用于脂化亲水分子的方法和组合物的制作方法

专利名称：：用于脂化亲水分子的方法和组合物的制作方法本申请是1995年1月25日提交的08/349,717号申请的部分继续申请。本发明总体上涉及生物学和医学领域。更具体地讲，本发明涉及用于提高亲水分子特别是肽和蛋白质在哺乳动物中吸收和保留的方法和组合物。生物技术的发展使得可能大量生产有治疗活性的纯蛋白和肽。现今，大部分这些药剂只有在经侵入途经如注射给药时才能取得治疗效果。由于大部分蛋白的半衰期非常短，只有频繁注射才能保持它们的有效浓度。虽然注射给药是体内输送蛋白的最有效方式，但多次注射使病人难以忍受。另外，注射给药是一项技术工作，需要培训；而病人也并不总能享受到这种技巧和培训。当蛋白药物具有挽救生命的作用时，病人可以接受注射给药。但当蛋白药物只是几种可能疗法中的一种时，病人就可能不接受蛋白和肽的注射。因此，需要开发输送蛋白和肽的其他途径。输送蛋白和肽的其他途径可以包括颊内、鼻内、口服、肺内、直肠内和眼内途径。这些途径的效率无一例外小于胃肠外给药途径。但这些蛋白和肽的输送途径仍远比胃肠外途径更有吸引力，因为它们对病人提供了方便和控制权。口服途径具有特别吸引力，因为它最方便最随从病人。隔开体内和体外的粘膜屏障(如胃肠、眼、肺、直肠和鼻的粘膜)包括一层紧密相连的细胞单层，它严格调节分子的转运。屏障中的单个分子由紧密的接界相连，调节进入细胞间空间。因此，粘膜是第一道生理屏障，跨膜转运要么采取跨细胞途径，要么采取细胞旁途径[Lee，V.H.L.(1988)CRC.治疗药物输送系统评述5，69-97]。通过充满水的紧密接界进行细胞旁转运限于小分子(MW＜1KDa)，基本上是一种由跨粘膜的浓度梯度驱动的扩散过程[Lee(1988)，同上；Artursson，P.，和Magnusson，C.(1990)，药物科学杂志，79，595-600]。紧密接界只占粘膜总表面积的0.5％以下[Gonzalez-Mariscal，L.M.等(1985)，膜生物学杂志，86，113-125；Vetvicka，V.，和Lubor，F.(1988)CRC治疗药物输送系统评述5，141-170]；因而它们在蛋白药物的跨粘膜转运中只起很小的作用。只要药物的理化性质适于跨越疏水细胞屏障而转运，小分子药物能进行有效的跨细胞转运。但蛋白和肽的跨细胞转运只限于胞吞转运作用[Shen，W.C.等(1992)，药物输送进展综述(Adv.DrugDe-liveryRev.)8，93-113]。胞吞转运作用是一个复杂的过程蛋白质和肽从细胞一侧被摄入泡囊，然后穿过细胞到达细胞另一侧，并从内吞小泡中释放出来[Mostov，K.E.和Semister，N.E.(1985)细胞43,389-390]。粘膜屏障的细胞膜是疏水的脂双层，对蛋白和肽类亲水带电大分子没有亲合力。另外，粘膜细胞可以分泌粘蛋白，后者可作为许多大分子转运的屏障(Edwards，P.(1978)英国医学杂志34，55-56]。因此，除非存在专门的蛋白和肽的转运机制，否则它们跨粘膜屏障的持续转运几乎是可以忽略的。除对蛋白和肽的转运构成一种紧密的物理屏障外，粘膜屏障中还具有能在通过粘膜前、后或过程中降解蛋白和肽的酶。这一屏障被称为酶屏障，它由在蛋白和肽末端或其结构当中酶切的外肽酶和内肽酶构成。已对数种粘膜的酶活性进行了研究，结果表明在白化兔的颊、鼻、直肠和阴道粘膜匀浆中存在显著的蛋白酶活性，这些活性与髂骨中存在的酶活性相当[Lee等(1988)，同上]。因而即使不考虑粘膜，这种酶屏障也将强烈地降解蛋白和肽分子。肽的N和C末端带电，加之带电侧链的存在也赋予这些大分子高度的亲水特征。另外，带电侧链的存在意味着肽和蛋白具有很强的氢结合能力，已证明这种氢结合能力在抑制甚至是小肽的跨细胞膜转运中起主要作用[Conradi，R.A.等(1991)，药物研究，8，1453-1460]。因而，蛋白和肽的大小和亲水性质一起严重限制了其跨粘膜屏障的转运。已用于改变粘膜屏障物理性质的一条途径是使用穿透增效剂，它是通过使用能液化细胞膜[Kaji，H等(1985)生命科学，37，523-530]、打开紧密接界[Inagaki等(1985)鼻科学23，213-221]和在细胞膜上成孔[Gordon，S等(1985)Proc.Natl.Acad.SciUSA82,7419-7423；Lee，V.H.L等(1991)治疗药物载体系统的评述，CRC出版社，8，91-192]的小分子量试剂在细胞屏障中打开缺口。这些试剂的使用造成屏障完整性的非特异性损失，并能导致在细胞内有毒性的多种大分子的吸收。蛋白酶抑制剂与蛋白和肽同时给药已证明对提高这些大分子的体内吸收具有有限的作用[Kidron，M等(1982)生命科学31，2837-2841；Takaroi.k.等(1986)生物化学和生物物理学研究通讯，137，682-687]。这一途径的安全性和长期效应还有待彻底地研究。前药途径是改造肽使其不被酶降解和识别。这是通过在肽结构中代之以D-构型氨基酸，通过酰胺化和酰化封闭肽的易损基因、反转肽的手性以及在肽结构中引入构象强制来实现的。前药的合成仅适用于活性域易于识别的小肽。减小体积是提高蛋白转运潜力的另一可行途径，但在此之前必须先确定蛋白的活性位置。一般而言，这一途径难于应用于大多数蛋白上。利用载体配体的性质可以改变细胞摄入和转运蛋白和肽的特征。这一途径的关键是将不能穿越细胞的蛋白或肽和一种能被高度转运至细胞中的载体共价结合。载体配体被细胞摄粒并胞转的机制对决定能增强蛋白和肽转运之载体的适用性上是很重要的。大分子载体是亲水性的，不会分配至膜中，因而大的多聚载体向细胞中的转运是由载体对细胞膜的亲和力介导的。