专利名称：葡聚糖引发子受体和编码该受体的dna分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及葡聚糖引发子受体(下文有时称为“ER”)，编码ER的DNA分子，含该DNA分子的载体和用该DNA分子转化的植物细胞。更具体地说本发明涉及得自大豆根原生质膜组分的ER，编码ER的DNA分子，含该DNA分子的载体和用该DNA分子转化的植物细胞。
背景技术：
已知植物对病原体感染作出的反应是合成并积累称为植物抗毒素的抗菌剂(M.Yoshikawa(1978)Nature 257546)。发现有些植物病原体含有诱导其完成所述抗性反应的物质(N.T.Keen(1975)Science 18774)，称为“引发剂”。据认为从病原体感染植物到合成并积累植物抗毒素的生化过程如下病原体的菌丝体侵入植物细胞时，植物细胞中的葡聚糖酶启动以便裂解病原体菌丝体壁表面上的多糖，从而释放引发子。如果引发子与植物细胞中的受体结合，则产生在信号传导中起作用的第二信使。信号传导物质被掺入植物细胞核中，然后激活编码植物抗毒素合成酶之基团的转录以诱导植物抗毒素的合成。同时，抑制植物抗毒素降解，从而有效地积累植物抗毒素。
在大豆抗性中起重要作用的植物抗毒素被称为glyceollin，而且已确定了其结构(M.Yoshikawa et al.，(1978)Physiol.Plant.Pathol.1273)。引发子是一种葡萄糖的多糖，而且据报道是含有β-1，6和β-1，3键的葡聚糖(J.K.Sharp et al.(1984)J.Biol.Chem.25911321，M.Yoshikawa(1990)Plant CellTechnology 1.2695)。据认为有关大豆致病霉菌大雄疫霉(phytophthora megasperma)f.sp.glycinea之葡聚糖引发子的特异性受体是一种在合成和积累抗菌剂glyceollin中起重要作用的蛋白质。已公开了纯化所述引发子特异性之ER的方法(E.G.Cosioet al.(1990)FEBS 264235，E.G.Cosio et al.(1992)Eur.J.Biochem.2041115，T.Frey et al.(1993)Phytochemistry32543)。然而还未确定所述ER的氨基酸序列，而且为其编码的基因也是未知的。
本发明的一个目的是提供葡聚糖引发子受体。
本发明的另一目的是提供编码葡聚糖引发子受体的DNA分子。
本发明的再一目的是提供含编码葡聚糖引发子受体之DNA分子的载体。
本发明还有一目的是提供用编码葡聚糖引发子受体之DNA分子转化的植物细胞。本发明的公开内容为解决上述问题而进行的各种研究的结果是，本发明人成功地纯化了大豆根衍生的ER并从大豆cDNA文库克隆了ER基团，从而完成了本发明。本发明提供了葡聚糖引发子受体，它具有基本上如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。本发明还提供含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子，和其片段，所述受体具有基本上如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。本发明还提供含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的，掺入质粒pER23-1中的DNA分子和其片段。本发明还提供含编码葡聚糖引发子受体之DNA分子的载体和用编码葡聚糖引发子受体之DNA分子转化的植物细胞。
图1表示三种纯化步骤的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2是质粒pER23-1和pER23-2的图谱。
图3表明构建质粒pKV1-ER23的方法。
图4表示将引发子加入到培养的大豆细胞中后，细胞内Ca2+浓度有暂时的增加。
图5表示将引发子加入到转化的西红柿培养细胞中后，细胞内Ca2+浓度有暂时的增加。
图6表示在E.coli中表达的全长或部分ER的引发子-结合活性。
图7表示用抗引发子-结合区的抗体抑制引发子与大豆子叶膜组分中引发子结合蛋白的结合。
图8表示用抗引发子-结合区的抗体抑制引发子诱导的植物抗毒素在大豆子叶中的积累。
完成本发明的优选实施方案本发明的葡聚糖引发子受体是一种具有作为衍自于植物病原体，特别是疫霉属之葡聚糖引发子受体的功能的蛋白质。更具体地说，它是一种在植物病原体，尤其是疫霉属的微生物侵入时，与由植物细胞中β-1，3-葡聚糖酶裂解的部分病原体菌丝体壁产生的葡聚糖引发子结合并随后使植物细胞中的微粒体和核产生数量增加的植物抗毒素的蛋白质。本发明的葡聚糖引发子受体具有基本如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。“基本如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列”包括示于SEQ ID NO1的氨基酸序列，其中可以有氨基酸缺失、取代或叠加，只要它们能保持葡聚糖引发子受体的功能。
例如可以用部分改进的Cosio′s方法(E.J.B.(1992)2041115)生产本发明的葡聚糖引发子受体。简而言之，将大豆优选的是仔荷麦鸽(green homer)品种的根、叶和茎，匀浆，然后从所得浆液中收集膜组分，用离子交换层析纯化，接着再用引发子为配体的亲和层析进行进一步纯化。亲和层析中所用的引发子优选地是得自大雄疫霉(Phytophthora megasperma)f.sp.glycinea种1(ATCC34566)，因为它对于green homer是不相容的(即对该病原体有抗性)。
按如下可确定因此所得的葡聚糖引发子受体的氨基酸序列用电印迹将纯化的ER转移到PVDF膜(Millipore Co.)上，然后用赖氨酸内肽酶(AP-I)消化。从PVDF膜回收切割的肽，然后用反相HPLC(μ-Bondasphere 5μC8)分级分离。用气相蛋白测序仪(Applied Biosystems Co.)分析峰组分。
本发明的ER在说明植物对真菌的抗性机制并研制能诱导对真菌有抗性的引发子衍生物方面是有用的，而且用其可作为生产抗ER抗体的抗原。
本发明包括含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子和其片段。本发明的DNA分子优选地至少有一个与3′末端相连的终止密码子(如TAG)。
更具体地说，本发明涉及含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子和其片段，所述受体具有基本上如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。“含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子”包括所有简并异构体。术语“简并异构体”指由不同简并密码子编码相同多肽的DNA分子。以具有SEQ ID NO2之核苷酸序列的DNA分子为例，将其中编码任何氨基酸的密码子，如编码Asn的AAC密码子转变为简并密码子AAT的DNA分子被称为简并异构体。所述简并异构体的实例包括含有SEQ ID NO2所示之核苷酸序列的DNA分子。
另一方面，本发明提供掺入质粒pER23-1的含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子和其片段。用质粒pER23-1转化的E.coli DH5αEKB633于1994年6月15日被保藏于NationalInstitude of Bioscience and Human-Technology the Agency ofIndustrial Science and Technology，保藏号为FERM BP-4699。
含有编码本发明葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子片段可含有编码SEQ ID NO1之氨基酸序列的核苷酸序列。
含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列和其片段的本发明DNA分子可选择地在朝5′末端的上游区与起始Met的ATG密码子和转译框架结合，而且也在朝5′末端的上游区和朝3′下端的下游区与作为非转译区的有适当长度的其它DNA分子相连。
含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列和其片段的本发明DNA分子通常可作为质粒或噬菌体DNA分子的组成部分形式或作为导入微生物(尤其是，包括E.coli和农杆菌的细胞)、噬菌体颗粒或植物的质粒、噬菌体或基团组DNA分子的组成部分形式存在。
为了在植物中稳定地表达编码葡聚糖引发子受体的DNA分子和其片段，可以以适当的结合将启动子，编码启始密码子的DNA分子(ATG)和终止子加到本发明的DNA分子的其片段中。启动子的实例包括编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位基团的启动子(Fluhret al.，Proc-Natl.Acnd.Sci.USA(1986)832358)，胭脂碱合成酶基因的启动子(Langridge et al.，Plant Cell.Rep.(1985)4355)，生产花椰菜花叶病毒19S-RNA的启动子(Guilley etal.，Cell(1982)30763)，生产花椰菜花叶病毒35S-RNA的启动子(Odell et al，Nature(1985)313810)等。终止子的实例包括胭脂碱合成酶基因的终止子(Depicker et al.，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)和章鱼碱合成酶基因的终止子(Gielenet al.，EMBO J.(1984)3835)。
通过包括用合成核酸的常规方法化学合成至少部分DNA分子并用常规方法(例如免疫学方法或杂交方法)用合成的DNA分子为探针从适当的cDNA文库中得到所需DNA分子的方法可以得到编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子。在上述方法中所用的某些质粒、各种限制酶，T4 DNA连接酶和其他酶可从商业途径获得。可以用在Molecular Cloning，J.Sambrook et al.，CSH Laboratory(1989)，Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel et al.，Johu Wiley & Sons(1987)及其他文献中描述的方法完成DNA克隆，质粒的构建、宿主的转染、转染子的培养、从培养物中回收DNA分子及其他步骤。
