从紫红獐牙菜中分离的口山酮类及抑制乙型肝炎病毒的应用的制作方法

从紫红獐牙菜中分离的口山酮类及抑制乙型肝炎病毒的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了从紫红獐牙菜中分离的口山酮类及其抑制乙型肝炎病毒的应用。体外抗乙肝病毒筛选试验表明，所分离的口山酮类单体化合物对HepG2.2.15细胞中HBsAg或HBeAg的表达表现出不同程度的抑制作用，且不同化合物之间抑制率差异极显著。在供试化合物HepG2肝细胞毒性评价的基础上，通过HepG2肝细胞损伤的保护作用试验发现，所分离的口山酮类单体化合物对于肝细胞均有一定的保护或修复作用，其中，雏菊叶龙胆素对于肝细胞的保护或肝细胞损伤的修复作用最为显著。本发明进一步公开了它们在抑制HBsAg或/和HBeAg表达、保护肝细胞、修复药物性肝细胞损伤中的应用以及在制备用于生物标记物或诊断试剂中的用途。
【专利说明】从紫红獐牙菜中分离的口山酮类及抑制乙型肝炎病毒的应 用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物口山酮类化合物，尤其涉及从紫红猜牙菜（Swertia punicea Hemsl.)中分离的口山酮类单体化合物，本发明进一步涉及它们在制备抗乙肝病毒HBsAg 或HBeAg表达、保护肝细胞或修复损伤肝细胞或制备用于生物标记物或诊断试剂中的用 途，属于生物口山酮类化合物及其应用领域。

【背景技术】
[0002] 肝脏是人体的中心代谢器官，肝炎是肝脏的炎症，作为一种高发性传播疾病，肝炎 已经已经严重威胁我们的身体健康和日常生活，肝炎种类很多，不同的原因导致不同的肝 炎。肝炎根据病因来分，可以分为病毒性肝炎、药物性肝炎、酒精性肝炎、中毒性肝炎等。
[0003] 中国是一个肝炎大国，病毒性肝炎发病数位居法定管理传染病的第一位，仅慢性 乙型肝炎病毒感染者就达1. 2亿。慢性乙型肝炎病程迁延，如得不到及时的治疗，将会发展 为肝硬化甚至肝癌，严重危害人类健康。
[0004] 同时在药物使用过程中，因药物本身或/及其代谢产物或由于特殊体质对药物的 超敏感性或耐受性降低亦会导致肝脏损伤，即药物性肝损伤，临床上可表现为各种急慢性 肝病，轻者停药后可自行恢复，重者可能危及生命、需积极治疗、抢救。同时，由药物引起的 肝病占非病毒性肝病中的20%-50%，暴发性肝衰竭的15%-30%。多种药物可以引起药物性肝 损伤，如抗肿瘤的化疗药、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂、降糖降脂药、抗细菌、抗真菌 及抗病毒药等。
[0005] 对乙酰氨基酚(APAP)是全球应用最广泛的解热镇痛药物之一，虽然其推荐治疗剂 量安全有效，但治疗窗较窄。APAP的应用已成为西方国家发生药物性肝损伤的主要原因，在 美国、英国和澳大利亚，APAP是导致急性肝功能衰竭的主要原因(在美国，超过50%的急性 肝功能衰竭由APAP所致)。临床医师应警惕APAP潜在危险，尤其在长期饮酒、有肝脏基础 疾病的患者中，更应谨慎。
[0006] APAP导致的药物性肝损伤是一个复杂的过程。目前认为，当过量服用APAP后，在 细胞色素 P450 (CYP)作用下，APAP转化为N-乙酰-对-苯醌亚胺（NAPQI)，导致谷胱甘肽 耗竭及与蛋白质的共价结合，继而导致自由基(包括氧自由基和氮自由基）增加。氧化应激 增加可能与钙离子有关，继而启动信号转导途径和线粒体膜通透性的转换。线粒体膜通透 性转换导致进一步的氧化应激反应，线粒体膜电位下降，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成障 碍，ATP耗竭，继而引起细胞坏死。谷胱甘肽可阻断APAP所导致的肝细胞坏死。
[0007] 中国是资源丰富的中药大国，近年来报道许多中药及其有效成分均有肝细胞保护 作用，研究这些中药及其有效成分，开发出改善肝炎的新药将会有广阔的应用前景。
