专利名称：一种猪胰岛素超分子聚集体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胰岛素超分子聚集体制备技术，特别涉及一种以猪胰岛素制备猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)的方法及其该猪胰岛素超分子聚集体，属于生物医药领域。
背景技术：
糖尿病是以持续高血糖为特征的一种慢性全身性代谢性疾病，究其原因，主要是由于体内胰岛素分泌绝对缺少或由于身体对胰岛素的需求量增多而造成的胰岛素相对不足，或由于胰岛素抵抗，从而导致以糖代谢紊乱为主的糖、蛋白质、脂肪代谢紊乱的一种综合病症。随着病程延长，可导致眼、神经、血管、肾脏等组织器官的并发症。因此，糖尿病已经成为世界上继肿瘤、心脑血管疾病之后居第三位严重威胁人类健康的慢性病。
胰岛素是胰腺胰岛P细胞合成分泌的体内唯一具有降血糖作用的蛋白激素，对机体葡萄糖的摄取、氧化和利用起主要作用。I型糖尿病患者和中晚期II型糖尿病患者都需要使用胰岛素进行治疗。从患者使用的顺应性等角度考虑，非注射途径具有极大的优势，然而其真正的临床应用还很少，例如:胰岛素的鼻腔给药系统具有相对较高的粘膜通透性和可以避开首过效应，但是仍存在有局部刺激性、对纤毛的妨碍和伤害、胰岛素吸收较少或吸收不规则等缺点；此外，虽然口服给药是最理想的非注射途径，由于胰岛素为蛋白质多肽类药物，能被胃肠道的蛋白水解酶降解，所以直接口服无效，而通过以高分子作为载体并加入保护剂和促吸收剂的微囊、微球、脂质体或复乳等口服制剂虽然在实验研究中取得了一定的进展，但其临床研究仍未达到有治疗意义的生物利用度，至今尚无口服胰岛素制剂面市[I]。因此，目前胰岛素的主要临床使用方式仍是皮下注射给药。
为有效控制血糖浓度必须频繁给药，普通胰岛素针剂需要每天注射2 3次，即使是胰岛素长效针剂，如鱼精蛋白锌胰岛素PZ1、低精蛋白锌人胰岛素NPH、长效胰岛素类似物NN304和H0E901等。患者也需要至少每隔24 36小时注射一次，治疗仍不方便。至于具备缓释能力的胰岛素泵，尽管具有使用方便的优点，却存在价格昂贵、皮下导管细菌感染、延迟或不可预知的吸收、改变胰岛素敏感性，以及增加糖尿病胃轻瘫并发症可能等缺点[2，3]。鉴于上述现有情况，研制一种使用方便、疗效确切、安全可靠的胰岛素新剂型，是目前国内外共同关注的课题[4，5]。
2010年前沿研究发现形成胰岛素淀粉样纤维过程中的特定过渡态胰岛素超分子聚集体(SIA)，在单次皮下注射，或肌肉注射后可有效控制血糖水平达120天以上(PNAS，2010,107:13246)，有效控制时间超过所有现用胰岛素剂型100倍以上，开创了胰岛素控释领域的全新思路[6]。该研究将胰岛素形成胰岛素淀粉样纤维过程中的过渡态按不同的时间段分别选取出来，分别命名为 SIA-1、SIA-1I 和 SIA-1II (SIA:supramolecular insulinassembly)。动物实验表明，患I型糖尿病的SD大鼠分别单次注射200 y g剂量牛胰岛素的SIA-1I和重组人胰岛素的SIA-1I即可分别达 到大于120天和大于140天的血糖浓度控制能力。然而，该工作仅对牛胰岛素超分子聚集体(B-SIA)和重组人胰岛素超分子聚集体(rH-SIA)进行了研究。而猪胰岛素具有和人胰岛素非常近似的结构，对猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)进行研究也是非常有必要的，这也正是本发明的任务所在。
参考文献
[I]Lyer, H.，Khedkar, A.，Verma, M.，Oral insulin-a review of currentstatus.Diabetes Obes.Metab.2010，12:179-185.
[2]Nowakowska, M.，Jarosz-Chobot, P.，Polanska，J.，et al.，Bacterialstrains colonizing subcutaneous catheters of personal insulin pumps.Pol.J.Microbiol.2007，56:239-243.