更具体地说，可以按如下所述得到含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的本发明DNA分子从葡聚糖引发子受体的氨基酸序列筛选两种部分氨基酸序列。制备可编码所选部分序列之C末端的所有碱基组合物引物和可编码所选部分序列之N末端的所有碱基之组合的引物。以这些合成的引物作为混合引物，用合适的大豆DNA文库的DNA分子为模板完成两次PCR。随后检出预期扩增的所给长度的两个扩增片段(这些片段与编码上述两种部分氨基酸序列的DNA分子相对应)，然后确定其核苷酸序列。以所确定的核苷酸序列为基础，合成具有编码定位于葡聚糖引发子受体的C末端测面的氨基酸部分序列之C末端的核苷酸序列的引物和编码位于葡聚糖引发子受体的N末端侧氨基酸部分序列之N末端的核苷酸序列的引物。用上述大豆cDNA文库的DNA分子作为模板，用这两种合成引物进行PCR。用所得的扩增片段为探针与上述大豆cDNA文库杂交，由此得到含编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子。
可以用任何已知方法，例如Maxam-Gilbert法(MethadsEnzymol，65499，1980)，使用M13噬菌体的双脱氧核苷酸链终止法(J.Messing et al.，Gene，19269，1982)并将所得的含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子测序。
由于对葡聚糖引发子所进行的各种研究表明葡聚糖引发子受体在植物对真菌的抗性中起重要作用，所以如果用常规方法将本发明编码葡聚糖引发子受体的DNA分子及其片段导入没有葡聚糖引发子受体的植物细胞(特别是高等植物细胞)并在其中表达，则它们可赋予植物对真菌的抗性。已经有人提示，能够感染植物的真菌通常有抑制剂，由此获得了抑制植物之真菌抗性的能力。希望通过导入并表达编码本发明葡聚糖引发子受体的DNA分子和其片段以使ER发挥作用或通过修饰DNA分子及其片段或通过调节其表达数量可以研制具有真菌抗性的植物。另外，如果将本发明的DNA分子和其片段与提高真菌抗性的基因或赋予植物真菌抗性的特性，如葡聚糖酶基因一起导入植物细胞，特别是高等植物细胞，并在其中表达，则预期植物可获得比仅导入葡聚糖酶情况更高的真菌抗性。
可以构建用于导入编码葡聚糖引发子受体及其片段之DNA分子的载体以便在植物中可以稳定地表达葡聚糖引发子受体。更具体地说，以适当的组合将启动子，编码启动密码子(ATG)的DNA分子和终止子与编码葡聚糖引发子受体的DNA分子及其片段相连。启动子的实例包括编码1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位的基团的启动子(Fluhr et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)832358)，胭脂碱合成酶基因的启动子(Langridge et al.，Plant Cell.Rep.(1985)4355)。生产花椰菜花叶病毒19S-RNA的启动子(Guilley et al.，Cell(1982)30763)，生产花椰菜花叶病毒35S-RNA的启动子(Odell et al.，Nature(1985)313810)等。终止子的实例包括胭脂碱合成酶基因的终止子(Depicker et al.，J.Mol.Appl.Gen.(1982)1561)和章鱼碱合成酶基因的终止子(Gielen et al.，EMBO J.(1984)3835)。
用已知方法，例如在“Plant genetic transformation andgene expression；a laboratory manual”，J.Draper等人编，Blackwell Scientific出版社1988中描述的方法，可将编码葡聚糖引发子受体的DNA分子及其片段导入植物细胞。所述方法还包括生物学方法，如用病毒或农杆菌的方法以及生理化学方法如电穿孔、聚乙二醇法、微注射法等。
参考下列实施例将更详细地说明本发明，所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例1纯化大豆根衍生的ER1)测量ER的葡聚糖引发子受体结合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引发子(平均分子量10,000)和酪胺(TOKYO KASEI KOGYOCO.，LTD)的复合物，用使用氯胺T的碘标记引发子-酪胺复合物。
将样品(蛋白质量＜500μg)悬于500μl检测缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.4，0.1M糖，5 mM MgCl2，1mM PMSF和5mMEDTA)中，然后于0℃保温2小时，将7.0nM(70Ci/mmol，其于推测引发子的分子量为10,000而计算摩尔数，这也用于下列描述)的I标记的引发子-酪胺复合物加到悬浮液中，并将混合物于4℃保温2小时，将反应溶液通过Whatman GF/B过滤，如同用0.3％聚乙烯亚胺水溶液至少处理一小时一样。用5ml冰冷缓冲液(10mMTris-HCl pH7.0，1M NaCl，10mM MgCl2)将残留物洗涤3次。用γ计数器计数滤器上剩余的放射活性(计数A)。为了消除非特异性结合的影响，除将17μM引发子加到相同的样品中外，完成与上述相同的过程，将混合物悬于检测缓冲液中，然后将悬浮液于0℃保温2小时。用所得的计数减去计数A以得到引发子特异性结合的计数(Δcpm)。所得的计数(Δcpm)除总计数，然后乘以实验中所用的引发子总量以计算引发子结合的蛋白质量(以摩尔计)。
用上述方法检测ER的纯度。2)纯化大豆根衍生的ER将大豆(Glycine max cv.Gree Homer)种子(Takayama SeedCo.)在蛭石上种植1周，然后水培养15天以收集根(约40kg，湿重)。在将其用于纯化ER前，将收集的根贮存于-80℃。将1.25L冰冷缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.0，30mM MgCl2，2mM DTT，2.5mM偏亚硫酸氢钾和1mM PMSF)加到根(2kg，湿重)中，然后用Waring Blander将混合物匀浆2分钟。
将所得的浆液通过Miracloth(Calbiochem Co.)过滤，然后以9,000rpm，于4℃将滤液离心15分钟。将上清液以37,000rpm于4℃超离心20分钟。将沉淀悬于160ml冰冷缓冲液(25mMTris-HCl pH 7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)以得到膜组分。将两性洗涤剂ZW3-12(Boehringer Co.)以0.25％的终浓度加到膜组分中以溶解来自膜组分的ER，将混合物于8℃搅拌30分钟。将所得混合物以37,000rpm，于4℃超离心20分钟以收集含溶解的ER的上清液(可溶的组分)。将可溶的组分(165ml)对2L缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.2％ZW3-12，4℃)透析4次。将5ml Protrap(TAKAPA Situzo Co.LTD)加到样品中，将混合物于8℃搅拌30分钟以除去样品中的蛋白酶并稳定ER。于4℃，将所得混合物以2,800rpm离心2分以收集上清液。用超滤膜YM-10(Amicon Co.)将所得的上清液(160ml)浓缩到约50ml，然后将浓缩物对-A缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.1M蔗糖，5mMMgCl2，1mM PMSF，5mM EDTA和0.2％ZW3-12，4℃)透析。
将透析物加到Q-Sepharose HP 26/10(Pharmacia Co.)，然后用0-1M NaCl的线性梯度洗脱ER(Q-Sepharose活性组分)。ER在约0.45M的NaCl浓度被洗脱。用A缓冲液将Q-Sepharose活性组分稀释3倍，再将稀释的组分加到Mono Q10/10(PharmaciaCo.)。用0-1M NaCl线性梯度洗脱ER(Mono Q活性组分，8ml)。ER于约0.25M的NaCl浓度被洗脱。
按如下所述用引发子为配体经亲和凝胶纯化ER按N.T.Keen，经某些改动来制备引发子(Plant Physiol.(1983)71460 Plant Physiol(1983)7466)。简而言之，用zymolyase 100T(KIRIN BREWERY CO.LTD)处理病原体大雄疫霉(Phytophthora megasperrna)f.sp.glycinea种1(ATCC 34566)的菌丝体壁以释放引发子。处理后，通过吸附在装于柱中的CM-纤维素上而除去Zymdyase 100T。用凝胶渗透层析G-75(PharmaciaCo.)纯化所得的流出物组分以收集平均分子量为10,000 Da的引发子组分。用M.Yoskikawa的方法(Nature(1978)257546)确定所收集组分的glyceollin诱导的引发子活性。将8μg引发子加到大豆子叶中会在培养24小时后，诱导550μg的glyceollin。
为了消除在凝胶载体上的非特异性吸附，收集Mono Q活性组分，然后于8℃与约33mg麦芽糖-偶联的玻璃凝胶(床体积约100μl)一起搅拌1小时。离心(1000rpm，4℃，2分钟)沉淀凝胶以收集上清液(麦芽糖-偶联的玻璃凝胶流出物组分)。用A.M.Jeffrey等人的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun(1975)62608)制备麦芽糖偶联的玻璃凝胶。简而言之，将120mg麦芽糖和6g GlassAminopropyl(Sigma Co.)悬于36ml水中，在室温下将悬浮液搅拌过夜。将36ml乙醇加到所得的悬浮液中。紧接着将乙醇(72ml)中的氢硼化钠(864mg)加到混合物中。将所得的混合物声处理2分钟，然后于室温搅拌5小时。将水(288ml)加到反应混合物中，用冰冷却所得的混合物，用乙酸将pH调到5.6。用1.8L水洗涤凝胶以除去游离的麦芽糖。通过使用蒽酮剂的J.H.Roe的方法(J.Biol.Chem.(1955)212335)定量确定洗涤溶液中所含的麦芽糖。由洗涤溶液中所含的麦芽糖量估计凝胶-偶联的麦芽糖量。结果，发现60mg麦芽糖与6克Gless Aminopropyl偶联。
