专利名称：四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法
技术领域：
本发明涉及一种生物提取方法，尤其是一种四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，即针对含有四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的高密度发酵液利用膜分离工艺实现四氢嘧啶及其衍生物的高收率分离提取方法。
背景技术：
四氢嘧啶及其衍生物羟基四氢嘧啶是一种能够在极端环境下(例如外界高温、冷冻、射线、干燥等极端条件)对细胞、蛋白质、细胞膜、和核酸提供有效保护的保护剂，具有保护免疫系统，合成热休克蛋白，保护膜结构等功能。目前研究发现其对炎症、阿尔兹海默氏症、帕金森病等神经性疾病均具有一定的治疗作用，另外对人类皮肤具有保湿、防紫外线、延缓皮肤衰老等功效，在生物医药、酶应用技术、生命科学研究、精细化工等领域具有广阔前景。四氢嘧啶类是一种环化的氨基酸，目前不能够化学合成，只能从海洋微生物体内提取得到，但是目前的提取方法产量低、提取工艺复杂。如离子交换树脂方法提取四氢嘧啶，利用阳离子交换色谱，由于四氢嘧啶分子在低PH下具有一定的阳离子特征，因此可以用阳离子交换树脂法将PH调到1. 4然后除去蛋白，随后用NaOH滤过，最终获得纯度75%的四氢嘧啶，但是这种方法未能获得高纯度四氢嘧啶，其含有一定量的难除去的谷氨酸盐。并且对环境具有污染作用，操作过程会用到大量的酸碱溶液，并且树脂成本也比较高，提纯方法价格比较高。沸石分子筛分离提取法提取四氢嘧啶，是含有四氢嘧啶的细胞水溶液通过沸石分子筛吸附，然后解吸附，此过程重复多次获得纯度约90%的四氢嘧啶，但是此方法没有去除四氢嘧啶中的色素和盐，并且分子筛更换吸附剂操作困难，吸附剂成本高专利申请号200810012464. 9，名称为“利用微生物发酵生产Ectoine的方法”的专利文献中公开了一种以谷氨酸单钠为唯一碳氮源的液体培养基发酵诱导合成四氢嘧啶的方法，但是没有涉及四氢嘧啶的提取工艺。
发明内容
本发明提供了一种提取成本低、提取产品纯度高的四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法。实现本发明目的之一的四氢嘧啶的膜技术提取方法，包括以下步骤(1)将含有四氢嘧啶的菌种在NaCl溶液培养基中发酵得到含有四氢嘧啶菌体的发酵液，将该发酵板框过滤，菌体用水低渗冲击释放四氢嘧啶，得到四氢嘧啶菌体溶液；(2)然后用无机陶瓷滤膜过滤除去该四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，使其澄清、分离纯化，得到一级超滤液；(3)对该一级超滤液用聚砜膜或者聚醚砜膜进行膜处理，滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，得到二级超滤液；
(4)将该二级超滤液经分子量更小的聚砜膜或者聚醚砜膜进行脱色，得到脱色后溶液；(5)将该脱色后溶液经芳香族聚酰胺复合膜脱盐，得到脱盐后溶液；(6)最后将该脱盐后溶液浓缩结晶得到四氢嘧啶晶体。所述步骤O)中的膜分离采用切向过滤，膜规格为0.2 Ιμπι，材料为陶瓷膜，压力为0. 4 IMpa。所述步骤(3)中的聚砜膜或者聚醚砜膜选用10 IOOnm孔径，压力为1 3Mpa。所述步骤(4)中聚砜膜或者聚醚砜膜的截留分子量为1000 3000，压力为0. 5 1. 5Mpa。所述步骤(5)中的芳香族聚酰胺复合膜的截留分子量为200 1000，压力为
0.5 2Mpa。实现本发明目的之二的羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，包括以下步骤(1)将含有四氢嘧啶羟化酶的菌种在NaCl溶液培养基中发酵得到含有羟基四氢嘧啶菌体的发酵液，将该发酵板框过滤，菌体用水低渗冲击释放羟基四氢嘧啶，得到羟基四氢嘧啶菌体溶液；(2)然后用无机陶瓷滤膜过滤除去该羟基四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，使其澄清、分离纯化，得到一级超滤液；(3)对该一级超滤液用聚砜膜或者聚醚砜膜进行膜处理，滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，得到二级超滤液；(4)将该二级超滤液经分子量更小的聚砜膜或者聚醚砜膜进行脱色，得到脱色后溶液；(5)将该脱色后溶液经芳香族聚酰胺复合膜脱盐，得到脱盐后溶液；(6)最后将该脱盐后溶液浓缩结晶得到羟基四氢嘧啶晶体。所述步骤O)中的膜分离采用切向过滤，膜规格为0.2 Ιμπι，材料为陶瓷膜，压力为0. 4 IMpa。所述步骤(3)中的聚砜膜或者聚醚砜膜选用10 IOOnm孔径，压力为1 3Mpa。所述步骤(4)中聚砜膜或者聚醚砜膜的截留分子量为1000 3000，压力为0. 5