[3] Shalitin, S.，Phillip，M.，Hypoglycemia in type I diabetes:A stillunresolved problem in the era of insul in analogs and pump therapy.DiabetesCare2008，31(Suppl 2):S121_S122.
[4]叶山东，朱禧星，《临床糖尿病学》，2005，安黴科学技术出版社。
[5]Burn, P., Type I diabetes.Nat.Rev.Drug Discov.2010，9:187-188.
[6]Gupta, S.，Chattopadhyay, T.，Singh, M.P.，et al.，Supramolecular insulin assembly II for a sustained treatment of type I diabetes mellitus.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 2010，107:13246-13251.发明内容:
本发明的目的正是基于糖尿病患者的需要，而提供一种猪胰岛素超分子聚集体及其制备方法。该方法是将猪胰岛素与溶液配制成反应物溶液，将反应物溶液经搅拌反应制备成猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA);该方法具有材料易得、操作简单；所制备的猪胰岛素超分子聚集体由猪胰岛素单体发生蛋白质高级结构的改变，通过超分子相互作用由多个猪胰岛素单体聚集而形成；其相对于猪胰岛素单体具有延展拉伸的形貌。经动物实验表明，所获得的猪胰岛素超分子聚集体单次用药即可在不禁食的情况下有效控制大鼠体内血糖浓度长达129天；为胰岛素疗法在糖尿病患者治疗中的应用提供了新途径。
为实现上述目的，本发明采用以下措施构成的技术方案来实现的。
本发明提出的一·种猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
(I)将猪胰岛素与溶液配制成浓度在0.01mg/mL-400mg/mL之间的反应物溶液；
(2)将上述反应物溶液置于反应容器中于常压下搅拌反应，反应温度为5-60°C，搅拌反应时间为l_300h，即制得猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)悬浊液；
(3)将制得的猪胰岛素超分子聚集体悬浊液直接使用，或将其干燥后低温保存备用。
上述方案中，所述溶液的pH值控制在1.0-14之间。
上述方案中，所述溶液为含盐酸的水溶液，或含醋酸的水溶液，或含盐酸和醋酸的水溶液，它们的PH值均在1.5-2.5之间；所述含醋酸的水溶液为醋酸钠缓冲液，其pH值在3.5-5.5之间；或为磷酸盐缓冲液，其pH值在6-7.5之间；或为柠檬酸缓冲液，其pH值在4-6之间；或为含氢氧化钠的水溶液,其pH值在7-14之间。
上述方案中，所述猪胰岛素与溶液配制的浓度在0.50mg/mL-20.00mg/mL之间。
上述方案中，所述搅拌反应时间为10_40h。
上述方案中，所述搅拌反应包括恒速搅拌反应，或变速搅拌反应，其搅拌速度均在10转/分-2000转/分。
本发明所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法制备的猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)，其特征在于该猪胰岛素超分子聚集体是由猪胰岛素单体发生蛋白质高级结构的改变，通过超分子相互作用由多个猪胰岛素单体聚集而形成，所述猪胰岛素超分子聚集体相对于猪胰岛素单体具有延展拉伸的形貌。
本发明的制备方法所制备的猪胰岛素超分子聚集体可通过Th-T荧光、刚果红染色、傅里叶转换红外光谱、原子力显微镜和透射电镜等来进行联合检测证明其存在；也可通过前述其中之一的检测手段证明其存在。
本发明的猪胰岛素超分子聚集体及其制备方法具有以下特点及有益的技术效果:
1、本发明方法所制备的猪胰岛素超分子聚集体由猪胰岛素单体发生蛋白质高级结构的改变，通过超分子相互作用由多个猪胰岛素单体聚集而形成；其相对于猪胰岛素单体具有延展拉伸的形貌。
2、本发明所制备的猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)，经动物实验，在不禁食的情况下可有效控制大鼠体内血糖浓度长达129天；因此，用于糖尿病的治疗可在体内长效缓释胰岛素。
3、本发明所制备的猪胰岛素超分子聚集体可以多种形式应用于I型和II型糖尿病患者的治疗；并在I型和II型糖尿病患者及由此引发的并发症的代谢紊乱的治疗中有效。
4、 本发明的制备方法工艺简单，操作方便，且所用原料易得。