将约17mg引发子偶联的玻璃凝胶(床体积约50μl)加到8ml麦芽糖偶联的玻璃凝胶流出物组分中，将混合物于8℃缓慢搅拌过夜。离心(1,000rpm，4℃，2分)收集凝胶，然后用2倍床体积的缓冲液A洗涤2次。另外再用4倍床体积的0.1％SDS将凝胶洗涤3次以收集凝胶偶联的ER(引发子偶联的玻璃凝胶洗脱组分)。用A.M.Jeffrey等人的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1975)62608)制备引发子偶联的玻璃凝胶。简单地说，将引发子(37mg)和Glass Aminopropyl(490mg)悬于6ml水中，然后于室温搅拌过夜。将乙醇(6ml)加到悬浮液中，紧接着加入氢硼化钠(144mg)溶于乙醇(12ml)中的溶液。用声处理混合物2分钟，然后于室温搅拌5小时。将48ml水加到所得的混合物中。用冰冷却混合物，用乙酸将pH调到5.6。用蒽酮试剂定量确定游离的引发子。从洗涤液中所含的游离引发子量确定凝胶偶联的引发子量。结果，发现34mg引发子与490mg Glass Aminopropyl偶联。
表1中总结了上述纯化步骤中的蛋白质和ER量。
表1.上述纯化步骤中的蛋白质和ER量(用湿重为40kg的大豆根为起始材料)蛋白质(mg) ER(pmol)膜组分 17900 30可溶组分 2000214Q-Sepharose活性组分 190 205Mono Q活性组分 49 233麦芽糖偶联的玻璃凝胶流出物组分45 220引发子偶联的玻璃凝胶洗脱组分 0.004*45*通过SDS-PAGE后，银染色所得到的带强度估测。
在电泳梯度凝胶，SDS-PAGE板10/20(Daiich Kagaku YakuhinCo.)上电泳Mono Q活性组分，来自麦芽糖偶联的玻璃凝胶的流出物组分和来自引发子偶联的玻璃凝胶的洗脱组分(各10μl)，然后用银(Daiich Kagaku Yakuhin Co.)染色。电泳图示于图1。图1中，道1是Mono Q活性组分，道2来自麦芽糖偶联的玻璃凝胶的流出物组分和道3来自引发子偶联的玻璃凝胶的洗脱组分。图1表明在分子量为约70,000Da时，检测到ER带。
通过使用125I标记的摄影亲和剂SASD(Pierce Co.)和引发子的复合物，用125I标记分子量为约70,000的蛋白质。用Western印迹将膜组分的SDS-PAGE带转移到PVDF膜上，然后与在测量PVDF膜上ER的引发子结合活性中所用的相同的125I标记的引发子一起保温以便用125I标记分子量为约70,000Da的蛋白质。这些事实表明分子量为约70,000Da的蛋白质具有引发子结合活性。
用上述方法从约40kg湿重的大豆根中纯化了约4μg ER。3)分析ER片段的肽通过用蛋白酶消化而使ER成片段得到肽。用Iwamatsu的方法(Akihiro Iwamatsu，Seikagaku(1991)63139，A.Iwamatsu，Electrophoresis(1992)13142)确定形成片段肽的氨基酸序列。用Centricon-30(Amicon Co.)将用上述方法纯化的ER溶液浓缩到约100μl，然后经10-20％聚丙烯酰胺SDS电泳。用电印迹装置(Sartrias Co.)将所得的蛋白质带转移到PVDF膜(Millipore Co.)上。用0.1％Ponceau S(Sigma Co.)/1％乙酸将转移到PVDF膜上的带染色。切下分子量为70,000Da的主带，用0.5mM NaOH脱色。将该带还原性地进行S-羧甲基化。以酶∶底物(mol∶mol)为1∶100的比率将赖氨酰内肽酶(AP-1)加到所得的带中，使混合物于30℃反应16小时。将所得成片段的肽加到经98％溶剂A和2％溶剂B平衡的μ-Bondasphere 5μC8-300(2.1×150mm，水)柱，用2-50％溶剂B线性梯度以0.25ml/分的流速洗脱30分钟(溶剂A0.05％TFA溶液；溶剂B在2-丙酸∶乙腈＝7∶3(v/v)中的0.02％TFA)。用214nm的吸收值检测洗脱肽，手工收集各峰组分。用气相蛋白质测序仪(Model 470A of Applied Biosystems)分析所得的峰组分。所有所得峰组分的分析结果是明确地确定了成片段的肽的下列氨基酸序列。#1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Asn Ile Ser Pro Gln(N-末端)#5Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val Gly Asp Ser#6Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp#7Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile Lys(混合序列)实施例2大豆ER基因的克隆1)制备大豆mRNA在蛭石上将大豆(Glycine max cv.Green Homer)种子(Takayama Seed Co.)种植1周，然后水培养15天以收集根(约40kg，湿重)。将收集的根贮于-80℃直到使用。用Ishida的方法(Cell Technology Laboratory Manipulation Manual，KodanshaScientific)得到总RNA。简而言之，在研钵中边加入液氮边磨碎贮存的根(28.5g，湿重)。同时向所得的粉中加入65℃的35.6ml GTC溶液，然后用Waring Blender将混合物匀桨。将所得的悬浮液于室温6,000rpm离心15分钟以收集40ml的上清液。在离心管中铯缓冲溶液垫层上缓慢铺上一层上清液，然后以35,000rpm；于25℃离心20小时。将所得的沉淀溶于9ml TE/0.2％SDS中。酚/氯仿提取2次后，经乙醇沉淀回收总RNA(4.37mg)。
用oligotex dT30(Japan Roche Co.)按手册所述纯化所得的总RNA(2.2mg)以得到60μg的poly(A)+RNA。2)制备大豆cDNA文库按手册用cDNA合成盒(Pharmacia Co.)从5μg poly(A)+RNA合成cDNA分子。将合成的cDNA片段用T4连接酶(TAKARASHUZO CO.，LTD)与λ噬菌体载体λgt10(Stratagene Co.)相连。用Gigapack(Stratagene)将DNA混合物包装到噬菌体颗粒中以制备约1.5×106pfu的大豆cDNA文库。将文库扩增到160ml的1.6×1011pfu/ml的大豆cDNA文库。
按如下所述制备cDNA文库中的总DNA以等量将氯仿/异戊醇(24∶1)加到500μl噬菌体溶液(1.6×1011pfu/ml)中。将混合物振荡30秒，然后离心收集水层。再用氯仿/异戊醇(24∶1)提取水层。向所得的水层加入5μl 3M乙酸钠溶液(pH 5.4)和125μl乙醇，将混合物离心收集沉淀。用70％乙醇洗涤沉淀，然后将其溶于含1μg/ml RNase A(SigmaCo.)的10mM Tris-HCl溶液(pH8)中。用该溶液作为PCR模板。3)用PCR扩增并克隆大豆ER cDNA片段以实施例1所得的成片段肽的氨基酸序列(#5和#6)为基础，用自动核酸合成仪(Applied Biosystems Co.的Model 394)合成下列四种寡脱氧核苷酸(混合引物U5，U7，U10，和U12)引物 U5 5′-AARAGYATHGAYGGNGA-3′引物 U7 5′-WRTCNCCNACNAC-3′引物 U10 5′-GTNAAYAARATNCARAC-3′引物 U12 5′-ARRTTNAGRAARTCYTC-3′(RA/G，YC/T，WA/T，HA/C/T，NA/G/T/C)将0.5μg cDNA文库中的总DNA溶于79μl蒸馏水中。将引物U5和U7或者引物U10和U12(各100pmol)的组合和0.5μl TaqDNA聚合酶(TAKAPA SHUZO CO.LTD)加到溶在10μl的10×PCR缓冲液(TAKAPA SHUZO CO.LTD的Taq DNA聚合酶所附的)中的8μl2.5mM dNTP中以得到100μl的总量。用Gene Amp PCR System 9600(Perkin-Elmer Co.)进行50个循环的PCR反应，每循环包括1)于94℃变性30秒，2)于47℃变性30秒和3)于72℃延长分钟。反应后，在15％聚丙烯酰胺凝胶上电泳15μl的反应溶液。用0.5μg/ml溴化乙锭溶液将凝胶染色10分钟。在UV光下观察同时切下表明有预期扩增的40bp和47bp特异性扩增片段的带。用塑料棒将凝胶切片磨碎，用洗脱缓冲液(0.5M乙酸铵，10mM乙酸镁，1mM EDTA和1％SDS)洗脱过夜，收集含DNA的溶液。
将收集的DNA片段用pT7Blue T-载体盒(Novagene Co.)克隆到质粒pT7Blue(R)中。用荧光自动DNA测序仪(Applied BiosystemCo.的Model 373A)将所得的质粒P#5-1，2，和P#-1，2，3，4，5，6，7，8，和9测序。结果表明所得的扩增DNA片段除含引物外还编码肽片段#5和#6的氨基酸序列。
以DNA测序结果为基础，用自动核酸合成仪合成下列两种寡脱氧核苷酸(混合的引物U18和U19)引物 U18 5′-AAGTAYAAGCCRCAAGCCTATTCA-3′引物 U19 5′-ATCGCCRACAACMCCAA-3′(Y和R如上定义，MA/C)将0.5μg cDNA文库中的总DNA溶于79μl蒸馏水中。将引物U18和U19(各100pmol)组合和0.5μl Taq DNA聚合酶加到溶于10μl 10×PCR缓冲液中的8μl 2.5mM dNTP中以得到100μl的终量。完成40个循环的PCR反应，每循环包括1)于94℃变性30秒，2)于52℃变性30秒和3)于72℃延长1分。在1％琼脂糖凝胶上电泳15μl反应溶液。
用0.5μg/ml溴化乙锭溶液将凝胶染色15分钟，在紫外光下观察同时切下约540bp的特异性扩增片段带。用Gene Clean II(Bio101 Co.)处理切下凝胶以收集含DNA的溶液。
用pT7Blue T载体盒将收集的DNA片段克隆到质粒pT7Blue(R)中。用荧光测序仪将所得的质粒P#5-P#6测序。结果表明该扩增的DNA片段由539bp组成并且不仅编码在两侧的肽片段#5和#6之氨基酸序列，也编码在扩增部分的肽#7。4)通过杂交筛选并克隆文库用限制酶BamHI和PstI消化在其中克隆了ER cDNA片段的质粒#5-#6。回收约540bp的DNA片段并用作为探针。用MegaprimeDNA标记系统(Amersham Co.)按手册所述用[α-32P]dCTP标记回收的DNA片段，将所得的反应溶液用于杂交实验。
用E.coli C600hf1(Invitrogen Co.)感染cDNA文库的噬菌体，然后接种在含10mg/ml MgCl2的直径约15cm的平板上，以形成共约1×106个噬菌斑。将噬菌斑吸印在尼龙膜(Hybond-NAmersham Co.)上。将所述膜与32P-dCTP标记的ER cDNA片段反应，再用相同的方法筛选经自显影检测到的阳性噬菌体以得约30个有不同信号强度的噬菌体克隆。筛选含有最长插入DNA片段的克隆λER23。