1.5Mpa。所述步骤(5)中的芳香族聚酰胺复合膜的截留分子量为200 1000，压力为 0. 5 2Mpa。由于本发明的四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，全部采用膜技术分离工艺，操作简单且易实现自动化；提取过程中无化学步骤，也没有大量的酸碱蒸汽消耗，因此提取成本大为降低；并且膜提取设备使用寿命长，维护方便、投资较少，分离效率高，得到产物纯度高。
图1为本发明四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法的流程图。
具体实施方式
本发明四氢嘧啶的膜技术提取方法实施例如下本发明的四氢嘧啶的膜技术提取方法中，所用的能够产生四氢嘧啶的菌种包括 Halomonas属的大部分菌种，Brevibacterium属的部分菌种，Salinivibrio属的全部菌种等，例如 Halomonas ventoase DL7, Brevibacterium JCM 6894, Salinivibrio costicola subsp. yaniae等。将上述菌种中的一种或几种在含有1 3MNaCl的培养基中发酵培养，能够合成以四氢嘧啶作为主要溶质的发酵液。下面以Halomonas ventoase DL7为例介绍本发明四氢嘧啶的膜技术提取方法。实施例1(1)取Halomonas ventosae DL7菌种的发酵液20升，其中所含四氢嘧啶的浓度为 6g/L，菌体用20升水低渗冲击释放四氢嘧啶，得到四氢嘧啶菌体溶液。(2)再选用0. 2m2无机陶瓷膜对四氢嘧啶菌体溶液进行过滤处理，除去四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，膜材料为氧化铝，膜孔径0. 2 μ m，过滤条件为压力IMpa、温度20°C，过滤后得到一级超滤液，其透光率为88%。(3)将一级超滤液通过孔径在IOnm的聚砜膜滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，压力为3Mpa，得到二级超滤液。(4)将二级超滤液再经过截留分子量为1000的聚砜膜除色素，压力为1. 5Mpa，颜色脱出率为98. 9%以上，得到脱色后溶液。(5)将脱色后溶液经过截留分子量为200的芳香族聚酰胺复合膜脱盐，压力为 2Mpa,氯化钠脱除率在94%以上，得到脱盐后溶液。(6)将脱盐后溶液浓缩至60g/l的时候结晶，结晶沉淀得到四氢嘧啶晶体89. 5g， 纯度为97.9%。实施例2(1)取Halomonas ventosae DL7菌种的发酵液20升，其中所含四氢嘧啶的浓度为 6g/L，菌体用20升水低渗冲击释放四氢嘧啶，得到四氢嘧啶菌体溶液。(2)再选用0. 2m2无机陶瓷膜对四氢嘧啶菌体溶液进行过滤处理，除去四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，膜材料为氧化锆，膜孔径0. 6 μ m，过滤条件为压力0. 6Mpa、温度20°C，过滤后得到一级超滤液，其透光率为87. 5%。(3)将一级超滤液通过孔径在50nm的聚醚砜膜滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，压力为2Mpa，得到二级超滤液。(4)将二级超滤液再经过截留分子量为2000的聚醚砜膜除色素，压力为IMpa，颜色脱出率为98. 5%以上，得到脱色后溶液。(5)将脱色后溶液经过截留分子量为500的芳香族聚酰胺复合膜脱盐，压力为 IMpa，氯化钠脱除率在93. 5%以上，得到脱盐后溶液。(6)将脱盐后溶液浓缩至60g/l的时候结晶，结晶沉淀得到四氢嘧啶晶体89. Sg, 纯度为97.5%。实施例3(1)取Halomonas ventosae DL7菌种的发酵液20升，其中所含四氢嘧啶的浓度为 6g/L，菌体用20升水低渗冲击释放四氢嘧啶，得到四氢嘧啶菌体溶液。(2)再选用0. 2m2无机陶瓷膜对四氢嘧啶菌体溶液进行过滤处理，除去四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，膜材料为氧化钛，膜孔径ι μ m,过滤条件为压力0. 4Mpa、温度20°C，过滤后得到一级超滤液，其透光率为87%。(3)将一级超滤液通过孔径在IOOnm的聚砜膜滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，压力为IMpa，得到二级超滤液。(4)将二级超滤液再经过截留分子量为3000的聚砜膜除色素，压力为0. 5Mpa，颜色脱出率为97%以上，得到脱色后溶液。(5)将脱色后溶液经过截留分子量为1000的芳香族聚酰胺复合膜脱盐，压力为 0. 