一般讲，大分子偶联物的摄入始于与细胞膜的结合。载体与细胞膜的结合可以是特异性的(如抗体与细胞表面抗原的结合)、非特异性的(阳离子配体或凝集素与细胞表面糖的结合)或由受体介导的(转铁蛋白或胰岛素与其受体的结合)。一旦载体被结合在细胞表面，就被吞噬到泡囊中，然后这些泡囊经逐步加工，并可以有几种途径。一种途径是泡囊返回其被吞入的膜；另一途径是被溶酶体溶解，这对偶联物有破坏作用；还有一条途径是导致偶联物胞吞转运的途径，其中泡囊与被摄入膜相反一侧的膜融合。细胞摄粒作用和胞吞转运作用间的适当平衡决定着蛋白偶联物向其靶标的输送。例如，细胞摄粒作用可决定偶联物被靶细胞摄入的程度，但胞吞转运作用决定偶联物是否到达其靶标[Shen等(1992)，同上]。为了从胃肠道被成功地吸收，偶联物必需与胃肠粘膜的顶端膜结合，内在化入粘膜细胞中，跨细胞输送，最后从底侧膜释放出去。现有文献中有许多报道证明非特异性载体如聚赖氨酸[Shen，W.C.和Ryser，H.J.P.(1981)Proc.Natl，Acad.Sci.USA787589-7593]和凝集素[Broadwell，R.D等(1988)Proc.Natl.A-cad.Sci.USA85，632-646]，和特异性载体如转铁蛋白[Wan，J等(1992)生物学化学杂志267，13446-13450]，脱唾液酸糖蛋白[Seth，R等(1993)传染病杂志168，994-999]和抗体[Vitetta，E.S(1990)临床免疫学杂志10，15S-18S]可以提高蛋白的细胞摄粒作用。关于蛋白胞转载体的报道较少，而很少有关于蛋白偶联物跨细胞屏障转运的研究。已证明小麦胚凝集素[Broadwell等(1988)，同上]和抗转铁蛋白/氨甲喋呤偶联物[Friden，P.M.和Walus，L.R.(1993)Adv.Exp.Med.Biol，331，129-136]在体内可被胞转通过血脑屏障。还证明辣根过氧化物酶(HRP)的聚赖氨酸偶联物和HRP的转铁蛋白偶联物在体外可被胞转通过细胞单层[Wan，J和Shen，W.C.(1991)药学研究8，S-5；Taub，M.E.和Shen，W.C.(1992)细胞生理杂志，150，283-290；Wan，J等(1992)生物学化学杂志，267，13446-13450，同上]。作为磷脂的成分，脂肪酸构成了细胞膜的主体。它们可以在市场上购得且较廉价。由于其脂质性，脂肪酸易于分配到细胞膜中并与其相作用而无毒性。因此，脂肪酸是潜在的最有用的蛋白和肽的输送载体配体。使用脂肪酸输送蛋白和肽的策略包括蛋白和肽的共价修饰和脂肪酸乳液的使用。一些研究已报道了脂肪酸乳液在体内输送蛋白和肽中的成功应用(Yoshikawa，H等(1985)药物研究2，249-251；Fix，J.A.等美国生理学杂志251，G332-G340]。现在还不清楚脂肪酸乳液促进蛋白和肽吸收的机制。脂肪酸乳液可能打开紧密接界、溶化膜、将蛋白和肽隔离胃肠环境，以及通过其吸收携带蛋白和肽跨过胃肠粘膜[Smith，P.等(1992)药物输送进展综述8，253-290]。所提出的后一机制与关于脂肪吸收机制的现有知识不相符。跨越胃肠上皮输送蛋白和肽的一种更符合逻辑的策略是利用脂肪酸作为非特异性膜吸附剂。有数例研究报道表明与蛋白相连的非特异性膜结合剂可以促进蛋白偶联物体外胞转至细胞[Wan，J.等(1990)细胞生理学杂志145，9-15；Taub和Shen(1992)，同上]。还证明与脂肪酸偶联可提高大分子进入细胞膜和跨越细胞膜的吸收[Lestinger，R等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6553-6556；Kabanov，A等(1989)蛋白工程3，39-42]。但脂肪酸与肽和蛋白的偶联有困难，包括(1)脂肪酸在偶联反应的水溶液中不溶解；(2)脂肪酸酰化后肽和蛋白的生物活性损失；及(3)脂肪酸-偶联肽在水溶液中不溶[见，如Hashimoto，M等，，药物研究，6，171-176(1989)；Martins，M.B.F.等，生物化学72，671-675(1990)；Mu-ranishi，S等，药物研究，8，649-652(1991)；Robert，S.等，生物化学生物物理学研究通讯196，447-454(1993)]。本发明的目的是提供用于偶联脂肪酸和亲水分子并提高肽和蛋白生物利用度的方法和组合物。按照本发明，含巯基化合物(例如含有或经改造后含有巯基的肽蛋白或寡核苷酸)的脂肪酸衍生物，即含二巯键的脂肪酸-偶联产物用于向哺乳动物细胞输送这些含巯基化合物。与未偶联化合物的吸收率相比，这种修饰显著提高了哺乳动物细胞对这些化合物的吸收，并延长了这些化合物在血液和组织中的保留时间。而且，偶联物中的二巯键在细胞中很不稳定，在细胞中易于从脂肪酸部分释放完整的化合物。还提供了制备该脂肪酸衍合物的试剂和方法。参照附图可以更好地理解本发明图1说明BBI、BBIssPal和BBIssOleic在Caco-2细胞中的吸收；图2说明静脉给药后BBI和BBIssPal在CF-1小鼠血、肾、肺和肝中的生物分布；图3说明静脉给药后BBI和BBIssOleic在CF-1小鼠血、肾、肺和肝中的生物分布；图4说明腹膜内给药后BBI和BBIssPal在CF-1小鼠中的生物分布；图5说明BBI、BBIssPal(2)和BBIssPal(4)跨越和进入Caco-2细胞的胞吞转运作用和累积；及图6说明来自含胞转BBI、BBIssPal(2)和BBIssPal(4)的Caco-2细胞的基质，经G-50凝胶过滤分析的结果。根据本发明，含巯基化合物(如以下所定义的生物多聚物)通过可逆的可生物降解的二巯键与脂肪酸衍生物连结。