用LambdaSorb(Promega Co.)从在杂交实验中分离的阳性克隆λER23溶液中纯化的λ噬菌体DNA分子。将10μl 10×EcoRI裂解缓冲液(限制酶EcoRI 10U)加到5μg的DNA溶液中以达到100μl的总量，将混合物于37℃过夜反应。在1％琼脂糖凝胶上将反应溶液电泳。切下约2.3kb的带，用Gene Clean II(Bio101 Co.)处理以收集含DNA的溶液。用限制酶EcoRI裂解载体pBluescript II ks-(0.02μg)(Stratagere Co.)。
两种DNA溶液混合后，加入2μl 10×连接酶缓冲和0.2μl T4DNA连接酶(TAKAPA SHUZO CO.LTD)达到20μl总量。混合物于16℃反应4小时，用反应混合物溶液转化E.coli DH5α(Gibco BPLCo.)。用25ml含50μg/ml，氨苄青霉素，40μg/ml IPTG和40μg/ml X-gal的L培养基制备2％琼脂板培养基。将转化的E.coli接种在琼脂平板培养基上，于37℃生长过夜。从形成菌落中筛选白色菌落，然后在3ml含50μg/ml氨苄青霉素的L培养基中于37℃培养8小时。用碱法从这些细菌细胞中回收质粒，然后用限制酶确定它们是否是克隆了所需片段的克隆，由此得到与载体反方向的质粒pER23-1和pER23-2(52256bp)。质粒pER23-1和pER23-2的图谱示于图2。5)确定编码ER克隆的核苷酸序列通过1)使用经适当限制酶消化的质粒pER23-1和pER23-2，(2)使用基于上述确定的核苷酸序列资料而合成的适当引物，或(3)用限制酶KpnI和XhoI裂解pER23-1及用限制酶KpnI和ClaI裂解pER23-2，然后用千序列缺失盒(TAKAPA SHUZO CO.LTD)制备缺失了约200-300bp间隔的质粒，用荧光测序仪确定两个方向的质粒pER23-1和pER23-2的DNA核苷酸序列。DNA核苷酸序列示于序列表中的SEQ ID NO2。结果表明所述DNA片段含一编码667个氨基酸的2001bp的开放阅读框架，从相当于用氨基酸测序仪定序的N-末端序列(肽片段#1)开始。氨基酸序列示于序列表SEQ IDNO1。从所得DNA核苷酸序列推导的氨基酸序列与以前确定的大豆ER的氨基酸序列一致。
另外，使用核酸和氨基酸序列数据库(EntrezNCBI)，用核酸和氨基酸序列分析软件(MacvectorKodak Co.)检索高度同源的氨基酸序列。然而，未发现与到目前为止所知序列高度同源的氨基酸序列，因此，显然制备的ER是一种新蛋白质。实施例3在烟草植物中表达大豆ER1)植物表达质粒pKV1-ER23的构建如图3所示，从含花椰菜花叶病毒35S启动子的质粒pCaP35J(J.Yamaua et al.，(1988)Mol.Gen.Genet.211520)按如下所述制备本实施例中所用的植物表达载体pKV1。
用限制酶BamHI完全消化质粒pCaP35J以缺失35S启动子上游的多克隆位点。用PvuII部分消化后，用klenow片段(TAKAPA SHUZOCO.LTD)处理以得到平整末端。经连接将所得的质粒DNA环化，然后导入E.coli DH5α中。从所得的克隆中筛选所需的质粒。用限制酶PstI消化所选出的质粒以插入35S启动子下游的多克隆位点。用klenow片段处理以得到平整末端。用HindIII消化所得的质粒DNA。用自动核苷酸合成仪合成下列合成接头DNA，退火并与HindIII消化的质粒相连。将所得的质粒DNA导入E.coli DH5α。从所得的克隆中筛选所需的质粒pCaP35Y(2837bp)。5 ′-GGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′(SEQ ID NO3)5 ′-CCTTAAGCTCGAGCCATGGGCCCCCTAGGAGATCTCAGCTGGACGTCCGTACGTTCGA-3′(SEQ IDNO4)为了将胭脂碱合成酶的终止子导入pCaP35Y，用SacI和EcoRI消化质粒pBI121(Clontech Co.)，然后用Klenow片段处理SacI-EcoRI片段以得到平整末端，然后将所得的PBI121片段与质粒pCaP35Y相连，其中平整末端正好在35S启动子的HindIII位点下游。将所述质粒DNA导入E.coli DH5α。从所得的克隆中筛选所需质粒。为了将卡那霉素抗性盒导入所选的质粒中，用PvuII消化后者，并与pLGVneo1103(R.Hain et al.(1985)Mol.Gen.Genet.199161)的片段(约1620bp)相连，所述pLGVneo1103的片段是经在章鱼碱合成酶终止子下游的PvuII位点裂解，用Bal 31(TAKAPA SHUZOCO.LTD)处理以产生一缺失，在胭脂碱合成酶启动子上游的EcoRI位点裂解，然后在两端均产生平整末端而得到的。将所得的质粒导入E.coli DH5α。从所得克隆中筛选所需的质粒或植物表达载体pKV1(4828bp)。
用限制酶BamHI和SalI在特有的位点消化所制备的pKV1，然后与含ER基团的片段(即pEB23-1的BamHI-SalI片段，约2.3kbp)相连。将所得的质粒DNA导入E.coli DH5α。从所得克隆中筛选所需的ER-表达质粒pKV1-ER23(约7.1kbp)。2)在培养的烟草细胞中瞬时表达ER经电穿孔将ER基因导入培养的烟草细胞中以通过部分修改的Wetanabe法(Y.Wetanabe(1987)FEBS 21965)瞬时表达ER。用碱法纯化质粒pKV1-ER23的DNA分子。用Hirai等人的方法(PlantCell Cultivation Manual，Gakkai Shuppan Center，1982)得到用于瞬时表达ER的培养的烟草细胞。用1％次氯酸钠溶液对烟草种子(鲜黄色品种)东京大学的Hirofumi Uchimiya教授提供的进行消毒，然后使其萌发。将刚萌发的烟草组织植入烟草栽培琼脂培养基(Wurashige-Skoog培养基(Flow Laboratories Co.)，该培养基用2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸，3％蔗糖和8％琼脂补充)以便3周后诱发愈伤组织。将给1g愈伤物质悬于50ml烟草栽培培养基(Murashige-Skoog培养基(Flow Laboratories Co.)，用2ppm2，4-二氯苯氧乙酸和3％蔗糖补充)以制备培养的细胞。培养这些烟草细胞直到它们进入对数生长期。通过离心(600rpm，3分)收集培养的细胞，然后悬于由1％Cellulase Onozuka(Yakult Co.)，1％Dricelase(Kyoma Hakko Co.Ltd)，0.1％Pectriase(Seishin Seiyaku Co.)和0.4M D-甘露醇(Wako Pare ChemicalsCo.Ltd.)组成，并用HCl将pH调到5.7的溶液中。于30℃反应90分钟以制备原生质体。经3个循环的离心，于4℃，用0.4M D-甘露醇洗涤反应溶液以除去酶溶液。电穿孔操作包括将1×106细胞悬于0.8ml电穿孔溶液(70mM KCl，5mM MES和0.3M甘露醇)，将悬浮液与10μg pKV1-ER23的DNA分子混合，在电穿孔池(Biorad Co.电极相距0.4cm)中用基因脉冲仪(Biorad Co.)在125μF和300V处理混合物。处理后，用消毒移液管收集溶液，然后在冰上放30分钟。于30℃反应5分钟，将反应溶液再悬于原生质体培养基(Murashrige-Skoog培养基(Flow Laboratory Co.)，用0.2ppm2，4-二氯苯氧乙酸，1％蔗糖和0.4M甘露醇补充，pH调到5.7)中。将细胞放在黑暗中于25℃过夜。然后离心(8,000rpm，3分)收集。将60μl悬浮缓冲液(25mM Tris-HCl，pH 7.0，30mM MgCl2，2mM DTT，2.5mM偏二亚硫酸钾和1mM PMSF)加到细胞中，在旋转仪上将混合物搅拌3分钟。将所得的样品贮于-80℃直到进行引发子结合实验。
作为对照，重复上述过程，不同的是用pKV1的DNA分子代替pKV1-ER23导入烟草细胞。3)在烟草悬浮液培养细胞中稳定表达ER从瞬时表达ER的培养烟草细胞中按如下所述筛选能恒定保留ER基因的转化的培养的烟草细胞将在制备能瞬时表达ER的培养烟草细胞中得到的原生质体悬于含1％琼脂糖的原生质体培养基(Murashige-Skoog培养基(FlowLaboratory Co.)，用0.2ppm 2，4-二氯苯氧乙酸，1％蔗糖和0.4M甘露醇补充，pH调到5.7)中。在琼脂糖固化前，用滴管将悬浮液滴在平板上，从而将原生质体固定在珠样的固体培养基中。琼脂糖固化后，将无琼脂糖原生质体培养基加到平板中，从而将固定了原生质体的琼脂糖培养基浸没于液体培养基中。将原生质体在暗中培养1周后，加入卡那霉素达到100μg/ml的终浓度，然后继续培养。将从生长菌落中所选的转化体转移到含卡那霉素的液体培养基中，然后培养。
得到两个用pKV1-ER23稳定转化的培养烟草细胞的克隆(I1和I6)和2个由pKV1稳定转化的培养烟草细胞的克隆(C2-1和C2-4)。4)引发子结合活性实验按如下所述测量引发子结合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引发子和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.，LTD)复合物。使用氯胺T，用125I标记引发子-酪胺复合物。将所得样品(蛋白质量＜500μg)悬于500μl检测缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)中，于0℃保温2小时。以100nM(70Ci/mmol)的量将碘标记的引发子-酪胺复合物加到悬浮液中，于4℃将混合物保温2小时。将反应溶液通过Whatman GF/B过滤(与用0.3％聚乙烯亚胺水溶液处理至少1小时一样)，然后用5ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.0，1MNaCl，10mM MgCl2)洗涤3次。用γ计数器计数在滤膜上保留的放射活性(计数A)。为了清除非特异性结合的影响，完成与上述相同的过程，不同的是将17μM引发子加到相同的样品中，混合物悬于检测缓冲液，然后将悬浮液于0℃保温2小时。所得的计数减去计数A，得到引发子特异性结合的计数(Δcpm)。所得的计数(Δcpm)除以计数总值，然后乘以实验中所用的引发子总量，从而计算出引发子结合蛋白的量(mol计)。
结果，在用pKV1-ER23的DNA分子转化的烟草细胞中观察到与引发子的特异性结合，而在导入pKV1之DNA分子的对照烟草细胞中未观察到与引发子的特异性结合(表2)。这一结果表明上述所得的基因编码具有引发子结合活性的蛋白质。