[0008] 紫红猜牙菜（Swertia punicea Hemsl.)系龙胆科猜牙菜属一年生草本植物，又名 水黄莲、土黄莲(湖南)、苦胆草、草龙胆、桑蒂(藏药)、布什都补此(彝族)，分布于云南、四川、 贵州、湖北西部、湖南。生于山坡草地、河滩、林下、灌丛中，海拔400-3800米。紫红獐芽菜 以全草入药，该药味苦性寒，具有清肝利胆、清热解毒、祛湿健胃之功效。尽管目前治疗肝炎 的药物较多，然而能够达到令人满意疗效的药物较少。《中国药典》中的保肝药青叶胆资源 已日趋枯竭，难于满足生产需要。从紫红獐牙菜中分离获得具有确切的保肝、护肝药理活性 的单体化合物，这对于肝炎的预防或治疗将具有重要意义。


【发明内容】

[0009] 本发明的目的之一是提供一类从紫红猜牙菜（Swertia punicea Hemsl.)中分离 的具有确切的抗乙肝病毒HBsAg和/或HBeAg表达，保肝、护肝药理活性的口山酮类单体化 合物；
[0010] 本发明的目的之二是提供一种从紫红猜牙菜（Swertia punicea Hemsl.)中分离 所述口山酮类单体化合物的方法；
[0011] 本发明的目的之三是将所述的口山酮类单体化合物应用于抑制乙型肝炎病毒 HBsAg和/或HBeAg表达、保护肝细胞或修复损伤肝细胞；
[0012] 本发明的目的之四是提供一种预防或治疗乙型肝炎或保肝、护肝的药物组合物。
[0013] 本发明的目的之五是提供一种可用于制备生物标记物或诊断试剂的小分子偶联 物，所述生物标记物包括量子点生物荧光探针及其他荧光或非荧光探针偶联物。
[0014] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0015] 本发明从紫红猜牙菜（Swertia punicea Hemsl.)中分离获得7种生物类口山酮 类单体化合物，所述的生物类口山酮类化合物选自：1，7-羟基-3, 4甲氧基口山酮、1，5-二 羟基-3-甲氧基口山酮、1-羟基-3-甲氧基-8-樱草糖基口山酮、当药醇苷、7-0_[ a -L-批 喃鼠李糖基-(1 - 2)-β-D-吡喃木糖基]-1，8-二羟基-3-甲氧基口山酮、1，7-二羟 基-3, 4, 8-三甲氧基口山酮和雏菊叶龙胆素。
[0016] 本发明通过大量的药理药效学试验发现，从紫红獐牙菜中所分离获得的7种口山 酮类单体化合物合物对于H印G2. 2. 15细胞HBsAg和HBeAg表达具有抑制作用，对APAP引起 的肝细胞损伤能提高细胞存活率，上述实验结果表明，从紫红獐牙菜中所分离获得的7种 生物类口山酮类化合物具有一定的抗乙肝病毒HBsAg和/或HBeAg表达、保肝护肝的药理 活性，临床上能将其制备成抗乙肝病毒或保肝护肝的药物。
[0017] 同时，本发明进一步发现从紫红獐牙菜中分离获得的不同的生物类口山酮类单体 化合物在抑制HBsAg和/或HBeAg表达，保护肝细胞、修复损伤肝细胞等药理功效的活性上 存在极显著性的差异。
[0018] 本发明将分离获得的7种口山酮类单体化合物进行体外抗乙肝病毒筛选试验，试 验结果表明，这7种口山酮类单体化合物对H印G2. 2. 15细胞中HBsAg和/或HBeAg的表达 均表现出不同程度的抑制作用，且不同化合物之间抑制率差异显著：
[0019] 在7种口山酮类单体化合物中，1，7-羟基_3,4甲氧基口山酮(化合物1)、当药 醇苷(化合物4)和7-0_[a-L-吡喃鼠李糖基-(1 - 2)-i3_D-批喃木糖基]-1，8-二羟 基-3-甲氧基口山酮(化合物5)对H印G2. 2. 15细胞HBsAg的表达呈现出非常强的抑制作 用，其抑制率分别为31. 74%、25. 37%和37. 66%，这三种口山酮类单体化合物不仅远远高出 其余四种口山酮类单体化合物的抑制率，也显著高出阳性对照药齐墩果酸对ifepG2. 2. 15 细胞HBsAg的抑制率（阳性对照药齐墩果酸对H印G2. 2. 15细胞HBsAg的抑制率为22. 58%)。
