从杨树菇中分离的具有免疫佐剂作用的蛋白提取物及其提取方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了从杨树菇中分离的具有免疫佐剂作用的蛋白提取物及其提取方法和应用。本发明首先从杨树菇(Agrocybe?aegerita)中提取分离得到具有免疫佐剂作用的总蛋白混合物(Yt)，将总蛋白混合物上非极性大孔吸附树脂柱分离得到蛋白亚组分(Yp)，利用乳糖偶联的SepHarose6B亲和层析柱进一步从蛋白亚组分Yp中分离出单一组分凝集素AAL。试验结果表明，本发明从杨树菇中所分离提取的总蛋白混合物(Yt)、蛋白亚组分(Yp)以及凝集素AAL均具有免疫佐剂效应，能很好的刺激机体抗原特异性抗体分泌的增强，对脾淋巴细胞增殖也有一定的促进作用。
【专利说明】从杨树菇中分离的具有免疫佐剂作用的蛋白提取物及其提取方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及从真菌中分离提取的蛋白提取物及其用途，尤其涉及从杨树菇(Agrocybe aegerita)中分离得到的蛋白提取物、从这种蛋白提取物中分离得到的蛋白亚组分以及进一步从其中分离纯化得到的凝集素AAL，本发明还涉及它们的分离纯化方法及其作为疫苗免疫佐剂的应用，属于杨树菇活性成分的分离和应用领域。
【背景技术】
[0002]人口密度的不断增加、交通的发达，带来了越来越多的疾病的爆发和传染，例如:新病毒、SRARS, H5N1等。控制疾病爆发的最有效手段是疫苗，但是，目前，大多数疫苗都存在保护率低或者安全性不高的问题。为疫苗寻找高效的佐剂，则可以改善疫苗目前存在的这些问题。
[0003]铝盐是唯一被美国批准用于人用和兽用的疫苗。在欧洲，M59和virosome于1997年分别批准用于Fluad和Inflexal V流感疫苗，AS04于2005年批准用于HBV疫苗，2007年批准用于HPV疫苗，A S03于2008批准用于Prepandrix流感疫苗。目前，有佐剂效果的佐剂很多，但获批的佐剂却很少，因此，需要寻找更多安全高效的佐剂用于筛选可用于临床的佐剂。
[0004]中草药的使用有着千余年的历史，因其独特的药用价值、安全性、价格优势赢得了越来越多科学研究者的亲睐。研究发现很多中草药具有调节免疫的作用，分离得到的活性成分主要有:多糖类、苷类、生物碱类。近年来，关于这些活性成分的佐剂效果的研究也越来越多，多糖的毒性和副作用小的同时免疫调节活性也低，生物碱的副作用比较强，皂苷是目前比较成功的中草药来源的佐剂，但其具有较高的凝血活性限制了其作为佐剂的应用。因此，高效安全的中草药来源的佐剂有待进一步的发掘与应用。
[0005]药用真菌杨树燕(Agrocybe aegerita),又名柱状田头燕、杨树燕、柳松鸾等,隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属。在亚洲和欧洲，杨树菇已经成为特别受人们欢迎的功能食品。杨树菇中蛋白含量高达干物质的20% -30%，富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸高达1.75%，其营养价值超过香菇、金针菇等其它食用菌，民间常将其用于抗癌、降血压，治疗胃冷、肾炎、水肿等，其蛋白组分是主要的抗肿瘤活性成分。迄今为止，尚未有从杨树燕(Agrocybe aegerita)中分离的蛋白成分具有免疫佐剂功效的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一类从杨树菇中提取分离的具有免疫佐剂作用或提高机体免疫力功效的总蛋白混合物；
[0007]本发明的目的之二是从所分离的杨树菇总蛋白混合物中进一步分离得到具有免疫佐剂作用或提高机体免疫力功效的蛋白亚组分；
[0008]本发明的目的之三是从杨树菇的总蛋白混合物中分离得到具有免疫佐剂作用或提闻机体免疫力功效的凝集素AAL ；
[0009]本发明的目的之四是将所提取分离的杨树菇总蛋白混合物、蛋白亚组分以及凝集素AAL应用于疫苗的免疫佐剂以提高疫苗的防治效果。
[0010]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0011]一种从杨树菇中提取分离的具有免疫佐剂作用或提高机体免疫力功效的总蛋白混合物，该总蛋白混合物通过以下方法制备得到:
[0012](I)将杨树菇粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提，得到抽提液；
[0013](2)将步骤(1)所得到抽提液用分段硫酸铵盐析法进行沉淀；