表2.培养的烟草细胞的引发子结合活性组分 转化DNA结合活性(fmol/mg)瞬时表达 pKV1 ＜0pKV1-ER23 90.5稳定表达C2-1 pKV1 ＜0C2-4 pKV1 ＜0I1pKV1-ER23 150I6pKV1-ER23 1965)通过加入葡聚糖引发子在转化的烟草培养细胞中瞬时增加细胞内Ca2+浓度植物识别受体特异性的引发子，然后促进植物抗毒素的积累中诱导超敏反应以防止真菌侵染。已有一些有关植物的报道，认为在所述抗性反应早期，Ca2+流入细胞是很重要的(U.Conrath et al.，(1991)FEBS LETTERS 279141，M.N.Zook et al.，(1987)Plant Physiol 84520，F.Furosaki et al.(1987)Phytochemistry 261919；C.L.Preisig and R.A.Moreau(1994)Phytochemistry 36857)。还有报告说明Ca2+流入细胞可促使在本发明人用于得到ER的大豆中植物抗毒素的积累(M.R.Stab and J.Ebel(1987)Archi.Biochem.Biophys.257416)。因此，如果通过将ER基因导入无ER的烟草培养细胞而制备转化的培养烟草细胞以表达ER，而且如果通过加入葡聚糖引发子而改变细胞内的Ca2+浓度，则预料所述改变通过葡聚糖引发子而引发在除大豆外的植物(如烟草中的抗性反应，由此使它们对用葡聚糖为菌丝体壁组分的各种真菌表现出抗性。
检测通过加入引发子而在转化的培养烟草细胞之细胞内Ca2+浓度方面的改变。
在该实验中，使用经卡那霉素筛选而得到的转化的培养烟草细胞(I6)和含质粒的培养烟草细胞(C2-4)。
按下述所述用用于Ca2+检测之荧光螯合剂(Fura-2)的乙酰氧基甲基衍生物(Fura-2AM)检测培养细胞的细胞内Ca2+浓度经离心(600rpm，30秒)从约2ml转化的烟草细胞培养物(保持10分钟后，细胞体积相当于约250ml)中收集细胞，然后除去上清液。向细胞中加入2ml烟草培养基，缓慢搅动混合物，离心(600rpm，30秒)除去上清液。重复同样的操作以洗涤培养细胞。将洗过的培养细胞均匀悬于2ml培养基中。向1ml培养细胞悬于培养基中的悬浮液中加入1ml培养基和4μl 1mM Fura-2AM(终浓度2μM Dijin Chemical Co.)，然后将混合物在喑中培养30分钟，同时偶尔搅拌。随后，经离心(600rpm，30秒)用2ml培养基将细胞洗涤2次以除去未掺入细胞的游离Fura-2AM。将洗涤的培养细胞均匀悬于2ml培养基中，然后将上悬浮液(2ml)转移到荧光检测细胞中。通过用细胞内酯酶水解可以将掺入的Fura-2AM转变成Fura-2。在335nm激发光下，于505nm荧光波长测量通过Fura-2与细胞内Ca2+结合而产生的荧光，在测量同时搅拌培养细胞以使培养细胞不沉淀。在将50μl葡聚糖引发子(1mg/ml)或去离子水加到培养细胞中后，以特定的时间间隔，通过测量荧光强度而检测细胞内Ca2+浓度的改变。作为对照，用与上述相同的方法，在含质粒的培养烟草细胞中检测细胞内Ca2+浓度的改变。作为另一对照，用与上述相同的方法，不同的是用有下列配方的用于大豆细胞的培养基洗涤培养细胞，在培养的大豆细胞检测细胞内Ca2+浓度的改变。NaH2PO4·H2O 75mg/ml，KH2PO4170mg/ml，KNO32,200mg/ml，NH4NO3600mg/ml，(NH4)2SO467mg/ml，MgSO4·7H2O310mg/ml，CaCl2·2H2O 295mg/ml，FeSO4·7H2O 28mg/ml，EDTA·Na237.3mg/ml，KI 0.75mg/ml，MnSO4·4H2O 10.0mg/ml，H3BO33.0mg/ml，ZnSO4·7H2O 2mg/ml，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/ml，CuSO4·5H2O 0.025mg/ml，CoCl2·6H2O0.025mg/ml，肌醇100mg/ml，烟酸1.0mg/ml，吡哆素·HCl 1.0mg/ml，硫胺素·HCl 10.0mg/ml，葡萄糖5g/ml，蔗糖25g/ml，木糖250mg/ml，丙酮酸钠5.0mg/ml，柠檬酸10.0mg/ml，苹果酸10.0mg/ml，延胡素酸10.0mg/ml，N-Z-胺500.0mg/ml，2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/ml和玉米素核苷0.1mg/ml，用KOH调整到pH 5.7。
作为所述实验的结果，在加入引发子3分钟后，在培养的大豆细胞中观察到荧光强度瞬时增加约7％，而在加入去离子水后，未观察到所述改变(图4)。所得的结果表明在该实验中可观察到ER与葡聚糖引发子结合导致Ca2+瞬时流入细胞中的现象，从而支持Ca2+在由培养之大豆细胞中的引发子引起的抗性反应中起重要作用的报告。在转化的培养烟草细胞中，加入引发子3分钟后，观察到荧光强度瞬时增加约10％，而加入去离子水后，没有所述的变化。
在含质粒的培养烟草细胞中，加入引发子后，把转化的培养烟草细胞中未观察到荧光强度的变化(图5)。
这些结果表明除大豆外的与葡聚糖引发子没有反应性的植物(如烟草)通过导入用于ER表达的大豆衍生的葡聚糖引发子受体基因而获得了反应性。尽管还不完全了解各植物的信号传导途径，期望通过导入用于ER表达的本发明ER基因而使除烟草外的植物获得了与葡聚糖引发子的反应性(即细胞内Ca2+浓度的瞬时增加)，由此可以研制获得了对以葡聚糖为菌丝体壁组分的各种真菌的抗性的植物。实施例4在E.coli中表达大豆ER并确定引发子结合区1)在E.coli中表达引发子结合区为了在E.coli中表达大豆ER的部分片段，用Protein Fusion& Purification System(Naw England Biolabs Co.)制备大豆ER的部分片段与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白。用pER23-1为模板，完成PCR以得到各种长度的DNA片段。通过在DNA分子外的5′侧加一个BamHI位点，在3′侧加一个SalI位点而设计引物以在克隆到质粒pMAL-2中后生产MBP和融合蛋白，所述DNA分子编码图6所示的全长大豆ER和大豆ER的片段。用自动核酸合成仪(AppliedBiosystems Co.的Model 394)合成这些引物。在DNA链的扩增中使用下列引物。引物 U35 5′-ATGGATCCATGGTTAACATCCAAACC-3′；引物 U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′；引物 U37 5′-ATGGATCCCCAGCATGGGGTAGGAAG-3′；引物 U38 5′-TAGTCGACTACTTCTCCCAGTTATATTC-3′；引物 U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′；引物 U40 5′-TAGTCGACTATTCATCACTTCTGCTATG-3′；引物 U41 5′-ATGGATCCGCCCCACAAGGTCCCAAA-3′；和引物 U42 5′-ATGGATCCAATGACTCCAACACCAAG-3′将pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶于79μl蒸馏水中。将引物U5和U7的组合或引物U10和U12(各100pmol)组合和0.5μlTaq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.LTD)加到溶于10μl 10×PCR缓冲液(TAKARA SHUZO CO.LTD的Taq DNA聚合酶所附)中的0.8μl 2.5mM dNTP中以得到100μl终体积。用Gene Amp PCRSystem 9600(Perkin-Elmer Co.)进行30个循环的PCR反应，每循环包括1)于94℃变性30秒，2)于55℃变性30秒和3)于72℃延长1分钟。反应后，用限制酶BamHI和SalI消化15μl的反应溶液，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。
用0.5μg/ml溴化乙锭将凝胶染色15分钟。切下有所预期的特定扩增的带，该过程是在紫外光下观察的同时进行的。用GeneCleanII(Bio101 Co.)处理凝胶切片以收集合DNA的溶液。将收集的DNA片段克隆到质粒pMAL-C2的BamHI-SalI位点，然后将克隆导入E.coli DH5α。2)从E.coli中制备可溶的蛋白质组分在表达培养基(10g/l胰胨(Gibco Co.)，5g/l酵母提取物(Gibco Co.)，5g/l NaCl，2g/l葡萄糖和100μg/ml氯苄青霉素)中预培养其中导入了质粒的E.coli细胞。将预培养溶液(0.4ml)加到40ml表达培养基中，然后于37℃振荡培养直到OD600达到0.55。将异丙基硫代半乳糖苷加到培养溶液中，达到0.3mM的终浓度，然后继续振荡培养4小时以诱导表达。通过离心收集E.coli，然后用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl和1mMEDTA)洗涤E.coli细胞。声处理细胞共2分钟(15秒×8)。将ZW3-12加到经声处理的细胞中以达到0.25％的终浓度，然后将混合物于4℃培养30分钟。离心(10,000rpm，5分钟)收集上清液以得到E.coli可溶的蛋白质组分。用抗-麦芽糖结合蛋白抗体(New Englard Biolab Co.)，经免痰印迹技术确定融合蛋白的表达。3)引发子-结合实验按如下所述确定引发子-结合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引发子和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.LTD.)的复合物。使用氯胺T，用125I标记引发子-酪胺复合物。将所得的样品(蛋白质量＜80μg)悬于500μl检测缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)中，然后于0℃温育2小时。以100nM(70Ci/mmol)量的I标记的引发子-酪胺复合物加到悬浮液中，使混合物于4℃保温2小时。通过Whatman GF/B过滤反应溶液(与用0.3％聚乙烯亚胺水溶液处理至少1小时一样)，用5ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，10mM MgCl2)洗涤3次。用γ计数器计数滤膜上保留的放射活性(计数A)。为了消除非特异性结合的影响，除将17μM引发子加到同样的样品中外，重复与上述相同的过程，将混合物悬于检测缓冲液，将悬浮液于0℃温育2小时。所得的计数减去计数A以得到引发子特异性结合的计数(Δcpm)。所得的计数(Δcpm)除以计数总值，然后乘以实验中所用的引发子总量以计算引发子-结合蛋白的数量(以mol计)。