这种偶联物预期与细胞膜的顶侧结合，经膜转运和反转到达胃肠上皮的底侧膜，并经二硫键的还原释放到间隙液中。一方面，本发明提供通式VI的偶联物其中P是含巯基化合物衍生的残基；R1是氢、低级烷基或芳基；R2是含脂残基(如下文所定义)；及R3是-OH、含脂残基或含一或两个氨基酸并且末端为-CO2H或-COR2的氨基酸链。这些偶联物对提高含巯基化合物PSH的吸收及延长其血液和组织保留时间特别有用。另一方面，本发明提供一种提高含巯基化合物PSH在哺乳动物中的吸收或延长其血液和组织保留时间的方法，其中从含巯基化合物形成通式VI的偶联物，然后将此偶联物给予哺乳动物(例如，以水溶液或口服剂量单位形式)。又一方面，本发明提供通式V化合物A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(＝O)R3V其中A是芳香活化残基(如下文所定义)，R1、R2和R3如前文所定义。通式V化合物在从式PSH的含巯基化合物到通式VI偶联物的制备中特别有用。又一方面，本发明提供从式PSH的含巯基化合物制备通式VI偶联物的方法，该方法包括通式PSH化合物与通式V化合物反应。典型反应是用过量通式V化合物(例如过量2-10倍)在适当的水性缓冲液(如磷酸盐、碳酸氢盐和硼酸盐缓冲液)中，在约4-37℃下进行约1-24小时。该反应优选在pH8的碳酸氢盐缓冲液中进行。又一方面，本发明提供通式III化合物A-S-S-CH2-CR1(NH2)C(＝O)R3′III其中R3′为-OH或含一或两个氨基酸且末端为-CO2H的氨基酸链，A和R1如前文所定义。通式III化合物在通式V化合物的制备中特别有用。通式III化合物可通过通式II化合物H-S-CH2-CR1(NH2)C(＝O)R3II与通式A-S-S-A或A-SS-A′化合物反应制得，其中A′与A不同，为一种芳香活化残基。这些反应物要么在市场上可购得[如2，2′-二硫二吡啶和5，5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)]要么可通过本领域技术人员熟知的常规合成方法制备。又一方面，本发明提供其中R2为脂基的式V化合物的制备方法，其中通式III化合物与通式X-O2C-B或X-OC-B的活化脂基反应，其中X为脂活化基团(如下文所定义)，B为脂基(如下文所定义)。按本身已知的方法易于制备通式X-O2C-B或X-OC-B化合物。制备通式III化合物的步骤例如为大致等摩尔量的通式II化合物和式A-S-S-A或A-S-S-A′化合物在极性有机溶剂(如乙醇)中适当地混合。通过在非极性有机溶剂(如苯)中结晶可以适当地分离通式III产物。当然，其他适当的步骤对本领域技术人员也是显而易见的。为制备X-O2C-B或X-OC-B，脂肪酸例如可与下列物质反应(a)N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺试剂以形成N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯；(b)三氟乙酸酐以形成脂肪酸酐；或(c)亚硫酰氯以形成脂肪酸酰氯。其他替代方法也可能适用于引入这些或其他的脂活化基团。对于本发明的目的，“含脂残基”指脂基团本身或含脂基团的碳氢基团(特别是一个或多个氨基酸)。“脂基”指含约4-26个碳原子(优选约5-19个碳原子)的疏水取代基。适当的脂基包括但不限于棕榈基(C15H31)；油基(C15H29)；硬脂基(C17H35)；胆酸酯；和脱氧胆酸酯。“芳香活化残基”指用于使通式V化合物的二硫键更易于与通式PSH的含巯基化合物进行取代反应的残基(因而作为良好的离去基团)。本发明优选的芳香活化基团是2-吡啶基；其他适当的芳香活化基团包括4-硝基苯基。“脂活化基团”对本发明而言指使得与其相连的羧脂基团与通式III化合物有反应活性的残基。本发明优选的脂活化基团是N-羟基琥珀酰亚胺酯；其他适当的脂活化基团包括酰氯和酸酐。虽然本发明设计的通式VI化合物的制备和偶联物的应用包括广泛的含巯基化合物，但应用本发明的方法和组合物制备含生物多聚物的偶联物特别有利。有关生物多聚物包括肽、蛋白质和寡核苷酸(如下文所定义)。正如本领域技术人员易于看出的那样，含巯基的生物多聚物或硫醇化生物多聚物可以含有多个结构上相应于通式VI偶联物的部分(即，具有通式VI化合物减去P残基这样结构的基团)。对于本发明，“肽”指含2-50个氨基酸的氨基酸链，“蛋白”指含多于50个氨基酸的氨基酸链。这些蛋白和肽可以从天然来源分离到或用本领域熟知的方法制得，如用重组DNA技术或固相合成技术。本发明中使用的肽和蛋白可以只含天然的L-氨基酸，L-氨基酸和其他氨基酸(包括R-氨基酸和修饰氨基酸)结合，或只含有L-氨基酸以外的氨基酸。为了形成通式VI的偶联物，该肽或蛋白必须带有至少一个反应活性巯基。许多肽或蛋白含有半胱氨酸残基(一种含有巯基的氨基酸)。不含巯基的肽或蛋白可以按本领域技术人员本身已知的方法改造；特别是熟知的硫醇化试剂[如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸(SPDP)和2-亚氨基硫杂环戊烷(2-imimothiolane，Traut’s试剂)]可以按常规用于该目的。“寡核苷酸”指含两个或多个天然或修饰核苷酸的链，例如天然或重组脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)序列。为了形成本发明的偶联物，该寡核苷酸必须经硫醇化反应修饰，以便含有与含脂残基相连的巯基。这种修饰可按本身已知的方式常规地进行。