图像确认这些结果，如本文中所描述的。肿瘤细胞表面上浓缩的赫赛汀比代表血管毛细管的小鼠⑶31+内皮细胞多得多地存在。对于理想的成像条件，期望高的靶物-比-背景比率。剂量减少的循环成像试剂和微少的非特异性结合是最好的成像结果必需的。相反，肿瘤内的靶物特异性浓度应当为最大值。IntegriSenseeSO的成像结果表明背景信号随时间逐渐降低。试剂注射后2小时和5小时的成像图揭示由循环的荧光剂或非特异性结合引起的高背景信号(见图18)。后来的时间，可以将这些探针代谢，随后消除。MAESTRO成像系统是一种平面荧光反射成像系统，并且因此近红外放射的组织渗透是有限的。荧光信号强度取决于其在小鼠组织中的位置(深度)。因此，成像剂在器官如肝、脾、肾和肺中的信号相对于在上部组织切片，如皮下肿瘤中的信号不能精确量化。肿瘤和排泄器官中自体内活体成像获得的单抗3-aleXa647信号强度与用Nuance系统的离体研究中的信号分布不相关联。虽然体内研究展现出肿瘤中的最高药剂浓度，但是对外植器官的荧光检查揭示在肝、肾和脾中更高的，或者至少相似的浓度(见图19)。这些结果与信号强度高度依赖于成像剂的组织深度的理论一致。总之，已经评估了对血管生成剂特异性的数种成像剂以在体内监测肿瘤血管发生并且非侵入性使用体内荧光成像，优选地近红外成像。可以用MAESTRO系统在体内评估成像探针，并且任选地，以离体方式在经福尔马林固定的经石蜡包埋的肿瘤切片中评估以测试这些标志物的灵敏性和特异性。内皮细胞的鉴定和肿瘤的血管分布是随后研究的先决条件。仅抗⑶31标志物以高的信号-比-背景比率特异性标记血管内皮细胞(见图28)。它还容许单一血管的离体显现作为量化方法的起始点。本发明还涵盖，在如本文中所描述的对肿瘤血管系统体内成像或者在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效外，可以通过用本文中所描述的任何成像技术检测经标记的抗体来对受试者中经标记的抗⑶31抗体的位置监测/成像。此别的方面提供了关于抗体位置的概述。例如，关于抗体是否也在血液中，特别地在血清中，在肾、膀胱等中，可以对其监测。因而，也可以根据抗体的特异性、半衰期、分布等来判断。在所要求保护的方法和用途中，对受试者胃肠外，优选地静脉内施用抗体，优选地在治疗期间的不同时间点时，并通过荧光成像系统，优选地通过近红外荧光成像系统诸如荧光反射成像(FRI)系统或通过荧光介导的断层摄影术(FMT)系统对其体内成像。可用于实施本发明的NIR荧光测量的成像系统通常包含三种基本构件(1)近红外光源，(2)用于分开或区分荧光发射与用于荧光染料激发的光的手段，和(3)检测系统。光源提供单色(或基本上单色)近红外光。光源可以是适当过滤的白光， 艮口，来自宽带来源的带通光。例如，可以将来自150瓦特卤素灯的光通过可购自Omega OpticaKBrattleboro, VT)的合适带通滤光器。在一些实施方案中，光源是激光。参见例如 Boas，D. Α.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994，第 91 卷4887_4891 ；Ntziachristos, V.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000，第 97 卷2767_2772 ；Alexander, W.，J. Clin. Laser Med. Surg. 1991，第 9 卷416_418。
可以使用高通滤光器(700nm)来分开荧光发射与激发光。合适的高通滤光器可购自 Omega Optical。一般地，可以认为光检测系统包括光聚集/图像形成构件和光检测/图像记录构件。虽然光检测系统可以是并入这两种构件的单一集成装置，但是光聚集/图像形成构件和光检测/图像记录构件可以是分开的。可以在本发明中使用任何合适的光检测/图像记录构件，例如电荷耦合装置 (CCD)系统或照相胶片。光检测/图像记录的选择会取决于包括所使用的光聚集/图像形成构件的类型的因素。选择合适的构件、将它们装配成近红外成像系统、及操作所述系统在本领域的普通技术内。在本发明中应用的体内成像技术还包括FMT技术(荧光分子断层摄影术)、基于激光的三维成像系统，其提供小动物模型中的非侵入性、全身、深组织成像，而且产生荧光源的3D重建和/或容许测量由于本发明中应用的经荧光标记的抗CD31抗体结合所致的经荧光标记的结构的荧光浓度。该系统容许测定成像探针的实际分布。平面二维成像(见图 29A)揭示了肿瘤区内的最高抗体浓度，而用FMT系统的3D成像研究容许小鼠身体中的抗体分布的评估改善(见图29B-D和图31)。因此，可以在更实际的方法中分析荧光信号强度的量化。在实施本发明的方法和用途时，优选的是，要对受试者施用经荧光标记的抗CD31 抗体，之后检测抗体，即来自经荧光标记的抗CD31抗体的信号。如上文提及的，然后涵盖的是，要在相同位置处和/或在与第一位置不同的位置处为了控制、排除另一个肿瘤的复发在治疗期间及任选地在治疗后的不同时间点时施用抗体。还有，为了在治疗前显现肿瘤血管系统和/或为了在监测抗血管生成剂的治疗功效前显现肿瘤以便然后评估抗血管生成剂是否治疗有效，可以在治疗前施用抗体。