结果，在用编码ER(图6)之DNA分子转化的E.coli中观察到与引发子的特异性结合。因此，再次肯定所得的基因编码具有引发子结合活性的蛋白质，而且表明在SEQ ID NO1的239-442氨基酸序列，有一个引发子结合区。实施例5抑制在大豆子叶膜组分中葡聚糖引发子与引发子结合蛋白的结合以及用抗引发子结合区的抗体抑制大豆子叶中植物抗毒素的积累1)在E.coli中表达引发子结合区为了在E.coli中表达大量的引发子结合区，用Prtein Fusion& Purification System(New England Biolabs Co.)制备得自ER的引发子结合区与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白。进行PCR以生产编码引发子结合区的DNA分子。用自动核酸合成仪(AppliedBiosystems Co.的Model 394)合成下列引物引物 U36 5′-ATGGATCCGAATATAACTGGGAGAAG-3′；和引物 U39 5′-TAGTCGACTACTTCCTACCCCATGCTGG-3′将pER23-1的DNA分子(0.01μg)溶于79μl蒸馏水中。将引物U5与U7的组合或引物U10与U12(各100pmol)的组合以及0.5μl Taq DNA聚合酶(TAKARA SHUZO CO.LTD)加到在10μl 10×PCR缓冲液(TAKARA SHUZO CO.LTD的Taq DNA聚合酶所附)中的8μl 2.5mM dNTP中，终体积达100μl。用Gene Amp PCR System9600(Perkin-Elmer Co.)完成30个循环的PCR，每循环包括1)于94℃变性30秒，(2)于55℃变性30秒和3)于72℃延长1分钟。反应后，用限制酶BamHI和SalI消化15μl的反应溶液，然后在1％琼脂糖凝胶上电泳。
用0.5μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基6-苯基菲啶鎓溶液将凝胶染色15分钟。在紫外光下观察的同时切下有特异性扩增的带。用Gene CleanII(Bio101 Co.)处理凝胶切片以收集含DNA的溶液。将收集的DNA片段克隆到质粒pMAL-C2的BamHI-SalI位点，然后将克隆导入E.coli DH5α。2)纯化在E.coli中表达的融合蛋白并生产抗体在表达培养基(10g/l胰胨(Gibco Co.)，5g/l酵母提取物(Gibco Co.)，5g/l NaCl，2g/l葡萄糖和100μg/ml氯苄青霉素)过夜预培养用质粒转化的E.coli细胞。将预培养液(150ml)加到1.5L表达培养基中，于37℃在Sakaguchi瓶中振荡培养，直到OD600达到0.55。将异丙基硫代半乳糖苷加到培养液中，使终浓度为0.3mM，继续振荡培养4小时以诱导表达。离心收集E.coli，用洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，200mM NaCl和1mM EDTA)洗涤E.coli细胞。声处理细胞2分钟(15秒×8)。离心得到可溶的蛋白质组分。用直链淀粉树脂从该组分中纯化MBP融合的蛋白质。用因子Xa裂解MBP-和引发子结合区，然后用凝胶过滤柱层析纯化引发子结合区。用E.Harlow和D.Lane的方法(Antibody(1988)Cold Spring Harbor Co.，pp53-137)将纯化蛋白质注射到小鼠腹腔，注射2次以进行免疫接种。用ELISA法确定效价增加后，获取腹水，然后用50％饱和的硫酸铵沉淀并用Protein A Sepharose(Pharmacia Co.)处理以生产纯化的抗体。在用Protein ASepharose处理时，抗体与Protein A Sepharose和0.1M磷酸钠(pH 8.0)结合，然后用柠檬酸(pH 3.5)洗脱。用免疫印迹证明所得的抗体在大豆中仅认识ER蛋白质。3)制备大豆子叶膜组分按如下所述制备大豆子叶膜组分将大豆种子在土壤中培养9天，收集子叶(36g，湿重)。将子叶悬于47ml冰冷缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.0，30mM MgCl2，2mM DTT，2.5mM偏二亚硫酸钠和1mMPMSF)中。用与用于从大豆根中制备膜组分相同的方法制备子叶膜组分。将所得的子叶膜组分悬于1ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.4，0.1M蔗糖，5mMMgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)并贮于-80℃。4)测量葡聚糖引发子与大豆子叶膜组分引发子结合蛋白结合的抑制作用按如下所述测量引发子结合活性用Jong-Joo Cheong的方法(The Plant Cell(1991)3127)合成引发子和酪胺(TOKYO KASEI KOGYO CO.LTD.)的复合物。
用氯胺T，以125I标记引发子-酪胺复合物。将大豆子叶膜组分(100μl，820μg)悬于500μl检测缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4，0.1M蔗糖，5mM MgCl2，1mM PMSF和5mM EDTA)，然后于0℃温育2小时。将7.4ng(143nM；70Ci/mmol)I-标记的引发子-酪胺复合物加到悬浮液中，然后将混合物于4℃温育2小时。采用Whatman GF/B过滤反应溶液(与用0.3％聚乙烯亚胺水溶液至少处理1小时一样)，然后用5ml冰冷缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.0，1M NaCl，10mM MgCl2)洗涤3次。用γ计数器计数滤膜上保留的放射活性(计数A)。为了消除非特异性结合的影响，完成与上述相同的过程，不同的是将100倍mol(75μg，15μM)的冷引发子加到样品中，将混合物悬于检测缓冲液中，然后悬浮液于0℃保温2小时，所得的计数减去计数A，得到引发子特异性结合的计数(Δcpm)。通过加入3.6，7.1，10.8，14.4，28.8μg纯化抗体而不是冷引发子而得到的结合计数减去计数A。将所得的结果与冷引发子的比较，然后表达成百分数，取引发子特异性结合的计数(Δcpm)为100％(图7)。加入28.8μg抗体对引发子结合的抑制达到约51％。结果表明抗引发子结合的抑制达到约51％。结果表明抗引发子结合区的抗体抑制引发子与引发子结合蛋白的结合。5)用抗引发子结合区的抗体抑制植物抗毒素的积累用M.G.Hahn等人((1992)Moleculav Plant PathologyVolumeII A Practical Approach，IRL Press，pp.117-120)的方法用大豆子叶检测因葡聚糖引发子的作用而积累的植物抗毒素量。
以抗引发子-结合区的纯化抗体(0，1，2，3，4，10和20μg/25μl/子叶)或抗酵母衍生的dsRNAse，pac1的纯化抗体(4，10和20μg/25μl/子叶)作为对照，加到大豆子叶中，将混合物温育1小时。将葡聚糖引发子(200ng/25μl/子叶)加到大豆子叶中，将混合物温育20小时以确定因葡聚糖引发子的作用而积累的植物抗毒素是否受到抗体的抑制。将因加入引发子，随后加入抗体而诱导的植物抗毒素积累的量表示成百分数，以只加入引发子而积累的植物抗毒素为100％(图8)。若以20.0μg/大豆子叶的量加入抗引发子结合区的抗体时，积累的植物抗毒素量降低了约53％。在对照中，植物抗毒素的积累量几乎没什么变化，即使加入20.0μg/大豆子叶抗pac1抗体时，也是如此。这些结果表明所得的基因并不只编码引发子结合蛋白，而是编码大豆中诱导抗体反应的ER。工业实用性根据本发明，提供了葡聚糖引发子受体，编码葡聚糖引发子受体的DNA分子及其片段，含有DNA分子或其片段的载体，用DNA分子或其片段转化的植物细胞。
本发明的ER对于说明真菌抗性以及开发能诱导真菌抗体的引发子衍生物是有用的，而且可用其作高抗源生产抗ERs的抗体。
含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的本发明DNA分子及其片段可作为用于建立开发真菌抗体植物技术的材料。换句话说，可导入本发明的DNA分子及其片段并在各种植物中表达以提高其真菌抗性。
抗本发明葡聚糖引发子受体的抗体，含编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的本发明DNA分子、其突变体和反义DNA可用于研究ER的引发子结合位点和信号传导。
此外，ER的氨基酸序列及编码其的核苷酸序列资料可用于研究ER的引发子结合位点和涉及ER的信号传导。
序列表SEQ ID NO1的资料长度667个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽序列描述SEQ ID NO1Val Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val1 5 10 15Leu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro20 25 30 35Thr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr40 45 50Ile His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro55 60 65 70Ser Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr75 80 85 90Ile Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser95 100 105Ser Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe110 115 120 125Phe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro130 135 140Leu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn145 150 155 160Thr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr165 170 175 