例如，可用碳化二亚胺偶联寡核苷酸和半胱胺，然后用二硫苏糖醇还原产生游离巯基。一类优选的通式VI化合物中，R1为氢，R2为脂残基，R3为-OH。此类偶联物适于从半胱氨酸制得。另一类本发明优选的偶联物中，R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一个含脂残基。该类偶联物适于从谷胱甘肽制备。通式VI示例化合物(其中P为蛋白)的合成示于路线I中。当然，本领域技术人员将认识到，易于找出许多替代合成路线。本发明的脂肪酸偶联物可溶于蛋白和肽可溶的大部分缓冲液中。尤其是，在中性pH下游离羧酸基团带电，从而提高偶联物的溶解度。这极大地方便了偶联物与适当药物可接受载体或佐剂的配制，以便口服或经其他途径将蛋白或肽给予病人。脂肪酸部分与肽或蛋白间的二硫键易于还原，本发明的这一点是特别有利的。这样，活性肽或蛋白就以完整的形式被释放在靶组织或细胞内。而且，该偶联物的脂肪酸部分只含氨基酸和脂分子，对哺乳动物特别是人无毒性。参考以下实施例可能更好地理解本发明，这些实施例旨在说明，而不应视为对权利要求中所定义的本发明范围的任何限制。实施例1N-棕榈基-2-吡啶基二硫基半胱氨酸(Pal-PDC)的合成将L-半胱氨酸(I)(3.0g)的冰冷乙醇(50ml)溶液滴加到搅拌下的2，2-二硫二吡啶(II)(7.5g)的乙醇(30ml)溶液中，反应在25℃下进行18小时。离心该溶液以除去沉淀，用旋转蒸发仪浓缩上清液至40ml。然后将此反应混合物滴加到400ml冰冷的苯中。PDC(III)在苯中结晶，过滤分离，重新溶解在40ml乙醇中，然后在400ml如上所述的冰冷苯中重结晶。过滤分离重结晶产物，真空干燥过夜，最后在干燥器中-20℃下保存。将PDC(100mg)(III)溶解在5mlDMF中，与100ml三乙胺混合，形成的悬液与DMF(5ml)中的棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(IV)(250mg)于25℃反应24小时，在此过程中悬液变清。用40mlpH3.0的冰冷水稀释该溶液，10000rpm离心30分钟分离沉淀，其中含有Pal-PDC(V)和棕榈酸。将沉淀悬浮在pH7.0的水中，Pal-PDC(V)溶解，而棕榈酸不溶，从而将Pal-PDC(V)与棕榈酸分离。再用两步上述酸沉淀步骤进一步纯化Pal-PDC(V)。实施例2偶联物的合成除非另有说明，用于偶联步骤的所有最终试剂(Pal-PDC和PDC)都用含荧光指示剂的硅酸薄层层析(TLC)板进行了分析。这些板在分析前没有热活化。合成试剂的常规分析是将5μl含试剂的乙醇溶液(5mg/ml)点样于板上，然后在用流动相平衡的溶剂室中展开，一旦溶剂前沿走过了足够的距离，将板取出、干燥并在紫外灯下观察。立即在板上标出斑点位置，画出板和斑点的图，计算并记录每一可见斑点的Rf值。可调节用于分析的流动相的组成，以达到试剂斑点的最佳分离。下面示例说明BBI偶联物的合成。BBI是一种亲水蛋白，其细胞摄入率低，不能口服吸收。另外，BBI在胃肠道中稳定，耐受肠中哺乳动物蛋白酶的降解[Yavelow，J等(1983)癌症研究43，2454s-2459s]。只有开发出BBI的口服吸收形式，其化学药物预防应用才能被接受。将BBI(20mg)溶解在1ml碳酸氢钠溶液(0.3M，pH8.0)中，与SPDP(5mg/100μl，DMF)在25℃反应2小时。用SephadexG50凝胶过滤层析纯化BBI-PDP后，通过测定二硫苏糖醇(DTT)还原BBI-PDP后所释放的硫代吡啶评价BBI的PDP衍生化。用此方法，每个BBI分子约有4个氨基被SPDP修饰。BBI的衍生化水平可以通过调节反应缓冲液的pH来控制BBI的修饰可被调节为pH7下反应时的一个氨基/BBI分子，到pH8.5下反应时的4.5个氨基/BBI分子。BBI-PDP(20mg)在PBS(1ml，pH5.0)中用DTT(25mM)还原30分钟，然后用SephadexG50柱洗脱。含巯基的BBI流份在柱空体积下洗脱，用Elman′s试剂鉴别，然后在PBS(pH7.0)中与3倍过量(以BBI上每个巯基计)的Pal-PDC(V)在4℃反应16小时。然后用HCl(1M)酸化反应混合物至pH3.0，置于冰上30分钟。上清液用SephadexG25凝胶过滤柱分析。离心分离沉淀，其含有BBI的棕榈基二硫化偶联物BBIssPal(VI)和过量的试剂，溶于DMF(2ml)中，在SephadexLH20柱上用DMF洗脱。分离BBIssPal(VI)流份(在柱空体积下洗脱)，对500ml水透析3次，然后冷冻干燥。用此方法偶联物的收率为约80％(重量)。用与上所述相同的偶联条件，[3H]-标记的Pal-PDC(V)与BBI偶联后证实并定量测定了Pal-PDC与BBI的偶联。还用相同的方法合成了与油酸偶联的BBI(BBIssOleic)。实施例3偶联物的转运通过与0.5ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.5％胰蛋白酶，5.3mMEDTA)于37℃保温10分钟，从25cm2贮存培养烧瓶中解离人结肠癌细胞(Caco-2)。然后将细胞悬浮在5mlDulbecco极限必需培养基中，其中补有15％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺(1％)和必需氨基酸(1％)，并用计数器计数。将悬浮在1.5ml培养基中的Caco-2细胞以0.5百万细胞/插板(insert)的密度种在转孔板(transwell)的顶室中。然后向每个转孔板的底室中加入2.5ml培养基。