[0014](3)将沉淀用水或磷酸盐缓冲液重悬后，透析、干燥，即得。
[0015]为了达到更好的技术效果，优选的，步骤(1)将杨树菇子实体烘干粉碎后用水或缓冲液浸泡抽提2-3次；
[0016]优选的，步骤(2)中将抽提液过滤，将滤液用硫酸铵进行沉淀；其中，所述的分段硫酸铵盐析法优选为:首先向滤液中加入硫酸铵至0.1-40%饱和度，搅拌、离心，弃沉淀，取上清；向上清中加入硫酸铵至41-80%饱和度，离心，取沉淀。
[0017]一种从杨树菇中提取分离的具有免疫佐剂作用或提高机体免疫力功效的蛋白亚组分，该蛋白亚组分通过以下方法制备得到: [0018](I)将杨树菇粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提，得到抽提液；
[0019](2)将步骤(1)所得到抽提液采用分段硫酸铵盐析法进行沉淀；
[0020](3)将沉淀用水或磷酸盐缓冲液重悬后，透析、干燥，得到蛋白提取物；
[0021](4)将蛋白提取物用水或磷酸盐缓冲液重悬后得到药液，将药液循环上样过非极性大孔吸附树脂柱，将药液中的蛋白质成分和小分子成分相分离，收集蛋白质成分；收集穿透峰至药液颜色变浅到不再变化为至，所收集的穿透峰即为药液中的蛋白质亚成分。
[0022]其中，步骤(4)中所述的非极性大孔吸附树脂柱优选为大孔吸附树脂HP-20柱；本发明通过试验发现，当上样的药液的浓度超过10mg/mL时容易造成死吸附,所以药液的浓度不超过10mg/mL时为最好,药液的上样速度优选为0.5-lmL/min。
[0023]大孔吸附树脂是不带离子交换基团、大孔结构的高分子吸附剂，主要由苯乙烯、二乙烯苯等原料交联聚合而成。良好的网状结构和很高的比表面积使其可以通过表面吸附、表面电性或形成氢键等物理吸附从溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离的目的。本发明优选采用日本三菱产非极性大孔吸附树脂HP-20分离蛋白提取物中蛋白组分Yp与色素组分Ys。
[0024]大孔吸附树脂的前处理要求比较严格，否则有效成分易流失。本发明将准备装柱使用的新树脂用2倍左右体积的甲醇或其它水溶性溶剂(如乙醇、丙酮)浸泡2小时，并不时搅动，使树脂充分溶胀。将已充分溶胀的吸附树脂装柱，以每小时3-4倍床体积的流速，将5-8倍的甲醇或其他水溶性的溶剂(如乙醇、丙酮)通过树脂层至流出液加水稀释不变混。甲醇处理后，以每小时6-8倍床体积的流速将去离子水通过树脂层，置换出甲醇即可使用。
[0025]本发明进一步提供了一种从杨树菇中提取得到的具有免疫佐剂作用或提高机体免疫力功效的凝集素AAL，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示，编码氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID N0.1 所示。[0026]本发明还公开了所述凝集素AAL的分离纯化方法，其包括以下步骤:
[0027](I)将杨树菇粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提；
[0028](2)将步骤(1)所得到抽提液用硫酸铵进行沉淀；
[0029](3)将沉淀用磷酸盐缓冲液重悬后，透析、干燥，得到蛋白提取物；
[0030](4)将蛋白提取物用磷酸盐缓冲液重悬后得到药液，将药液循环上样过非极性大孔吸附树脂柱，收集穿透峰至药液颜色变浅到不再变化为至。
[0031](5)将步骤(4)所收集的穿透峰过乳糖偶联的SepHaroseeB的亲和层析柱，以洗脱剂洗脱、分离，得到凝集素AAL。
[0032]其中，步骤(5)中所述的洗脱剂优选为乳糖。[0033]从杨树菇中分离得到总蛋白混合物(Yt)作为灭活禽流感病毒H9N2免疫佐剂的实验表明，0.2mg/mL Yt处理组小鼠血清中的IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P〈0.01)，增长了 36.2% ；0.5mg/mL Yt处理组P/N值的平均值与无佐剂组相比差异显著(P〈0.05)，增长了 32.4%。以上数据表明从杨树菇中分离得到总蛋白混合物(Yt)对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明，lmg/mL Yt>0.5mg/mL Yt>0.2mg/mL Yt处理组小鼠血清中IgGlP/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P〈0.01)，分别增长了 144.1 %、167.2 %、196.9 %。