180Ser Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser185 190 195Gly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val200 205 210 215Leu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu220 225 230Pro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu235 240 245 250Leu Ala His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys255 260 265 270Ile Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val275 280 285Gly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile290 295 300 305Lys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp310 315 320Val Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly325 330 335 340Lys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr345 350 355 360Pro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp365 370 375Leu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly380 385 390 395Ile Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile400 405 410Tyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu415 420 425 430Thr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile435 440 445 450Val Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu455 460 465Arg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe470 475 480 485Thr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser490 495 500Ala Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser505 510 515 520Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu525 530 535 540Gly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val545 550 555Leu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys560 565 570 575Glu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile580 585 590Phe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu595 600 605 610Asp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu615 620 625 630Gly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe635 640 645Asp Gly Gly Asn Ser Leu Thr Asn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp650 655 660 665Glu667SEQ ID NO2的资料长度2004个碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型cDNA生物源生物大豆(Glycine max L.)品系Green Homer序列描述SEQ ID NO29 18 27 36 45 54GTT AAC ATC CAA ACC AAT ACA TCT TAC ATC TTC CCT CAA ACA CAA TCC ACT GTTVal Asn Ile Gln Thr Asn Thr Ser Tyr Ile Phe Pro Gln Thr Gln Ser Thr Val63 72 81 90 99 108CTT CCT GAT CCC TCC AAA TTC TTC TCC TCA AAC CTT CTC TCA AGT CCA CTC CCCLeu Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Ser Asn Leu Leu Ser Ser Pro Leu Pro117 126 135 144 153 162ACA AAC TCT TTC TTC CAA AAC TTT GTC CTA AAA AAT GGT GAC CAA CAA GAA TACThr Asn Ser Phe Phe Gln Asn Phe Val Leu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Glu Tyr
171 180 189 198 207 216ATT CAT CCT TAC CTC ATC AAA TCC TCC AAC TCT TCC CTC TCT CTC TCA TAC CCTIle His Pro Tyr Leu Ile Lys Ser Ser Asn Ser Ser Leu Ser Leu Ser Tyr Pro225 234 243 252 261 270TCT CGC CAA GCC AGT TCA GCT GTC ATA TTC CAA GTC TTC AAT CCT GAT CTT ACCSer Arg Gln Ala Ser Ser Ala Val Ile Phe Gln Val Phe Asn Pro Asp Leu Thr279 288 297 306 315 324ATT TCA GCC CCA CAA GGT CCC AAA CAA GGT CCC CCT GGT AAA CAC CTT ATC TCCIle Ser Ala Pro Gln Gly Pro Lys Gln Gly Pro Pro Gly Lys His Leu Ile Ser333 342 351 360 369 378TCC TAC AGT GAT CTC AGT GTC ACC TTG GAT TTC CCT TCT TCC AAT CTG AGC TTCSer Tyr Ser Asp Leu Ser Val Thr Leu Asp Phe Pro Ser Ser Asn Leu Ser Phe387 396 405 414 423 432TTC CTT GTT AGG GGA AGC CCC TAT TTG ACT GTG TCT GTG ACT CAA CCA ACT CCTPhe Leu Val Arg Gly Ser Pro Tyr Leu Thr Val Ser Val Thr Gln Pro Thr Pro441 450 459 468 477 486CTT TCA ATT ACC ACC ATC CAT TCC ATT CTC TCA TTC TCT TCA AAT GAC TCC AACLeu Ser Ile Thr Thr Ile His Ser Ile Leu Ser Phe Ser Ser Asn Asp Ser Asn495 504 513 522 531 540ACC AAG TAC ACC TTT CAG TTC AAC AAT GGT CAA ACA TGG CTT CTT TAT GCT ACCThr Lys Tyr Thr Phe Gln Phe Asn Asn Gly Gln Thr Trp Leu Leu Tyr Ala Thr
549 558 567 576 585 594TCC CCC ATC AAG TTG AAC CAC ACC CTT TCT GAG ATA ACT TCT AAT GCA TTT TCTSer Pro Ile Lys Leu Asn His Thr Leu Ser Glu Ile Thr Ser Asn Ala Phe Ser603 612 621 630 639 648GGC ATA ATC CGG ATA GCT TTG TTG CCG GAT TCG GAT TCG AAA CAC GAG GCT GTTGly Ile Ile Arg Ile Ala Leu Leu Pro Asp Ser Asp Ser Lys His Glu Ala Val657 666 675 684 693 702CTT GAC AAG TAT AGT TCT TGT TAC CCC GTG TCA GGT AAA GCT GTG TTC AGA GAALeu Asp Lys Tyr Ser Ser Cys Tyr Pro Val Ser Gly Lys Ala Val Phe Arg Glu711 720 729 738 747 756CCT TTC TGT GTG GAA TAT AAC TGG GAG AAG AAA GAT TCA GGG GAT TTG CTA CTCPro Phe Cys Val Glu Tyr Asn Trp Glu Lys Lys Asp Ser Gly Asp Leu Leu Leu765 774 783 792 801 810TTG GCT CAC CCT CTC CAT GTT CAG CTT CTT CGT AAT GGA GAC AAT GAT GTC AAALeu Ala His Pro Leu His Val Gln Leu Leu Arg Asn Gly Asp Asn Asp Val Lys819 828 837 846 855 864ATT CTT GAA GAT TTA AAG TAT AAA AGC ATT GAT GGG GAT CTT GTT GGT GTT GTCIle Leu Glu Asp Leu Lys Tyr Lys Ser Ile Asp Gly Asp Leu Val Gly Val Val873 882 891 900 909 918GGG GAT TCA TGG GTT TTG AAA ACA GAT CCT TTG TTT GTA ACA TGG CAT TCA ATCGly Asp Ser Trp Val Leu Lys Thr Asp Pro Leu Phe Val Thr Trp His Ser Ile