在无干扰下让细胞吸附2天，然后每2天饲养一次，直到进行实验。在实验前保持细胞约14-20天，每次实验前24小时饲养细胞。接种一周内的细胞单层具有约500-600Ωcm2的跨上皮电阻(TEER)，并保持该电阻达接种后的21天。用氯胺T方法[McConahey，P.C.和Dixon，F.J.(1980)酶学方法，70，221-247]进行BBI和BBIssPal的放射碘标记。14天龄的成片细胞单层用无血清Dulbecco培养基洗涤，然后于37℃在其中培养30分钟。随后用含125I-BBI(10mg/ml)(BBI原始形式或为BBIssPal或BBIssOleic)的无血清培养基更换原培养基，细胞单层在37℃再培养60分钟。该细胞单层用冰冷PBS洗三次，然后与胰蛋白酶(0.5％，EDTA5.3mM)在37℃作用10分钟。将解离的细胞转移到离心管中，离心分离，用冰冷PBS洗涤三次，用计数器测定累积放射活性，最后用文献方法测定细胞蛋白[Lowry，O.H.等(1951)生物学化学杂志193，265-275]。在一些实验中测定了还原125I-BBIssPal的细胞摄入。125I-BBIssPal用DTT(50mM)于60℃下还原5分钟，然后在37℃下还原25分钟。在对照实验中，125I-BBIssPal被置于相同温度培养基中，而不与DTT接触。按如下方法测定BSA(不含脂肪酸)存在下125I-BBIssPal的吸收。在加入细胞单层之前，125I-BBIssPal与含0.1％BSA的培养基在37℃保温30分钟。在一些吸收实验中，BSA先与3倍摩尔过量的棕榈酸混合，然后在实验前与偶联物一起保温。在含FBS的培养基中测定125I-BBIssPal的吸收实验中，将偶联物简单地加入到含规定量FBS的培养基中。2-3周龄、TEER值为约500Ωcm2的成片细胞单层，先在37℃下与含1％FBS的Dulbecco极限必需培养基培养30分钟，然后除去培养基，将1.5ml培养基中的125I-BBI(10mg/ml)偶联物加入到转孔板的顶室中。在底室中加入2.5ml培养基，37℃下保温转孔板。在预定的时间点从每个转孔取出整个底室培养基(2.5ml)，并用γ计数器测定放射活性。在每一实验中，一般在培养后1，2，3，4，5，6和24小时取7个样品。取出24小时样品后，细胞单层用冰冷PBS洗涤三次，从插板上移下，用γ计数器测定累积放射活性。用SephadexG50凝胶过滤层析研究转运跨过细胞单层的125I-BBI偶联物的完整性。简言之，在24小时时取底室培养基后，1.0ml培养基以2000rpm离心，然后用PBS从G50柱(10ml)上洗脱；每份1ml收集，用γ计数器测定各流份的放射活性。完整的偶联物在柱空体积处被洗脱，小于1kDa的片段在柱体积处或以上被洗脱。表1中列出了在不同量FBS存在下游离蛋白形式或与棕榈酸偶联形式的125I-BBI的吸收结果。当偶联物与细胞在无血清培养基中培养时，BBIssPal的吸收比BBI大约140倍。存在含1％FBS的培养基时，BBIssPal的内在化比BBI高35倍。提高血清浓度至10％，BBIssPal的细胞吸收进一步降至仅有BBI水平的10倍。血清存在下BBIssPal向Caco-2细胞中的内在化急剧减小，在含1％和10％FBS的培养基中的值分别为无血清时的14％和2.3％。表1</tables>细胞单层与10μg/ml的125I标记的偶联物37℃培养60分钟。结果用三个单层的平均值±SEM表示。吸收实验是在Dulbecco培养基中，加和不加FBS条件下进行的。因为我们相信BBIssPal的细胞吸收是由偶联物上的棕榈酸配体介导的，所以研究了125I-BBIssPal在用DTT还原前后被Caco-2吸收的情况。因为血清存在于培养介质对偶联物的细胞吸收有抑制作用，因此在无血清培养基中研究吸收作用。结果示于表2中，未处理的125I-BBIssPal的细胞吸收比125I-BBI高80倍。用DTT处理125I-BBI不引起其吸收降低。而用DTT还原125I-BBIssPal使得偶联物的细胞吸收约降低80％。用DTT还原BBIssPal引起棕榈酸从偶联物中解离。因此可见，125I-BBIssPal的吸收是由疏水性棕榈酸配体介导的。表2</tables>游离蛋白或BBIssPal形式的125I-BBI在用DTT(50mM)60℃还原5分钟和37℃还原25分钟前和后测定其细胞吸收。已知牛血清白蛋白(BSA)是体内脂肪酸载体并含有疏水区可紧密结合脂肪酸。由于血清的存在降低125I-BBssPal的吸收，我们研究了BBIssPal结合于FBS中存在的BSA上的可能性。研究了含无脂肪BSA或载脂肪酸BSA的培养基中125I-BBIssPal和125I-BBI的细胞吸收，结果示于表3中。在无BSA的培养基中，如在前述实验结果中看到的，125I-BBIssPal的细胞吸收是BBI的80倍。当脱脂BSA(无脂肪酸的BSA)(0.1％)存在于培养基中时，125I-BBIss-Pal的吸收降低82％，而125I-BBI的吸收未受影响。无脂BSA用3倍摩尔过量的棕榈酸处理，产生载脂肪酸的BSA，在这种BSA(0.1％)存在下，125I-BBI的吸收仍未受影响。因此，125I-BBIssPal与BSA强烈结合，而且这种结合取决于BSA上已结合的脂肪酸数目。表3</tables>该吸收实验是在Dulbecco培养基中在无脂肪酸BSA(BSA)或载脂肪酸BSA(BSA/FA)存在或不存在的条件下进行的。游离BBI或与棕榈酸或油酸偶联物形式的125I-BBI在无血清培养基中在Caco-2细胞中吸收的研究结果如图1所示。结果以内在化BBI的平均ng数±SEM(n＝3)表示。