专利名称：通过卤过氧化物酶生物转化与化学步骤结合将茚定量转化为(1s,2r)－茚氧化物和(1s ...的制作方法
背景技术：
本申请与以下申请相关Merck 18996，U.S.S.N.08/059,038，1993年5月7日申请，18996IA，U.S.S.N.08/235,576，1994年4月29日申请，Merck 19251，Merck 19114和Merck 19115。
本发明涉及一种合成抑制由人免疫缺陷病毒(HIV)编码蛋白酶之化合物的中间体的方法，特别是某些寡肽类似物化合物，如以下实施例中的化合物J。这些化合物在预防HIV感染、治疗HIV感染和治疗由此引起的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)中是有价值的。这些化合物对抑制血管紧张肽原酶和其它蛋白酶来说也是有用的。
本发明介绍关于茚转化为手性二氯茚氧化物的方法，如下述方案所示
方案
被命名为人类免疫缺陷病毒(HIV)的一种逆转录病毒是一种复合病病原学病原体，所述复合病包括免疫系统进行性损坏(获得性免疫缺陷综合症；爱滋病)和中枢与末梢神经系统退化。这种病毒以前被称为LAV、HTLV-III或ARV。逆转录病毒复制的一个共同特征是，前体多蛋白被病毒编码的蛋白酶广泛地翻译后加工，产生病毒装配和发挥功能所需的成熟病毒蛋白。抑制这一加工会阻止产生正常的感染性病毒。例如，Kohl，N.E.等在美国科学院学报，85，4686(1988)中指出HIV编码的蛋白酶的遗传灭活导致产生不成熟的、非感染性的病毒颗粒。这些结果表明HIV蛋白酶的抑制代表了治疗爱滋病和预防HIV感染的一种可行的方法。
HIV的核苷酸序列显示出在一个开放阅读框架中存在pol基因[Ratner，L.等，自然，313，277(1985)]。氨基酸序列同源性提供了pol序列编码逆转录酶、一种内切核酸酶和一种HIV蛋白酶的证据[Toh，H.等，EMBO J.，4，1267(1985)；Power，M.D.等，科学，231，1567(1986)；Pearl，L.H.等，自然，329，351(1987)]。包括可以从本发明新的中间体和方法制备的某些寡肽类似物在内的终产化合物是HTV蛋白酶的抑制剂，已在EPO 541,168(其于1993年5月12日公布)中公开。参见，例如，本文的化合物J，在以下的实施例中也有说明。
本中请公开了一种制备基本上对映纯的，具有以下结构的1(S)-羟基-2(R)-羟基二氢茚的改进方法
它是化合物J的侧链基团，化合物J是HIV蛋白酶的一种有效的抑制剂。
有关合成的以前的尝试包括从外消旋的茚氧化物低效能地产生外消旋体1(+/-)-氨基-2(+/-)羟基-二氢茚。申请人已发现一种真菌制剂，其将茚生物转化成占优势的反式-(2S，1S)-溴-二氢茚醇。此外，申请人已发现把反应混合物的pH值调节至约12可以将反式-(2S，1S)-溴-二氢茚醇定量转化成(1S，2R)-二氢茚氧化物(85％ee)。从茚制备相同手性氧化物的以前的方法一般给出约10％或更少的产率。(1S，2R)-二氢茚氧化物向(1S，2R)-二氢茚二醇(82％ee)的转化可以容易地进行。发明概述本发明提供了经生物转化进行(1S，2R)-二氢茚氧化物合成的新方法。尔后的化学步骤使得可以形成另一种中间体(1S，2R)-二氢茚二醇。所产生的化合物是用于合成HIV蛋白酶、血管紧张肽原酶和其它蛋白酶抑制剂化合物(例如化合物J)的中间体。发明详述本发明涉及一种合成抑制HIV蛋白酶之化合物的中间体的方法。一个所需中间体是(1S，2R)-二氢茚基环氧化物，实质上不含所不需要的对映体(1R，2S)-二氢茚基环氧化物。另一个所需中间体是(1S，2R)-二氢茚二醇，实质上不含所不需要的对映体(1R，2S)-二氢茚二醇。
在本发明中，描述了一种用于从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚、过量的溴化物离子源以及卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
在本发明中，描述了另一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚与卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的溴化物离子源与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
在本发明中，描述了另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚基环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚、过量的溴化物离子源以及卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约9.0和约13.0之间；和
(d)产生(1S，2R)-二氢茚基环氧化物。
在本发明中，描述了另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚基环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚与卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的溴化物离子源与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约9.0和约13.0之间；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚基环氧化物。
在本发明中，描述了另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚、过量的溴化物离子源以及卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约9.0和约13.0之间；(d)将pH值降低至约6.5和约3.0之间；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