近红外荧光成像系统的例子是所附实施例中所描述的MAESTRO系统。因而， MAESTRO系统是一种优选的系统，其可以在本发明的试剂盒、方法和用途中应用。MAESTRO系统是一种平面荧光反射成像系统，其容许非侵入性体内荧光测量。在此多光谱分析中，在特定波长捕获一系列图像。捕获的波长范围应当覆盖存在于标本中的标记物的预期光谱发射范围。结果会是一系列称作“图像立方体(image cube)”的图像，并且它是用于限定自身荧光和特定标记物两者的个别光谱的此一系列图像内的数据。生物学感兴趣的许多标记物具有相似的发射光谱，使得使用昂贵的窄带滤光器分离是困难或不可能的。用单一长通发射滤光器替换大量发射滤光器。在皮肤、毛皮、皮脂腺的天然自身荧光夕卜，还存在着来自共栖生物体(真菌、螨等)和摄取食物(叶绿素)的独特自身荧光。多光谱分析经由发射荧光的线性信号混合物的数学解开(分解)能够分开来自应用于标本的特定标记物的所有这些信号，只要期望信号和自身荧光的发射光谱是已知的。用MAESTRO系统的测量如下运转给照明模块装备激发白光的氙气灯(Cermax)。 经由下游连接的激发滤光器(由实验者选择)，将光限定于(对于该实验)期望的波长范围，并经由光纤引导入成像模块中。在这里，将受限制的光划分入照亮麻醉的测试动物的四根光纤中。MAESTRO系统自动选择最佳的暴露时间，从而没有过度暴露的风险。用发射滤光器选择激活的荧光探针的发射荧光光(见表1)，并经由液晶(LC)引导至高灵敏性、冷却型 CCD照相机。液晶使照相机能够进行特定波长的选择性照片记录。波长测量范围取决于选定的滤光器组(蓝色、绿色、黄色、红色、深红色、NIR)，并且以IOnm为梯级记录照片。在一个称作“图像立方体”的“照片包”中组合每个单一照片的光谱信息。表1 :Maestro 滤光器组。
权利要求
1.一种对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。
2.一种在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的非侵入性方法，包括检测经荧光标记的抗⑶31抗体。
3.前述权利要求中任一项的方法，其中要在检测所述抗体前对所述受试者施用所述经荧光标记的抗⑶31抗体。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者患有癌症。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述受试者具有实体瘤。
6.权利要求5的方法，其中所述受试者的实体瘤是异种移植物，优选地人异种移植物。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中要用抗血管生成剂治疗所述受试者。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中通过近红外荧光成像(NIRE)来实现检测。
9.权利要求8的方法，其中近红外荧光成像包括荧光反射成像(FRI)或荧光介导的断层摄影术(FMT)。
10.权利要求7的方法，其中所述抗血管生成剂是VEGF-A、VEGF-B,VEGF-C, VEGF-D, VEGFRU VEGFR2或血管生成素的抑制剂。
11.权利要求10的方法，其中所述抑制剂是抗体、siRNA或小分子。
12.在前述权利要求中限定的任何方法中使用的经荧光标记的抗CD31抗体。
13.在前述权利要求中限定的任何方法中使用的试剂盒，其包含经荧光标记的抗CD31 抗体和用于近红外荧光成像以检测受试者中的所述抗体的手段。
14.经荧光标记的抗CD31抗体用于制备用于对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的诊断组合物的用途。
15.经荧光标记的抗⑶31抗体用于制备用于在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的诊断组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及对受试者中的肿瘤血管系统体内成像的非侵入性方法和用途，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。在又一方面，本发明涉及在受试者中体内监测抗血管生成剂的治疗功效的非侵入性方法和用途，包括检测经荧光标记的抗CD31抗体。另外，提供了在本发明的方法中使用的试剂盒，其包含经荧光标记的抗CD31抗体和用于近红外荧光成像以检测受试者中的该抗体的手段。
文档编号C07K16/28GK102481380SQ201080039490
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月9日 优先权日2009年7月9日
发明者C.克莱恩, J.萨姆, M.多伯兹, W.舒尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司