125I-BBssPal的细胞吸收比125I-BBI约大100倍。类似地，125I-BBIssOleic的细胞吸收比125I-BBI约大108倍。125I-BBIssPal和125I-BBIssOleic的吸收差异不显著。实施例4生物分布测定实验动物是重20-25g的2-3周龄雌性CF-1小鼠，实验前自由摄取食物和水。将125I-BBI(3mg/kg)(游离BBI或BBIssPal或BBIssOleic偶联物形式)通过尾静脉给予动物。注射后0.5、3和24小时，处死每实验组的3只动物，取其血液(200ml)、肾、肺和肝，用冰冷PBS洗涤，测定累积放射活性。记录各器官重量并用于计算器官中偶联物的浓度。在腹膜内给药生物分布研究中，将游离BBI或BBIssPal形式的125I-BBI(3mg/kg)注入每只动物腹腔的左下部。然后按以上描述的静脉给药生物分布研究中相同的方法处理动物。静脉给药后BBI和BBIssPal的生物分布结果示于图2中，以每克器官累积百分剂量±SEM表示。结果表明BBI被迅速排泄出体外而未达到高的血浓度，BBIssPal以较高浓度累积在血中，而且明显地从循环中清除速度慢。肾的生物分布结果表明，BBI在肾中迅速累积，而BBIssPal则不然。BBIssPal在肝中的累积约比BBI高5倍，而且BBIssPal在注射后24小时仍在肝中保持高水平。BBIssPal在肺中的累积也比BBI高2倍，但该结果可能由器官切除后其中的残存血液所引起。很明显，BBIssPal在血液和肝中保留时间更长、浓度更高。另外，BBIssPal的肾清除比游离BBI约低4倍。还在CF-1小鼠中研究了BBI和BBIssOleic的静脉给药生物分布。结果示于图3中，以每克器官的累积百分剂量±SEM(n＝3，在0.5、3和24小时)表示。BBIssOleic的生物分布与BBIssPal非常相似，BBIssOleic的血液水平高于BBI，从循环中的清除明显要慢。在相同时间点上，BBIssOleic的血液水平比BBI的高约4倍。BBIs-sOleic的肾清除比游离BBI低约4倍，肝累积高出约4倍。BBIs-sOleic在肝中保留时间延长，注射后24小时肝中仍存在显著水平的偶联物。BBIssOleic的肺水平约比游离BBI水平高2倍，但这一结果可能由肺中较高的残留血量引起。125I-BBIssPal在CF-1小鼠中的腹膜内给药生物分布示于图4中，以注射后0.5小时(图4A)、3小时(图4B)或24小时(图4C)的每克器官百分剂量累积±变程(棒)表示。125I-BBIssPal在0.5和3小时时间点的肾累积比游离125I-BBI低4倍。在24小时时，肾中125I-BBIssPal水平高于125I-BBI。0.5小时时125I-BBIssPal的血浓度与125I-BBI的相似，3小时时高1.5倍，24小时时比BBI高约3倍。125I-BBIssPal的肝累积比125I-BBI的在0.5小时时高1.5倍，3小时时高2.5倍，24小时时高约4倍。在24小时时肝和肾中存在较大量的125I-BBIssPal。实施例5体外转化研究按文献方法[Reznikoff，C.A.等(1973)癌症研究，33，3239-3249；Reznikoff，C.A.等(1973)癌症研究，33，3231-3238]，用C3H10T1/2(克隆8)细胞进行转化实验。每七天进行每75cm2烧瓶传代50000细胞的方法维持无支原体细胞的贮存培养物。按此方法，在达到汇合前的2天要进行细胞传代。贮存培养物生长在补有10％FBS、青霉素(100单位)和链霉素(100μg)的Eagle基本培养基中，并在第9-14代时用于转化实验。用PBS中的胰蛋白酶(0.1％)处理贮存细胞5分钟，再用5ml培养液淬灭胰蛋白酶，以进行细胞传代。调节该方法使得贮存培养物中自发转化减至最小，而培养皿中平板接种效力最高。对用于培养的FBS贮液进行了预筛选，以保证该血清能支持转化细胞的表达和生长。为进行转化实验，将C3H10T1/2细胞(1000/平皿)接种在60mm培养皿中，让其在补有10％FBS、青霉素(100单位)和链霉素(100μg)的Eagle基本培养基中在湿润的5％CO2气氛下生长24小时。然后，用25ml3-甲基胆蒽(MCA)的丙酮溶液(0.25mg/ml)处理，达终浓度1μg/mlMCA(5μg/5ml)以诱发细胞。让细胞在有致癌剂或溶剂存在下生长24小时，然后用不含致癌剂或溶剂的新鲜培养液更换每个平皿中的培养液。在实验的头两周，每周更换两次培养液，在剩余四周内每周更换一次。旨在测定偶联物转化抑制活性的实验中，实验的头三周中细胞保持在含偶联物(1μg/ml)的培养液中，然后保持在不加偶联物的培养液中。致癌剂处理后6周，在显微镜下观察细胞与培养皿的粘附，用PBS洗涤，然后固定在100％甲醇中。然后固定的细胞单层用Giem-sa染液染色。每次实验中每组处理20个平皿。除实验组外，所有转化实验至少包括其他三组阴性对照(未用致癌剂或溶剂处理)，丙酮对照(用25μl丙酮处理)和阳性对照[用25ml丙酮中的MCA(1μg/ml)处理]。在显微镜下研究平板中的转化灶(直径＞3mm)，并按文献标准分类为I、II或III型(Landolph，J.R.(1985)现有细胞系的转化方法机理和应用(Kakunaga，T.和Yamasaki，H.编)IARC科学出版社，法国里昂，185-201页]。简言之，III型灶是紧密、多层、嗜碱的细胞生长区，它被Giemsa染液染成深蓝色并有粗糙的十字边缘。II型灶也是紧密多层的细胞生长区，但Gimesa染色染成紫色，边缘比III型灶光滑、规则。在本实验中未记录I型灶。