[0020] 相比于其它6种口山酮类单体化合物以及阳性对照药，7-0_[α -L-吡喃鼠李糖 基-(1 - 2)-β-D-吡喃木糖基]-1,8-二羟基-3-甲氧基口山酮(化合物5)对!fepG2. 2. 15 细胞HBeAg的表达呈现出最为显著的抑制作用，其抑制率达到了 31. 72%，不仅远远高出 其余6种口山酮类单体化合物的抑制率(其余6种口山酮类单体化合物对!fepG2. 2. 15细 胞HBeAg的抑制率最高仅为7. 77%)，也显著高出阳性对照药齐墩果酸对H印G2. 2. 15细胞 HBeAg的抑制率（阳性对照药齐墩果酸对H印G2. 2. 15细胞HBeAg的抑制率仅为8. 27%)。
[0021] 综合体外抗乙肝病毒筛选试验结果可见，从紫红獐牙菜中分离获得的7种口 山酮类单体化合物对于HBsAg和/或HBeAg的表达表现出不同程度的抑制作用，惟有 7-0- [ a -L-吡喃鼠李糖基-(1 - 2) - β -D-吡喃木糖基]-1，8-二羟基-3-甲氧基口山酮对 于H印G2. 2. 15细胞中HBsAg和HBeAg的表达均呈现出非常强烈的抑制作用，不仅显著高出 其它6种口山酮类单体化合物对于H印G2. 2. 15细胞HBsAg和HBeAg的抑制率，也显著高出 阳性对照药对于H印G2. 2. 15细胞HBsAg和HBeAg的抑制率。
[0022] 本发明在评价化合物毒性的基础上，进一步评价了从紫红獐牙菜中分离获得的7 种口山酮类单体化合物对肝细胞损伤的保护作用，试验结果发现，7种口山酮类单体化合物 对于肝细胞均有一定的保护或修复作用，其中，化合物7 (S卩：雏菊叶龙胆素)对于肝细胞的 保护或肝细胞损伤的修复作用最为显著（乍〈〇. 05)。
[0023] 本发明中生物类口山酮类化合物的酸加成的盐也包括在本发明之中。
[0024] 所述生物类口山酮类化合物的酸加成的盐优选为药学上可以接受的与适当的酸 (例如盐酸、醋酸、硫酸）形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本 发明之中。
[0025] 本发明中所述的口山酮类单体化合物可以通过现有的文献所公开的方法制备得 至IJ，也可按照本说明书所提供的方法从紫红獐牙菜中分离得到。
[0026] 作为参考，本发明提供了一种从紫红獐牙菜中分离获得7种口山酮类单体化合物 的方法，该方法包括以下步骤：
[0027] (1)将紫红獐牙菜粉碎后用乙醇提取浓缩，得到紫红獐牙菜的乙醇提取物；（2)将 紫红獐牙菜的乙醇提取物加蒸馏水至完全悬浮后，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇 萃取；（3)萃取液减压回收溶剂，得各萃取部位；（4)利用柱色谱对正丁醇萃取部分进行分 离，分别得到7种口山酮类单体化合物。
[0028] 其中，步骤（4)中所述的柱色谱包括：聚酰胺柱色谱、ΗΡ-20柱色谱、 Sephadex_LH20 凝胶柱色谱和 Semi-PHPLC 等。
[0029] 本发明的另外一个目的是提供一种抑制乙型肝炎病毒HBsAg或HBeAg表达的药物 组合物，该药物组合物由预防或治疗上有效量的生物类口山酮类化合物或其可药用的盐与 药学上可接受的载体配合而成；
[0030] 本发明还提供一种保护肝细胞或修复肝细胞损伤的药物组合物，该药物组合物由 预防或治疗上有效量的生物类口山酮类化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配 合而成；其中，所述的肝细胞损伤是对乙酰氨基酚所致的肝细胞损伤。
[0031] 将药学上可接受用量的生物类口山酮类化合物与药学上可接受的载体或稀释剂 配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物 适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、 颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可 以含有0. 1%-99%重量，优选10-60%重量的生物类口山酮类单体化合物。
[0032] 本发明从紫红獐牙菜中分离的口山酮类单体化合物还可作为小分子偶联物用于 制备生物标记物或诊断试剂，所述生物标记物包括量子点生物突光探针及其它突光或非突 光探针偶联物。