图1本发明制备的猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)随反应时间延长，猪胰岛素从单体和二聚体向超分子聚集体P-SIA和成熟的胰岛素淀粉样纤维(Fibrils)转变过程的示意图；图中(a)为猪胰岛素，(b)为猪胰岛素聚集体，(c)为猪胰岛素淀粉样纤维；
图2本发明用原子力显微镜观察到的按实施例1、2和3的制备条件得到的猪胰岛素超分子聚集体；图中，(a)、(b)和(C)分别为猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-1、猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-2和猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-3的形态示意图3本发明实施例7的糖尿病大鼠皮下注射P-SIA 60天之后刚果红染色的组织形态，图中深色长条形区域为糖尿病大鼠组织中的胰岛素超分子聚集体；
图4本发明实施例7的猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)在实验大鼠体内控制血糖的曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例及实验结果图对本发明作进一步详细说明，其目的是使本领域的技术人员更容易理解本发明的具体实施方式
，但并不构成是对本发明保护范围的任何限定。
实施例1
按照本发明的制备方法，准备猪胰岛素粉末、pH为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)UOOml烧瓶、搅拌子、恒温磁力搅拌器。
称取猪胰岛素粉末50mg放入已装有搅拌子的烧瓶中，加入50mlpH为6.8的PBS缓冲液得反应物溶液，将所得反应物溶液放入温度调节为37°C的恒温磁力搅拌器中，在150r/min转速下搅拌反应，常压下，搅拌时间至15h则停止搅拌反应，即制得含猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-1的悬浊液。
实施例2
按照本发明的制备方法，准备猪胰岛素粉末、pH为7.2的PBS缓冲液、50ml烧瓶、搅拌子、恒温磁力搅拌器。
称取猪胰岛素粉末30mg放入已装有搅拌子的烧瓶中，加入15mlpH为7.2的PBS溶液，将所得反应物溶液放入温度调节为37°C的恒温磁力搅拌器中，在lOOr/min转速下搅拌反应，常压下，搅拌时间至22h时停止反应，即制得猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-2的悬浊液。
实施例3
按照本发明的制备方法，准备猪胰岛素溶液、pH为5.0的PBS缓冲液、IOOml烧瓶、搅拌子、恒温磁力搅拌器。
称取猪胰岛素溶液IOOmg放入已装有搅拌子的烧瓶中，加入50mlpH为5.0的PBS缓冲液，将所得反应物溶液放入温度调节为37°C的恒温磁力搅拌器中，在200r/min转速下搅拌反应，常压下，搅拌时间至IOOh时停止反应，即制得猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-3的悬浊液。
实施例4
按照本发明的制备方法 ，准备猪胰岛素溶液、pH为1.0的HCl溶液、250mL烧杯、搅拌子、恒温磁力搅拌器。
称取猪胰岛素溶液Img放入已装有搅拌子的烧瓶中，加入IOOmlpH为1.0的HCl溶液，将所得反应物溶液放入温度调节为60°C的恒温磁力搅拌器中，在2000r/min转速下搅拌反应，常压下，搅拌时间至Ih时停止反应，即制得猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-4的悬浊液。
实施例5
按照本发明的制备方法，准备猪胰岛素溶液、pH为7.5的PBS缓冲液、50ml烧瓶、搅拌子、恒温磁力搅拌器。
称取猪胰岛素溶液IOOmg放入已装有搅拌子的烧瓶中，加入IOmlpH为7.5的PBS缓冲液，将所得反应物溶液放入温度调节为5°C的恒温磁力搅拌器中，在lOr/min转速下搅拌反应，常压下，搅拌时间至300h时停止反应，即制得猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-5的悬浊液。
实施例6
按照本发明的制备方法，准备猪胰岛素粉末、pH为14的NaOH溶液、50ml烧瓶、搅拌子、恒温磁力搅拌器。
称取猪胰岛素粉末400mg放入已装有搅拌子的烧瓶中，加入ImlpH为14的NaOH溶液，得到猪胰岛素浓度为400mg/mL的反应物溶液，将该反应物溶液放入温度调节为5°C的恒温磁力搅拌器中，在lOr/min转速下搅拌反应，常压下，搅拌时间至Ih则停止搅拌反应，即制得猪胰岛素超分子聚集体P-SIA-6的悬浊液。