Yt各浓度处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取Yt各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞，体外用H9N2病毒刺激，检测细胞分泌IFN-Y的量。0.5mg/mL Yt处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的量为244.53pg/mL,与生理盐水组相比差异显著(P〈0.05)。Yt体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明，0.625μ g/mLYt、l.25 μ g/mLYt与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率分别为210.8%和187.5%，与未处理组之间差异极显著(P〈0.01)。这些结果表明，从杨树菇中分离得到总蛋白混合物(Yt)可能是通过激活脾淋巴细胞增殖，促进Th2细胞活性，从而发挥免疫佐剂作用。
[0034]本发明将从杨树菇中分离得到总蛋白混合物上大孔吸附树脂柱，将蛋白组分(Yp)和小分子组分(Ys)相分离；通过对Yp和Ys组分进行免疫佐剂活性的鉴定，实验结果表明，各浓度的Ys处理组小鼠血清中IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比没有表现出显著差异，说明Ys不是Yt中具有免疫佐剂活性的有效组分。亚组分Yp作为禽流感病毒H9N2免疫佐剂的实验表明，0.5mg/mL Yp>0.2mg/mL Yp>0.lmg/mL Yp处理组小鼠血清中的IgG P/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P〈0.01)，分别增长了 39.2%、47.2^^24.1?^以上数据表明Yp对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明，0.5mg/mL Yp,0.lmg/mL Yp处理组小鼠血清中IgGlP/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P〈0.01)，分别增长了 201.1%,274.7%。Yp各处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取Yp各浓度处理组与灭活病毒H9N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞，体外用H9N2病毒刺激，检测细胞分泌IFN-Y的量。0.5mg/mLYp处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-Y的量为146.21pg/mL，与生理盐水组相比差异显著(P〈0.05)。Yp亚组分体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明，0.625 μ g/mL Yp、l.25 μ g/mL Υρ、2.5μ g/mL Yp与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率分别为265.4%、321.1%和347.1 %，与未处理组之间差异极显著(P〈0.01)。这些结果表明，亚组分Yp是Yt中具有免疫调节活性的有效活性组分，免疫调节活性与Yt相似，可以促进淋巴细胞增殖，促进Th2亚群细胞活性。
[0035]半乳糖凝集素AAL是Yp中的主要成分，本发明对AAL作为禽流感病毒H9N2免疫佐剂的效果进行了研究，试验结果表明，0.2mg/mL AAL、0.lmg/mL AAL处理组小鼠血清中IgGP/N值的平均值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P〈0.01)，分别增长了 98.01%和157.5%。结果表明AAL对灭活禽流感病毒H9N2具有免疫佐剂的活性。对IgG亚型IgGl和IgG2a含量进行检测的结果表明，0.5mg/mL AAL>0.2mg/mL AAL、0.lmg/mL AAL处理组小鼠血清中的IgGlP/N值与阴性对照无佐剂组相比差异极显著(P〈0.01)，分别增长了 399.1%,362.3%、251.6%。AAL各处理组小鼠血清中IgG2a P/N值的平均值与无佐剂组没有显著性差异。