[0033] 所述的生物类口山酮类化合物选自1，7-羟基_3,4甲氧基口山酮、1，5_二羟 基-3-甲氧基口山酮、1-羟基-3-甲氧基-7-樱草糖基口山酮、当药醇苷、7-0-[ a -L-吡 喃鼠李糖基-(1 - 2)-β-D-批喃木糖基]-1，8-二羟基-3-甲氧基口山酮、1，7-二羟 基-3, 4, 8-三甲氧基口山酮或雏菊叶龙胆素中的任意一种或多种；优选为：1，7-羟基-3, 4 甲氧基口山酮、1-羟基-3-甲氧基-7-樱草糖基口山酮、当药醇苷、7-0-[ a -L-吡喃鼠李糖 基-(1 - 2) - β -D-吡喃木糖基]-1，8-二羟基-3-甲氧基口山酮或雏菊叶龙胆素；最优选 为：7-0-[a-L-吡喃鼠李糖基-(1 - 2)-β-D-吡喃木糖基]-1，8-二羟基-3-甲氧基口山 酮。

【专利附图】

【附图说明】
[0034] 图1化合物1-7分离流程图。
[0035] 图2化合物1-7对H印G2. 2. 15细胞HBsAg和/或HBeAg表达的抑制作用结果；·Ρ < 0. 001，##Ρ < 0. 01，#Ρ < 0. 05,与细胞对照组比较。
[0036] 图3化合物1-7对H印G2细胞毒性研究。
[0037] 图4化合物1-7对APAP引起HepG2细胞损伤的保护作用广P < 0. 001，与空白对 照组比较；*Ρ < 〇. 05与模型组比较。

【具体实施方式】
[0038] 下面结合具体实施方案来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技 术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形 式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0039] 实施例1从紫红獐牙菜中分离生物口山酮类化合物及其鉴定
[0040] 1、试剂和药品
[0041] 乙臆（HPLC grade，Merck KGaA，Germany/HPLC grade，Fisher，Germany) ;Η3Ρ04 (HPLC grade，TEDIA Co. ,Inc.，USA);甲醇（HPLC grade，Merck KGaA，Germany/HPLC grade, Fisher, Germany);纯净水(娃哈哈纯净水有限公司，杭州）；乙腈、甲醇(色谱纯，天津市西华 特种试剂厂；天津市大茂化学试剂厂；北京益利精细化学品有限公司）；氯仿、甲醇、乙酸乙 酯、乙醇(分析纯，北京化工厂)。
[0042] 薄层色谱：硅胶GF254,青岛海洋化工厂；聚酰胺柱色谱，江苏长丰化工有限公司； HP-20树脂，三菱化工公司出品；S印hadex LH-20, GE Healthcare公司产品。
[0043] 2、仪器
[0044] Agilentll00/1200HPLC系统，配有二元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器 (Agilent Technologies，USA)。数据米集和分析米用 Agilent Chemstation9. 01。
[0045] 半制备HPLC :Alltech426二元泵、Alltech UVIS2000紫外检测器、Agilent Zorbax SB C18色谱柱（250X9mm，5 μ m);核磁共振仪：Bruker DRX400/500核磁共振波谱仪；质谱 仪：Bruker APEX IV FT 质谱仪（HRESI-MS)，ABI Q-STAR 液质联用仪（ESI-MS)。
[0046] 3、药材
[0047] 紫红猜牙菜：龙胆科植物紫红猜牙菜Swertia punicea Hemsl.的干燥全草，产地 云南大理，编号ZYC001，由北京大学药学院刘广学老师鉴定，药材标本存放于北京大学药学 院天然药物学系标本室。
[0048] 4、提取与分离