927 936 945 954 963 972AAG GGA ATC AAA GAA GAA TCC CAT GAT GAG ATT GTC TCA GCC CTT TCT AAA GATLys Gly Ile Lys Glu Glu Ser His Asp Glu Ile Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp981 990 999100810171026GTT GAG AGC CTA GAT TCA TCA TCA ATA ACT ACA ACA GAG TCA TAT TTT TAT GGGVal Glu Ser Leu Asp Ser Ser Ser Ile Thr Thr Thr Glu Ser Tyr Phe Tyr Gly103510441053106210711080AAG TTG ATT GCA AGG GCT GCA AGG TTG GTA TTG ATT GCT GAG GAG TTG AAC TACLys Leu Ile Ala Arg Ala Ala Arg Leu Val Leu Ile Ala Glu Glu Leu Asn Tyr108910981107111611251134CCT GAT GTG ATT CCA AAG GTT AGG AAT TTT TTG AAA GAA ACC ATT GAG CCA TGGPro Asp Val Ile Pro Lys Val Arg Asn Phe Leu Lys Glu Thr Ile Glu Pro Trp114311521161117011791188TTG GAG GGA ACT TTT AGT GGG AAT GGA TTC CTA CAT GAT GAA AAA TGG GGT GGCLeu Glu Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gly Phe Leu His Asp Glu Lys Trp Gly Gly119712061215122412331242ATT ATT ACC CAA AAG GGG TCC ACT GAT GCT GGT GGT GAT TTT GGA TTT GGA ATTIle Ile Thr Gln Lys Gly Ser Thr Asp Ala Gly Gly Asp Phe Gly Phe Gly Ile125112601269127812871296TAC AAT GAT CAC CAC TAT CAT TTG GGG TAC TTC ATT TAT GGA ATT GCG GTG CTCTyr Asn Asp His His Tyr His Leu Gly Tyr Phe Ile Tyr Gly Ile Ala Val Leu
130513141323133213411350ACT AAG CTT GAT CCA GCA TGG GGT AGG AAG TAC AAG CCT CAA GCC TAT TCA ATAThr Lys Leu Asp Pro Ala Trp Gly Arg Lys Tyr Lys Pro Gln Ala Tyr Ser Ile135913681377138613951404GTG CAA GAC TTC TTG AAC TTG GAC ACA AAA TTA AAC TCC AAT TAC ACA CGT TTGVal Gln Asp Phe Leu Asn Leu Asp Thr Lys Leu Asn Ser Asn Tyr Thr Arg Leu141314221431144014491458AGG TGT TTT GAC CCT TAT GTG CTT CAC TCT TGG GCT GGA GGG TTA ACT GAG TTCArg Cys Phe Asp Pro Tyr Val Leu His Ser Trp Ala Gly Gly Leu Thr Glu Phe146714761485149415031512ACA GAT GGA AGG AAT CAA GAG AGC ACA AGT GAG GCT GTG AGT GCA TAT TAT TCTThr Asp Gly Arg Asn Gln Glu Ser Thr Ser Glu Ala Val Ser Ala Tyr Tyr Ser152115301539154815571566GCT GCT TTG ATG GGA TTA GCA TAT GGT GAT GCA CCT CTT GTT GCA CTT GGA TCAAla Ala Leu Met Gly Leu Ala Tyr Gly Asp Ala Pro Leu Val Ala Leu Gly Ser157515841593160216111620ACA CTC ACA GCA TTG GAA ATT GAA GGG ACT AAA ATG TGG TGG CAT GTG AAA GAGThr Leu Thr Ala Leu Glu Ile Glu Gly Thr Lys Met Trp Trp His Val Lys Glu162916381647165616651674GGA GGT ACT TTG TAT GAG AAA GAG TTT ACA CAA GAG AAT AGG GTG ATG GGT GTTGly Gly Thr Leu Tyr Glu Lys Glu Phe Thr Gln Glu Asn Arg Val Met Gly Val
168316921701171017191728CTA TGG TCT AAC AAG AGG GAC ACT GGA CTT TGG TTT GCT CCT GCT GAG TGG AAALeu Trp Ser Asn Lys Arg Asp Thr Gly Leu Trp Phe Ala Pro Ala Glu Trp Lys173717461755176417731782GAG TGT AGG CTT GGC ATT CAG CTC TTA CCA TTG GCT CCT ATT TCT GAA GCC ATTGlu Cys Arg Leu Gly Ile Gln Leu Leu Pro Leu Ala Pro Ile Ser Glu Ala Ile179118001809181818271836TTC TCC AAT GTT GAC TTT GTA AAG GAG CTT GTG GAG TGG ACT TTG CCT GCT TTGPhe Ser Asn Val Asp Phe Val Lys Glu Leu Val Glu Trp Thr Leu Pro Ala Leu184518541863187218811890GAT AGG GAG GGT GGT GTT GGT GAA GGA TGG AAG GGG TTT GTG TAT GCC CTT GAAAsp Arg Glu Gly Gly Val Gly Glu Gly Trp Lys Gly Phe Val Tyr Ala Leu Glu189919081917192619351944GGG GTT TAT GAC AAT GAA AGT GCA CTG CAG AAG ATA AGA AAC CTG AAA GGT TTTGly Val Tyr Asp Asn Glu Ser Ala Leu Gln Lys Ile Arg Asn Leu Lys Gly Phe195319621971198019891998GAT GGT GGA AAC TCT TTG ACC AAT CTC TTG TGG TGG ATT CAT AGC AGA AGT GATAsp Gly Gly Asn Ser Leu Thr Asn Leu Leu Trp Trp Ile His Ser Arg Ser Asp2004GAA TAGGluSEQ ID NO3的资料长度54个碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其他核酸，合成的DNA序列描述SEQ ID NO3GGAATTCGAG CTCGGTACCC GGGGGATCCT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA TGCASEQ ID NO4的资料长度58个碱基对类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型其他核酸，合成的DNA序列描述SEQ ID NO4CCTTAAGCTC GAGCCATGGG CCCCCTAGGA GATCTCAGCT GGACGTCCGT ACGTTCGA
权利要求
1.具有基本示于SEQ ID NO1之氨基酸序列的葡聚糖引发子受体。
2.含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子或其片段，所述受体具有基本如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
3.权利要求2的DNA分子，其中编码葡聚糖引发子受体的核苷酸序列或其片段示于SEQ ID NO2。
4.掺入质粒pER23-1的含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子或其片段。
5.含有权利要求2-4任一编码葡聚糖引发子受体的DNA分子或其片段的载体。
6.用权利要求2-4任一编码葡聚糖引发子受体的DNA分子或其片段转化的植物细胞。
全文摘要
具有基本如SEQ ID NO1所示之氨基酸序列的葡聚糖引发子受体；含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸的DNA分子或其片段，所述受体具有基本示于SEQ ID NO1的氨基酸序列；掺入质粒pER23-1的含有编码葡聚糖引发子受体之核苷酸序列的DNA分子或其片段，含有编码葡聚糖引发子受体的DNA分子或其片段的载体；用编码葡聚糖引发子受体的DNA分子或其片段转化的植物细胞。
文档编号C07K14/435GK1131970SQ95190741
公开日1996年9月25日 申请日期1995年6月16日 优先权日1994年6月17日
发明者柿谷诚, 梅基直行, 石田功, 岩松明彦, 吉川正明 申请人:麒麟麦酒株式会社