取AAL各浓度处理组与灭活病毒$N2共同免疫的小鼠脾淋巴细胞，体外用H9N2病毒刺激，检测细胞分泌IFN-Y的量。0.05mg/mL AAL处理组小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN- Y的量为174.64pg/mL,与阴性对照无佐剂组相比差异显著(P〈0.05)。AAL体外刺激空白小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明，12.5 μ g/mL AAL与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率为134.1 %，与未处理组之间差异极显著(P〈0.01) ；6.25 μ g/mLAAL与ConA共同刺激空白小鼠脾淋巴细胞的增殖率为131.2%，与未处理组之间差异显著(P〈0.05)。由此可见单一组分半乳糖凝集素AAL是杨树菇中具有免疫佐剂效应的主要成分。
[0036]综上所述，本发明通过对杨树菇提取物Yt，其蛋白质亚组分Yp、单一组分AAL免疫佐剂效应的鉴定，最终确定Yt、Yp和AAL都具有免疫佐剂活性，这些成分通过刺激淋巴细胞增殖，促进Th2亚细胞活性，增强抗原的免疫原性，提高抗原免疫的抗体滴度。
【专利附图】
【附图说明】 [0037]图1通过15%的SDS-PAGE分离从杨树菇中提取总蛋白混合物(Yt)的结果；蛋白样品经过15%的SDS-PAGE分离，1-4号区域切胶酶解，SPITC处理，脱盐，经过质谱序列测定；分子量Marker从上到下:116,66.2、45。
[0038]图2从杨树菇中提取总蛋白混合物(Yt)通过HP20分离成Yp，Ys组分；Α.ΗΡ20分离Yt示意图，样品过ΗΡ20的穿透峰为Υρ，使用75%乙醇洗脱峰为Ys ;Β.使用10%的SDS-PAGE分析100 μ g的Yt、Yp、Ys，考马斯亮蓝染色。Ys中几乎不含蛋白/多肽，Yp与Yt相比，低分子量蛋白得到富集。
[0039]图3从杨树菇中分离的凝集素AAL经SDS-PAGE测定结果。
[0040]图4Yt作为佐剂对H9N2特异性抗体IgG的影响；各个处理组与无佐剂对照组比较；**表示极显著差异(ρ〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
[0041]图5Yt作为佐剂对H9N2特异性抗体IgGl和IgG2a的影响；各个处理组与无佐剂对照组比较；**表示极显著差异(P〈0.01)，*表示显著差异(P〈0.05)。
[0042]图6Yt作为H9N2病毒疫苗佐剂免疫小鼠促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN- Y。各个处理组与生理盐水对照组比较；**表示极显著差异(P〈0.01)，*表示显著差(P〈0.05)。
[0043]图7Yt与ConA共同刺激小鼠脾淋巴细胞的作用。各个处理组与空白对照组比较；**表示极显著差异(ρ〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
[0044]图8Ys作为佐剂对H9N2特异性抗体IgG的影响。各个处理组与阴性对照无佐剂组比较；**表示极显著差异(p〈0.01)，*表示显著差异(P〈0.05)。[0045]图9Yp作为佐剂对H9N2特异性抗体IgG的影响；各处理组与阴性对照无佐剂组比较，**表示极显著差异(Ρ〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
[0046]图1OYp作为佐剂对H9N2特异性抗体IgGl和IgG2a的影响。各处理组与阴性对照无佐剂组比较，**表示极显著差异(P〈0.01)，*表示显著差异(P〈0.05)。
[0047]图1lYp作为H9N2病毒疫苗佐剂免疫小鼠促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN- Y ；各个处理组与生理盐水对照组比较；**表示极显著差异(P〈0.01)，*表示显著差(P〈0.05)。
[0048]图12Yp与ConA共同刺激小鼠脾淋巴细胞的作用，各个处理组与空白对照组比较；**表示极显著差异(ρ〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
[0049]图13AAL作为佐剂对H9N2特异性抗体IgG的影响；各处理组与阴性对照无佐剂组比较；**表示极显著差异(ρ〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