与每个转化实验相关还研究了细胞的平板接种效力(PE)。为测定不同处理组中细胞的PE，将细胞(200细胞/平皿)接种在每个实验组的三个培养皿中，按与转化实验细胞相同的方式处理。这些实验中的细胞在第10天终止，固定在100％甲醇中，用Gimesa染液染色；对显微镜下可见的50个或更多细胞的集落计数。平板接种效力定义为(集落数/接种细胞数)×100。BBI、BBIssPal和BBIssOleic的体外抗转化活性示于表4中。在转化实验的头三周中MCA处理后立即向培养物中加入1.0μg/mlBBI(游离蛋白形式或与棕榈酸或油酸的偶联形式)。MCA处理细胞，用溶于25μl丙酮的3-甲基胆蒽以1μg/ml的浓度处理24小时。丙酮处理细胞，仅用25μl丙酮处理24小时。实验组用MCA处理24小时，然后在实验的头三周用偶联物处理。未处理细胞不与MCA也不与丙酮接触。统计分析(chi平方)第4组对第3组，p＜0.05；第5组对第3组，0.05＜p＜0.1；第6组对第3组，p＜0.05。接种后约14天平皿中对照的未处理细胞达到汇合，形成良好的粘附的、接触抑制的单层。这些平皿在实验结束时没有转化灶。丙酮处理的细胞在接种后14天也达到汇合，形成良好粘附的单层，且不含转化灶。但MCA处理的平皿含有形态转化的灶所记录的19个平皿中6个含有III型灶。BBI处理组不含转化灶，说明BBI能抑制这些细胞中MCA诱导的转化。BBIssPal处理的细胞，实验中记录的20个平皿中有一个含II型灶。BBIssOleic处理的细胞不含转化灶。该实验所有组别的PE在20％到25％之间。如表4中所示，BBIss-Pal和BBIssOleic都保持了BBI的原始生物活性。表4实施例6单一偶联物和多重偶联物的转运用转孔板和六孔板进行顶端膜结合的125I-BBIssPal的转运研究。在六孔板实验中，125I-BBI或125I-BBIssPal(10μg/ml)与Caco-2细胞在无血清培养基中37℃培养1小时，然后用冰冷PBS洗涤细胞三次，再分成两组。第一组在胰蛋白酶消化并分离细胞后测定偶联物的内在化。第二组中，细胞与无血清培养基再培养，并追踪从细胞释放的偶联物计24小时；每隔一小时取出培养液并测定放射活性。在追踪结束后，细胞用胰蛋白酶处理、分离并测定累积放射活性。测定每个实验的总计数(培养液+细胞的cpm数)，并测了不同时间释放的总计数百分比。在转孔板实验中，偶联物与细胞的顶侧37℃培养1小时。然后用冰冷PBS洗涤转孔板三次，然后再与无血清培养液培养。通过在不同时间对整个底侧或顶侧培养液计数，跟踪向顶侧及底侧培养液中所释放偶联物计24小时。计算跟踪结束时所获总计数(转孔板+培养液计数)和不同时间点偶联物的释放(总数的百分比)。为了保证24小时时在转孔板中所获计数是出于细胞中偶联物的存在，而非塑料表面的非特异结合，转孔板用胰蛋白酶处理10分钟，用冰冷PBS洗涤三次，然后测定累积放射活性。用2个或4个棕榈酸修饰BBI，在转孔板中测定其转运。BBI、4棕榈酸修饰的BBI[BBIssPal(4)]和2棕榈酸修饰的BBI[BBIssPal(2)]在Caco-2细胞单层中的累积转运示于图5A中；结果用BBI(ng/单层)±SEM(n＝3)表示。转运程度的顺序是BBIssPal(4)＞BBI＞BBIssPal(2)。各偶联物向相同细胞中内在化的结果示于图5B中，用单层的内在化BBI(ng)表示。正如所料，BBIssPal(4)的细胞摄入最高，其次是BBIssPal(2)和BBI。用G50柱分析24小时处所得底层培养液，结果示于图6中。如前述已观察到的那样，BBI和BBIssPal(4)都不能被转胞跨过细胞单层。但BBIssPal(2)的底层培养液中少量(但显著)是由完整偶联物构成的。其量占底层培养液总放射活性的约10％到20％。实施例7BBIssPal的皮肤吸收将来自无毛小鼠的新鲜皮肤架在小环上。向每块皮肤0.38cm2面积上施以0.5mg/ml浓度的125I-标记的BBI或BBIssPal样品5ml。每次处理使用2片皮肤，将其保持在室温(23℃)下潮湿环境中。30分钟后，先用PBS小心洗涤皮表面；然后取下皮肤并在100mlPBS中浸泡两次；然后用滤纸吸干并用γ计数器计数。用标记BBI或BBIssPal的比放射活性计算保留在皮肤上的BBI量。吸收进入小鼠皮肤的BBI和BBIssPal分别为0.14和1.6μg/cm2。这说明，当用Pal-PDC修饰多肽时，使BBI的皮肤吸收提高了10倍以上。实施例8棕榈酸化辣根过氧化物酶(HRPssPal)的合成25℃下混合0.5mlPBS中10mg辣根过氧化物酶(分子量40，000；SigmaP8375)和0.1mlDMF中2mlSPDP计2小时。用0.5mlPBS稀释终止反应，4℃下在500mlPBS中透析。24小时后，取出透析管中的溶液，加入1MDTT50μl还原，再用SephadexG-50柱分离。收集并合并柱空体积处的流份，与pH9.6硼酸缓冲液中10倍摩尔过量的Pal-PDC于25℃混合4小时。然后反应混合物于4℃彻底透析3天，经测定最终产物中每分子HRP含有10个棕榈酸残基。HRP分子保留了约20％的原始酶活性。实施例9HRPssPal的细胞摄入小鼠成纤细胞L929的成片单层在六孔板无血清培养液中与30μg/ml游离形式或棕榈酸偶联物形式(HRPssPal)的HRP一起培养。37℃下一小时后，该细胞单层用PBS洗三次，然后溶解在1ml0.05％的Triton-X100中。通过测定每个细胞提取物的酶活性来确定摄入细胞的HRP，并转化为每细胞单层的HRPng数。结果显示HRP和HRPssPal的细胞吸收分别为7和229ngHRP/细胞单层。