5Mpa，氯化钠脱除率在93%以上，得到脱盐后溶液。(6)将脱盐后溶液浓缩至60g/l的时候结晶，结晶沉淀得到四氢嘧啶晶体90. Ig, 纯度为97.2%。本发明羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法实施例如下本发明的羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法中，所用的能够产生羟基四氢嘧啶的菌种包括Maricoccus Str印tomyces等属，以及含有四氢嘧啶羟化酶基因的基因工程菌，例如 Maricoccus M52, Streptomyces chrysomallus ATCC 11523 等。将上述菌种中的一种或几种在含有1 3M NaCl的培养基中发酵培养，能够合成以羟基四氢嘧啶作为主要溶质的发酵液。下面以Maricoccus M52菌种为例介绍本发明羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法。实施例1(1)取Maricoccus M52菌种的发酵液20升，其中所含羟基四氢嘧啶的浓度为5g/ 1，菌体用20升水低渗冲击释放羟基四氢嘧啶，得到羟基四氢嘧啶菌体溶液。(2)再选用0. 2m2无机陶瓷膜对羟基四氢嘧啶菌体溶液进行过滤处理，除去羟基四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，膜材料为氧化铝，膜孔径 0. 2 μ m，过滤条件为压力IMpa、温度20°C，过滤后得到一级超滤液，其透光率为87%。(3)将一级超滤液通过孔径在IOnm的聚砜膜滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，压力为3Mpa，得到二级超滤液。(4)将二级超滤液再经过截留分子量为1000的聚砜膜除色素，压力为1. 5Mpa，颜色脱出率为98%以上，得到脱色后溶液。(5)将脱色后溶液经过截留分子量为200的芳香族聚酰胺复合膜脱盐，压力为 2Mpa,氯化钠脱除率在95%以上，得到脱盐后溶液。(6)将脱盐后溶液浓缩至60g/l的时候结晶，结晶沉淀得到羟基四氢嘧啶晶体 83. 5g，纯度为 98. 5%0实施例2(1)取Maricoccus M52菌种的发酵液20升，其中所含羟基四氢嘧啶的浓度为5g/ 1，菌体用20升水低渗冲击释放羟基四氢嘧啶，得到羟基四氢嘧啶菌体溶液。(2)再选用0. 2m2无机陶瓷膜对羟基四氢嘧啶菌体溶液进行过滤处理，除去羟基四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，膜材料为氧化锆，膜孔径 0. 5 μ m，过滤条件为压力0. 7Mpa、温度20°C，过滤后得到一级超滤液，其透光率为86. 5%。(3)将一级超滤液通过孔径在60nm的聚醚砜膜滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，压力为2Mpa，得到二级超滤液。
(4)将二级超滤液再经过截留分子量为2000的聚醚砜膜除色素，压力为IMpa，颜色脱出率为97. 6%以上，得到脱色后溶液。(5)将脱色后溶液经过截留分子量为600的芳香族聚酰胺复合膜脱盐，压力为 IMpa，氯化钠脱除率在94. 7%以上，得到脱盐后溶液。(6)将脱盐后溶液溶液浓缩至60g/l的时候结晶，结晶沉淀得到羟基四氢嘧啶晶体83. 7g，纯度为98. 3%0实施例3(1)取Maricoccus M52菌种的发酵液20升，其中所含羟基四氢嘧啶的浓度为5g/ 1，菌体用20升水低渗冲击释放羟基四氢嘧啶，得到羟基四氢嘧啶菌体溶液。(2)再选用0. 2m2无机陶瓷膜对羟基四氢嘧啶菌体溶液进行过滤处理，除去羟基四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，膜材料为氧化钛，膜孔径 1 μ m,过滤条件为压力0. 4Mpa、温度20°C，过滤后得到一级超滤液，其透光率为86%。(3)将一级超滤液通过孔径在IOOnm的聚砜膜滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，压力为IMpa，得到二级超滤液。(4)将二级超滤液再经过截留分子量为3000的聚砜膜除色素，压力为0. 5Mpa，颜色脱出率为97%以上，得到脱色后溶液。(5)将脱色后溶液经过截留分子量为1000的芳香族聚酰胺复合膜脱盐，压力为 0. 5Mpa，氯化钠脱除率在94%以上，得到脱盐后溶液。(6)将脱盐后溶液溶液浓缩至60g/l的时候结晶，结晶沉淀得到羟基四氢嘧啶晶体84. lg，纯度为98%。
权利要求