[0050]图14AAL作为佐剂对H9N2特异性抗体IgGl和IgG2a的影响；各处理组与阴性对照无佐剂组比较；**表示极显著差异(p〈0.01)，*表示显著差异(P〈0.05)。
[0051]图15AAL作为H9N2病毒疫苗佐剂免疫小鼠促进脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN- Y ；各个处理组与生理盐水对照组比较；**表示极显著差异(P〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
[0052]图16AAL与ConA共同刺激小鼠脾淋巴细胞的作用，各个处理组与空白对照组比较；**表示极显著差异(ρ〈0.01)，*表示显著差异(Ρ〈0.05)。
【具体实施方式】
[0053]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0054]试验材料
[0055]1.1生物材料
[0056]杨树菇子实体，H9N2禽流感病毒(华中农业大学动物科学动物医学学院微生物实验室惠赠)
[0057]1.2试验动物
[0058]18_22g雄性昆明小鼠购于湖北省疾病预防控制中心，所有小鼠在温度24土 1°C、湿度50± 10%环境下饲养，每天12小时光照，自由采食，自由饮水。
[0059]1.3实验药品
[0060]小牛血清(杭州四季青);RPMI1640培养基(Gibco公司);3_(4，5)双甲基_2噻唑(2，5)-二苯基溴化四氮唑兰MTT(Biosharp);小鼠淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司)；四甲基联苯胺TMB(Biosharp);弗氏完全佐剂(Therom);弗氏不完全佐剂(Therom);铝盐佐剂(Therom);小鼠IFN_YELISA检测试剂盒(博士德生物工程有限公司)；羊抗鼠IgG - HRP(博士德生物工程有限公司)；羊抗鼠IgGl - HRPSothernBiotech ;羊抗鼠 IgG2a — HRP(SothernBiotech) ;BSA(Biosharp) ；ConA(Sigma)；
[0061]1.4常用试 剂的配制
[0062]1.4.1血凝试验[0063]阿氏液的配制:2.05g葡萄糖,0.8g柠檬酸钠,0.42g NaCl，0.055g梓檬酸，加ddH20100mL,调 pH 值至 6.1
[0064]0.85%生理盐水:8.5g NaCl 溶于 IL ddH20 中
[0065]I %鸡红细胞悬液:用注射器吸取阿氏液约lmL，取健康公鸡的血约2_4mL，与阿氏液混合，放入装IOmL阿氏液的离心管中混匀，将离心管中的血液经1500-1800r/min离心8分钟,弃上清液,沉淀物加入0.85%生理盐水,轻轻混合,再经1500-1800r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入一定体积的0.85%生理盐水，轻轻混合成1% (V/V)鸡红细胞悬液，4°C保存备用，不超过5天。
[0066]1.4.2RPMI1640 细胞培养基
[0067]RPMI1640干粉一袋溶于500mL ddH20,搅拌溶解，将2.0g NaHCO3溶于水倒入混匀，加水定容至1000mL,用IN HCl调节pH为6.8-7.2，用已灭菌的0.22 μ m微孔滤膜过滤培养液装入已灭菌好的玻璃瓶中，注上名称、配制日期，经检查无菌后4°C保存备用。临用前加入10%的小牛血清，100IU/mL青霉素，100 μ g/mL硫酸链霉素配成完全营养液。
[0068]1.4.3ELISA 稀释缓冲液
[0069]PBS(IL):8g NaCl.0.2g KCl、1.44g Na2HP04,0.24g KH2PO4，用 HCl 调节溶液的 pH值至7.4，在151 bf/in2(1.034X105Pa)高压下蒸气灭菌20min，保存于室温。
[0070]ELISA 包被缓冲液(0.05M 碳酸盐缓冲液):1.59g Na2CO3, 2.93g NaHCO3,ddH201000mL,调 pH 值 到 9.0-9.6
[0071]洗涤缓冲液(PBST):1OOOmL PBS, ImL 吐温 20。
[0072]ELISA 封闭液:0.5g 牛血清白蛋白(BSA)，PBSTlOOmL
[0073]ELISA样品稀释液:0.1g牛血清白蛋白(BSA)，PBSTlOOmL