因而用Pal-PDC修饰HRP，使其细胞吸收提高了30倍。实施例10寡核苷酸的脂化用下述步骤硫醇化与单胺氧化酶B的mRNA互补的一种21mer反义寡核苷酸。在水溶性碳化二亚胺试剂EDC存在下将该寡核苷酸与两倍摩尔过量的半胱胺混合。混合物在25℃下保持2小时，加入对半胱胺两倍摩尔过量的DTT以还原二硫键。用SephadexG-25柱将寡核苷酸与游离半胱胺及DTT分离后，将少量硫醇化寡核苷酸与Ellman试剂反应，用412nm处的吸光度测定巯基的浓度(假定ε＝1.36×104M-1)。然后再确定每个寡核苷酸上的巯基数目。该硫醇化寡核苷酸在pH8的碳酸氢盐缓中液中与相对寡核苷酸中巯基数目两倍摩尔过量的Pal-PDC混合。用SephadexG-25柱纯化棕榈酸化的寡核苷酸。从以上描述，本领域技术人员易于确定本发明的基本特征，而且在不背离其精神和范围的情况下能使本发明适于各种用途和条件。按环境所需可进行形式改变和等价替换，本文所用的任何具体术语只具有说明意义而非用于限制目的。权利要求1.通式VI的化合物其中P选自肽、蛋白和寡核苷酸；R1为氢、低级烷基或芳基；R2为包含脂基的含脂残基；R3为-OH、包含脂基的含脂残基或含一个或两个氨基酸且末端为-CO2H或-COR2的氨基酸链。2.根据权利要求1的化合物，其中R1为氢，R2为脂基，R3为-OH。3.根据权利要求1的化合物，其中R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一个含有脂基。4.根据权利要求1的化合物，其中所述脂基是含约4-26个碳原子的疏水取代基。5.根据权利要求4的化合物，其中所述脂基是含约5-19个碳原子的疏水取代基。6.一种提高选自肽、蛋白和寡核苷酸的含巯基化合物在哺乳动物细胞中吸收的方法，该方法包括从该含巯基化合物形成通式VI的化合物其中P从选自肽、蛋白和寡核苷酸的含巯基化合物衍生的残基；R1为氢、低级烷基或芳基；R2为含脂残基；R3为-OH、含脂残基或含一个或两个氨基酸且末端为-CO2H或-COR2的氨基酸链；给予细胞该通式VI化合物。7.根据权利要求6的方法，其中R1为氢、R2为脂基，R3为-OH。8.根据权利要求6的方法，其中R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一个含有脂基。9.一种延长选自肽、蛋白和寡核苷酸的含巯基化合物在血液和组织中保留时间的方法，该方法包括从该含巯基化合物形成通式VI的化合物其中P选自肽、蛋白和寡核苷酸；R1为氢、低级烷基或芳基；R2为含脂残基；R3为-OH、含脂残基或含一个或两个氨基酸且末端为-CO2H或-COR2的氨基酸链；给予细胞通式VI的化合物。10.根据权利要求9的方法，其中R1为氢，R2为脂基，R3为-OH。11.根据权利要求9的方法，其中R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一个含有脂基。12.通式V的化合物A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(＝O)R3V其中A为芳香活化残基；R1为氢、低级烷基或芳基；R2为含有脂基的含脂残基；R3为-OH、含有脂基的含脂残基或含一个或两个氨基酸且末端为-CO2H或-COR2的氨基酸链。13.根据权利要求12的化合物，其中A为2-吡啶基或4-硝基苯基。14.根据权利要求12的化合物，其中R1为氢，R2为脂基，R3为-OH。15.根据权利要求12的化合物，其中R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一个含有脂基。16.通式VI化合物的制备方法，包括通式PSH化合物，其中P选自肽、蛋白和寡核苷酸，与通式V化合物反应A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(＝O)R3V其中A为芳香活化残基；R1为氢、低级烷基或芳基；R2为含有脂基的含脂残基；R3为-OH、含有脂基的含脂残基或含有一个或两个氨基酸且末端为-CO2H或-COR2的氨基酸链。17.根据权利要求16的方法，其中A为2-吡啶基或4-硝基苯基。18.根据权利要求16的方法，其中R1为氢，R2为脂基，R3为-OH。19.根据权利要求16的方法，其中R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂，R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3至少一个含有脂基。20.通式III的化合物A-S-S-CH2-CR1(NH2)C(＝O)R3III其中R3′为-OH或含一个或两个氨基酸且末端为-CO2H的氨基酸链；A为芳香活化残基；R1为氢、低级烷基或芳基。21.根据权利要求20的化合物，其中R1为氢，R3′为-OH。22.根据权利要求20的化合物，其中R1为氢，R3′为-NHCH2CO2H。全文摘要含巯基化合物(例如含巯基肽或蛋白)的脂肪酸衍生物,即含二硫键的脂肪酸—偶联产物用于向哺乳动物细胞输送该化合物。与未偶联化合物的吸收率相比,这种修饰显著提高了哺乳动物细胞对该化合物的吸收,而且延长了化合物在血液和组织中的保留时间。另外,偶联物中的二硫键在细胞中不稳定,在细胞中易于从脂肪酸部分释放出完整的化合物。文档编号C07K14/47GK1175902SQ96192128公开日1998年3月11日申请日期1996年1月25日优先权日1995年1月25日发明者W－C·申,H·M·伊克拉密申请人:南加利福尼亚大学