[0049] 将采集得到的紫红獐牙菜药材进一步晾干，称重，共计IOkg药材，全部粉碎为粗 粉，粉碎后的药材用乙醇提取浓缩，得紫红獐牙菜的乙醇提取物。将乙醇提取物加蒸馏水至 完全悬浮后，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。萃取液减压回收溶剂，得各萃取 部位。取正丁醇部位（300g)经HP-20树脂分离，乙醇-水梯度洗脱（5:95 - 100:0)，得到 四个洗脱部位（F1-F4)。F3部位采用聚酰胺树脂分离，乙醇-水梯度洗脱（25:75 - 95:5)， 得到五个洗脱部位（F3A-F3EXF3B采用S印hadex LH-20纯化，甲醇洗脱，经半制备高效液 相分离（流动相：乙腈/水=20 :80)，得化合物3和4。F4部位采用S印hadex LH-20纯化， 甲醇洗脱，产生52个馏分。其中馏分17-21经半制备高效液相分离(流动相：甲醇/水=60 : 40)，得化合物5、6和7。馏分17-21经半制备高效液相分离(流动相：乙腈/水=30 :70)，得 化合物1和2。具体分离过程见图1。
[0050] 5、结构鉴定
[0051] 从正丁醇部位分离得到7个口山酮类化合物，其中化合物1、化合物2、化合物3和 化合物5为首次从獐牙菜属植物中分离得到。化合物结构鉴定数据如下：
[0052] (1)化合物 1 :1，7_ 轻基 _3, 4 甲氧基 口山酮（1，7-dihydroxy-3, 4-dimethoxy-xa nthone)的鉴定
[0053]

【权利要求】
1. 从紫红猜牙菜（Swertia punicea Hemsl.)中分离的生物类口山酮类单体化合物，其 特征在于，所述的生物类口山酮类单体化合物选自：1，7-羟基-3, 4甲氧基口山酮、1，5-二 羟基-3-甲氧基口山酮、1-羟基-3-甲氧基-7-樱草糖基口山酮、当药醇苷、7-0- [ a -L-批 喃鼠李糖基-(1 - 2)-P-D-吡喃木糖基]-1，8-二羟基-3-甲氧基口山酮、1，7-二羟 基-3, 4, 8-三甲氧基口山酮或雏菊叶龙胆素。
2. 按照权利要求1所述的生物类口山酮类单体化合物，其特征在于：包括生物类口山 酮类化合物的酸加成的盐。
3. -种制备权利要求1所述生物类口山酮类单体化合物的方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1)将紫红獐牙菜用乙醇提取浓缩，得到紫红獐牙菜的乙醇提取物；（2)将紫红獐牙菜 的乙醇提取物加蒸馏水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取；（3)萃取液减 压回收溶剂，得各萃取部位；（4)利用柱色谱对正丁醇萃取部分进行分离，即得。
4. 按照权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4)中所述的柱色谱包括：聚酰胺柱 色谱、HP-20柱色谱、Sephadex-LH20凝胶柱色谱和Semi-PHPLC。
5. 权利要求1或2所述生物类口山酮类单体化合物在制备抑制HBsAg或/和HBeAg表 达的药物中的用途。
6. 权利要求1或2所述生物类口山酮类单体化合物在制备保护肝细胞药物或制备修复 肝细胞损伤药物中的用途。
7. 按照权利要求6所述的用途，其特征在于：所述肝细胞损伤是对乙酰氨基酚所导致 的药物性肝细胞损伤。
8. 权利要求1或2所述生物类口山酮类单体化合物在制备用于生物标记物或诊断试剂 中的用途；所述的生物标记物包括量子点生物荧光探针及其它荧光或非荧光探针偶联物。
9. 一种抑制乙型肝炎病毒HBsAg和/或HBeAg表达的药物组合物，该药物组合物由预 防或治疗上有效量的权利要求1所述的生物类口山酮类单体化合物或其可药用的盐与药 学上可接受的载体配合而成。
10. -种保护肝细胞或修复肝细胞损伤的药物组合物，该药物组合物由预防或治疗上 有效量的权利要求1所述的生物类口山酮类单体化合物或其可药用的盐与药学上可接受 的载体配合而成；优选的，所述肝细胞损伤是对乙酰氨基酚所导致的药物性肝细胞损伤。
【文档编号】C07H17/04GK104370871SQ201310349568
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月12日 优先权日:2013年8月12日
【发明者】蒲小平, 郑希元, 赵欣, 鲁凤民, 王杰, 孙华 申请人:北京大学