[0074]终止液(2MH2SO4):178.3mL ddH20，21.7mL98%浓硫酸
[0075]ELISA 底物缓冲液:25.7mL0.2M Na2HPO4 (28.4g/L)，24.3mL0.1M 柠檬酸(19.2g/L)，50ml ddH20,调 pH 值到至 5.5
[0076]四甲基联苯胺(TMB)使用液:0.5mL TMB (10mg/5ml)，IOmL底物缓冲液(ρΗ5.5)，临用前加入 32 μ L0.75% H2O2
[0077]实施例1从杨树菇中提取总蛋白混合物(Yt)
[0078]I)取杨树燕干粉,加蒸懼水浸泡三次，分别加650mL, 600mL, 35OmL蒸懼水,每次浸泡3-4小时，每次浸泡后用六层纱布过滤。
[0079]2)收集三次过滤滤液，9000rpm,离心10min,收集上清，定容；用0% -40 %(NH4) 2S04沉淀，根据(NH4) 2S04饱和溶解度，IL溶液需要加226g (NH4) 2S04, (NH4) 2S04需要研磨，边加边搅拌，以防止局部浓度过高导致的蛋白质变性，持续搅拌lh，沉淀过夜。
[0080]3)将溶液分装，9000印111，离心101^11，弃沉淀，收集上清，用41%-80% (NH4)2SO4沉淀，根据(NH4) 2S04饱和溶解度，IL溶液需要加329g (NH4) 2S04,持续搅拌lh，沉淀4h。
[0081]4)将溶液分装，9000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀,用少量蒸懼水溶解沉淀,分装入透析袋，放入蒸馏水中透析，除盐四次，每4h换水一次。
[0082]5)收集透析袋中溶液，9000rpm，离心10min，除去未溶解蛋白质沉淀，将溶液重新加入透析袋中，用PEG20000浓缩至原体积的1/3。
[0083]6)用水冲净透析袋外的PEG20000，用滤纸吸干表面水分，分装，冻干，得到总蛋白混合物(Yt)。所提取的总蛋白混合物(Yt)通过15%的SDS-PAGE分离结果见图1。
[0084]实施例2从杨树菇中所提取总蛋白混合物(Yt)中分离蛋白组分(Yp)及小分子组分(Ys)
[0085]I)大孔吸附树脂预先用甲醇浸泡过夜。
[0086]2)装入10*10规格层析柱中，用ddH20水洗约10个柱体积。
[0087]3)将实施例1所制备的总蛋白混合物(Yt)溶于蒸馏水或磷酸盐缓冲液中(浓度为0.1-lOmg/mL),循环上样，上样速度0.5-lmL/min,同时收集穿透峰(即为蛋白组分Yp)至柱子颜色不变时，先用蒸馏水洗出柱内残留的Yt，约洗3-4个柱体积。
[0088]4)再用75%乙醇洗脱，洗脱速度lmL/min。洗脱至柱子颜色基本不变，收集洗脱峰得到小分子组分(Ys)，约2-3个柱体积。
[0089]图2中的A为HP20(日本三菱产非极性大孔吸附树脂HP-20)分离Yt示意图，样品过HP20的穿透峰为Yp，使用75%乙醇洗脱峰为Ys。图2中的B为使用10%的SDS-PAGE分析100 μ g的Yt、Yp、Ys考马斯亮蓝染色结果，从结构可见Ys中几乎不含蛋白/多肽，Yp与Yt相比，低分子量蛋白得到富集。
[0090]实施例3从所分离蛋白组分(Yp)中分离纯化得到凝集素AAL
[0091]I)将即将要过亲和层析柱的Yt溶液(实施例1所制备)用等体积的结合缓冲液(Tris-HCl缓冲液，浓度为0.05mol/L)混匀。再用0.45mm的微孔滤膜抽滤，彻底除去溶液中的杂质，以防堵塞仪器。
[0092]2)用结合缓冲液预先平衡层析柱，平衡体积3-5个柱体积，流速lmL/min。
[0093]3)将混匀的Yt-结合缓冲液通过亲和层析柱，流速lmL/min。可循环上样，使得柱子与配体结合充分。
[0094]4)再用洗涤缓冲液(Tris-HCl缓冲液，浓度为0.05mol/L)清洗残余未结合的蛋白，流速lmL/min。
[0095]5)用乳糖溶液竞争洗脱，流速lmL/min。收集洗脱峰。
[0096]6)用SDS-PAGE检测收集的目的蛋白(图3)，并透析冻干剩余蛋白。
[0097]试验例I从杨树菇中提取的总蛋白混合物(Yt)的免疫佐剂效应的试验
[0098]1.试验材料及方法
[0099]1.1供试材料
[0100]实施例1中从杨树菇中提取的总蛋白混合物(Yt)。
[0101]1.2试验方法
[0102]1.2.1H9N2禽流感病毒的增殖、血凝试验和病毒纯化
[0103]1.2.1.1 病毒增殖