在上述实施例猪胰岛素反应过程中，猪胰岛素从单体逐渐转变为猪胰岛素超分子聚集体，继续延长反应时间则最终转变为胰岛素淀粉样纤维，而熟淀粉样纤维不为本发明所需产物；如图2所示，图2中的(a)，(b)和(c)三个图分别为实施例1、2、3的制备条件下所得结果。
实施例7
将实施例2所制备的猪胰岛素超分子聚集体悬浊液进行动物实验，动物实验采用健康8周SD大鼠，体重210-240g，取一组6只SD大鼠作为健康对照组。另外10只SD大鼠禁食12h后腹腔注射用柠檬酸缓冲液以4mg/mL的浓度冰浴溶解的链脲佐菌素，按空腹体重注射(50mg/kg)造模,一周后空腹血糖值大于16.7mmol/L(300mg/dl)变成为患糖尿病的大鼠。将糖尿病大鼠皮下注射200 yg实施例2制备的猪胰岛素超分子聚集体悬浊液。所有SD大鼠全天候自由取水和饲料。监测SD大鼠血糖的方法是将SD大鼠尾静脉取出的血用一触式血糖监测系统(OneTouch UltraEasy , LifeScan, Inc.Milpitas, CA.)测出。60天后处死部分SD大鼠，取出注射P-SIA部位周围的皮下组织用10 %的福尔马林溶液冷藏保存。对其组织做组织切片，刚果红染色观察P-SIA在体内组织的沉积情况，如图3所示，根据图3可以看出，图中深色长条形区域为组织中的胰岛素超分子聚集体溶液，在皮下注射60天后，大鼠体内仍有胰岛素超分子聚集体继续释放胰岛素控制大鼠血糖。图4为P-SIA在动物大鼠体内控制血糖 的曲线，可见该胰岛素聚集体可以有效控制大鼠体内血糖浓度长达129天。
权利要求
1.一种猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤: (1)将猪胰岛素与溶液配制成浓度在0.01mg/mL-400mg/mL之间的反应物溶液； (2)将上述反应物溶液置于反应容器中于常压下搅拌反应，反应温度为5-60°C，搅拌反应时间为l_300h，即制得猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)悬浊液； (3)将制得的猪胰岛素超分子聚集体悬浊液直接使用，或将其干燥后低温保存备用。
2.根据权利要求1所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，其特征在于所述溶液的PH值控制在1.0-14之间。
3.根据权利要求1或2所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，其特征在于所述溶液为含盐酸的水溶液，或含醋酸的水溶液，或含盐酸和醋酸的水溶液，它们的PH值均在1.5-2.5之间；所述含醋酸的水溶液为醋酸钠缓冲液，其pH值在3.5-5.5之间；或为磷酸盐缓冲液，其PH值在6-7.5之间；或为柠檬酸缓冲液，其pH值在4-6之间；或为含氢氧化钠的水溶液，其PH值在7-14之间。
4.根据权利要求1所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，其特征在于所述猪胰岛素与溶液配制的浓度在0.50mg/mL-20.0Omg/mL之间。
5.根据权利要求1所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，其特征在于所述搅拌反应时间为10-40h。
6.根据权利要求1所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，其特征在于所述搅拌反应包括恒速搅拌反应，或变速 搅拌反应，其搅拌速度均在10转/分-2000转/分。
7.权利要求1-6任一项所述猪胰岛素超分子聚集体的制备方法，所制备的猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)，其特征在于该猪胰岛素超分子聚集体是由猪胰岛素单体发生蛋白质高级结构的改变，通过超分子相互作用由多个猪胰岛素单体聚集而形成；所述猪胰岛素超分子聚集体相对于猪胰岛素单体具有延展拉伸的形貌。
全文摘要
本发明涉及一种猪胰岛素超分子聚集体及其制备方法，属于生物医药领域。该方法是以猪胰岛素与溶液配制成反应物溶液，再将该反应物溶液搅拌反应制备成猪胰岛素超分子聚集体(P-SIA)。所述猪胰岛素超分子聚集体是由猪胰岛素单体发生蛋白质高级结构的改变，通过超分子相互作用由多个猪胰岛素单体聚集而形成；其相对于猪胰岛素单体具有延展拉伸的形貌。本发明的制备方法操作简单，原料易得；经动物实验表明，所获得的猪胰岛素超分子聚集体单次用药即可在不禁食的情况下有效控制大鼠体内血糖浓度长达129天。因此，得到的产品有潜力用于长效控制体内血糖浓度，给糖尿病患者的治疗带来新思路；在生物医药领域有着广阔的应用前景。
文档编号C07K14/62GK103191416SQ20121000177
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者李建树, 罗珺 申请人:四川大学