1.一种四氢嘧啶的膜技术提取方法，包括以下步骤(1)将含有四氢嘧啶的菌种在NaCl溶液培养基中发酵得到含有四氢嘧啶菌体的发酵液，将该发酵板框过滤，菌体用水低渗冲击释放四氢嘧啶，得到四氢嘧啶菌体溶液；(2)然后用无机陶瓷滤膜过滤除去该四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，使其澄清、分离纯化，得到一级超滤液；(3)对该一级超滤液用聚砜膜或者聚醚砜膜进行膜处理，滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，得到二级超滤液；(4)将该二级超滤液经分子量更小的聚砜膜或者聚醚砜膜进行脱色，得到脱色后溶液；(5)将该脱色后溶液经芳香族聚酰胺复合膜脱盐，得到脱盐后溶液；(6)最后将该脱盐后溶液浓缩结晶得到四氢嘧啶晶体。
2.根据权利要求1所述的四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤O)中的膜分离采用切向过滤，膜规格为0. 2 1 μ m，材料为陶瓷膜，压力为0. 4 IMpa。
3.根据权利要求1所述的四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤(3)中的聚砜膜或者聚醚砜膜选用10 IOOnm孔径，压力为1 3Mpa。
4.根据权利要求1所述的四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤中聚砜膜或者聚醚砜膜的截留分子量为1000 3000，压力为0. 5 1. 5Mpa。
5.根据权利要求1所述的四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤(5)中的芳香族聚酰胺复合膜的截留分子量为200 1000，压力为0. 5 2Mpa。
6.一种羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，包括以下步骤(1)将含有四氢嘧啶羟化酶的菌种在NaCl溶液培养基中发酵得到含有羟基四氢嘧啶菌体的发酵液，将该发酵板框过滤，菌体用水低渗冲击释放羟基四氢嘧啶，得到羟基四氢嘧啶菌体溶液；(2)然后用无机陶瓷滤膜过滤除去该羟基四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质，使其澄清、分离纯化，得到一级超滤液；(3)对该一级超滤液用聚砜膜或者聚醚砜膜进行膜处理，滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物，得到二级超滤液；(4)将该二级超滤液经分子量更小的聚砜膜或者聚醚砜膜进行脱色，得到脱色后溶液；(5)将该脱色后溶液经芳香族聚酰胺复合膜脱盐，得到脱盐后溶液；(6)最后将该脱盐后溶液浓缩结晶得到羟基四氢嘧啶晶体。
7.根据权利要求6所述的羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤(2) 中的膜分离采用切向过滤，膜规格为0. 2 1 μ m，材料为陶瓷膜，压力为0. 4 IMpa。
8.根据权利要求6所述的羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤(3) 中的聚砜膜或者聚醚砜膜选用10 IOOnm孔径，压力为1 3Mpa。
9.根据权利要求6所述的羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤(4) 中聚砜膜或者聚醚砜膜的截留分子量为1000 3000，压力为0. 5 1. 5Mpa。
10 根据权利要求6所述的羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法，其特征在于所述步骤(5) 中的芳香族聚酰胺复合膜的截留分子量为200 1000，压力为0. 5 2Mpa。
全文摘要
本发明提供了一种提取成本低、提取产品纯度高的四氢嘧啶及羟基四氢嘧啶的膜技术提取方法。本发明四氢嘧啶的膜技术提取方法，将含有四氢嘧啶的菌种在NaCl溶液培养基中发酵得到含有四氢嘧啶菌体的发酵液，将该发酵板框过滤，菌体用水低渗冲击释放四氢嘧啶，得到四氢嘧啶菌体溶液；然后用无机陶瓷滤膜过滤除去该四氢嘧啶菌体溶液的微生物细胞碎片以及其它颗粒状不溶解物质；再用聚砜膜或者聚醚砜膜进行膜处理，滤除杂蛋白、多肽、多糖等其它非聚合物；再经分子量更小的聚砜膜或者聚醚砜膜进行脱色；再经芳香族聚酰胺复合膜脱盐；最后将该脱盐后溶液浓缩结晶得到四氢嘧啶晶体。
文档编号C07D239/04GK102226210SQ20111009722
公开日2011年10月26日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者朱道辰, 章卫民, 陈华友 申请人:朱道辰