[0104]将H9N2型禽流感病毒原液作10倍稀释，接种于9~11日龄无母源抗体的鸡胚尿囊腔，接种数枚鸡胚，每枚接种0.2mL，以石蜡封口，至于37°C恒温培养箱培养，24h观察，死胚弃去，收集24~72h间死亡的鸡胚尿囊液和接种后72h存活胚4°C过夜收集其尿囊液，作血凝试验(微量法)，出现血凝阳性(滴度大于128)者混匀，1000Orpm离心后分装，于一70°C冻存备用。
[0105]1.2.1.2血凝试验方法:
[0106] I)在微量反应板的I孔~12孔均加入50 μ L生理盐水，换枪头。[0107]2)吸取50 μ L H9N2病毒鸡胚尿囊液加入第I孔，混匀。
[0108]3)从第I孔吸取50 μ L病毒液加入第2孔,混匀后吸取50 μ L加入第3孔,如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取50 μ L弃之，换枪头。
[0109]4)每孔均加入50 μ L体积分数为I %鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入)
[0110]5)振荡混匀，在室温(20~25°C)下静置40min后观察结果(如果环境温度太高，可置4°C环境下反应1小时)。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。
[0111]6)结果判定
[0112]将板倾斜，观察血凝板，判读结果(见表1)。
[0113]表1血凝试验结果判断
[0114]
【权利要求】
1.从杨树燕(Agrocybeaegerita)中提取分离的具有免疫佐剂作用的总蛋白混合物，其特征在于，该总蛋白混合物的提取方法包括: (1)将杨树菇粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提得到抽提液； (2)将步骤(1)所得到抽提液用分段硫酸铵盐析法进行沉淀； (3)将步骤(2)所获得的沉淀用水或磷酸盐缓冲液重悬后，透析、干燥，即得。
2.按照权利要求1所述的总蛋白混合物，其特征在于:步骤(1)将杨树菇子实体烘干粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提2-3次；步骤(2)中将抽提液过滤，将滤液采用分段硫酸铵盐析法进行沉淀。
3.按照权利要求2所述的总蛋白混合物，其特征在于:所述的分段硫酸铵盐析法为:按体积比计，向滤液中加入硫酸铵至0.1-40%饱和度,搅拌、离心,弃沉淀,取上清；向上清中加入硫酸铵至40-80 %饱和度，离心，取沉淀。
4.从杨树燕(Agrocybeaegerita)中提取分离的具有免疫佐剂作用的蛋白组分,其特征在于，该蛋白组分的提取方法包括: (1)将杨树菇粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提； (2)将步骤(1)所得到抽提液采用分段硫酸铵盐析法进行沉淀； (3)将沉淀用水或磷酸盐缓冲液重悬后，透析、干燥，得到蛋白提取物； (4)将蛋白提取物用水或磷酸盐缓冲液重悬后得到药液，将药液循环上样过非极性大孔吸附树脂柱，将药液中的蛋白质成分和小分子成分相分离，收集蛋白质成分，即得。
5.按照权利要求4所述的蛋白组分，其特征在于:步骤(1)将杨树菇子实体烘干粉碎后用水或磷酸盐缓冲液浸泡抽提2-3次；步骤(2)中将抽提液过滤，将滤液用分段硫酸铵盐析法进行沉淀；所述的分段硫酸铵盐析法为:向滤液中加入硫酸铵至0.1-40%饱和度，搅拌、离心，弃沉淀，取上清；向上清中加入硫酸铵至41-80%饱和度，离心，取沉淀；步骤(4)中所述的非极性大孔吸附树脂柱为大孔吸附树脂HP-20柱；步骤(4)中所述药液的浓度为0.1-lOmg/mL ;药液的上样速度为0.5-lmL/min。
6.权利要求1-3任何一项所述的总蛋白混合物作为疫苗免疫佐剂或在制备提高机体免疫力药物中的用途。
7.权利要求4-6任何一项所述的蛋白组分作为疫苗免疫佐剂或在制备提高机体免疫力药物中的用途。
8.从杨树菇中分离纯化的凝集素AAL，其特征在于:其氨基酸序列为SEQID N0.2所示。
9.编码权利要求7所述凝集素AAL的基因，其特征在于:所述基因的核苷酸序列为SEQID N0.1 所示。
10.权利要求8所述的凝集素AAL作为疫苗免疫佐剂或在制备提高机体免疫力药物中的用途；权利要求9所述的基因在制备疫苗佐剂或提高机体免疫力药物中的用途。
【文档编号】C07K1/16GK103923165SQ201410181698
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】马立保, 孙慧, 黄敏, 张金林, 胡晓芬, 吴艳丽, 吴晓明 申请人:武汉华扬动物药业有限责任公司