在本发明中，描述了另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚与卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的溴化物离子源与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约9.0和约13.0之间；(d)将pH值降低至约6.5和约3.0之间；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
所说的缓冲液可以是具有约6.5到约7.5之间的pH值的磷酸盐缓冲液。所说的卤过氧化物酶可以是包含卤过氧化物酶的真菌细胞悬液。所说的卤过氧化物酶也可以是包含卤过氧化物酶的真菌细胞培养物的上清液。所说的卤过氧化物酶可以是包含卤过氧化物酶的真菌细胞培养物上清液铵盐沉淀之后的再悬浮液，其中所说的再悬浮液包含卤过氧化物酶。所说的真菌细胞可以来自Curvularia protuberata MF 5400，或者可以来自ATCC74332。所说的溴化物离子源可以是NaBr或KBr或它们的混合物。
另一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚、过量的KBr以及Curvularia protuberata MF 5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
另一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚与Curvularia protuberata MF 5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的KBr与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚、过量的KBr以及Curvularia protuberata MF 5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约12.5；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。
另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚与Curvularia protuberata MF5400卤过氧化物酶的混合物；
(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的KBr与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约12.5；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。
另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚、过量的KBr以及Curvularia protuberata MF5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约12.5；(d)将pH值降低至约5.0；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
另一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚与Curvularia protuberata MF 5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的KBr与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约12.5；(d)将pH值降低至约5.0；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
在本发明的实践中，卤过氧化物酶与底物茚的酶促反应，由包含卤过氧化物酶的混合物中缓慢添加或加入H2O2起始。迅速添加H2O2会使酶失活。溴化物离子源可以首先与酶和底物混合，或者可以将其首先与H2O2混合。在任何情况下，含有H2O2的混合物应该在最后加入。茚可以直接加入或者以在溶剂中的溶液加入。
卤过氧化物酶反应的缓冲液是具有约5.0至约8.0之间pH值的一种含水缓冲液，优选pH值约6.5至约7.5的磷酸盐缓冲液，最优选pH值约7.0的磷酸盐缓冲液。
底物茚的浓度一般约1g/L。技术人员清楚底物浓度可以按照标准和常规的技术变化。随着卤过氧化物酶反应的进行，底物会被消耗掉。实质上所有的茚在约2小时内消失，但是酶促反应的温育时间可以有变化。酶促反应的温度一般是室温，但是反应可以在其它温度下(例如，在约15℃到约37℃之间)进行。
酶促产物主要是(2S，1S)-溴-二氢茚醇。然后这一产物经碱处理产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。在这一化学步骤中，pH值提高到约13.0和约9.0之间，优选约12.5。这种向手性环氧化物中间体的化学转化通常是迅速的，例如，反应常常在不到10分钟内完成。
第二化学步骤通过将pH值降低至约6.5和约3.0之间，优选降低至约5.0使(1S，2R)-二氢茚环氧化物转化成(1S，2R)-二氢茚二醇。pH值越低，反应越迅速。
在本发明的生物转化步骤中可采用任一合适的卤过氧化物酶使底物茚定量形成(2S，1S)-溴-二氢茚醇。卤过氧化物酶可以是中性卤过氧化物酶或碱性卤过氧化物酶。一种优选的卤过氧化物酶源是真菌Curvulariaprotuherata MF5400或ATCC 74332。生物转化步骤可以用未纯化的或者部分纯化的酶方便地进行，例如，用真菌细胞悬液，用真菌细胞培养物的上清液，或者用硫酸铵沉淀含有卤过氧化物酶的真菌培养物细胞上清液后的再悬浮液进行。
溴化物离子源是任一合适的源，优选NaBr或KBr或它们的混合物。而发现氯化物离子实质上不产生产物。茚转化成二氢茚环氧化物和二氢茚二醇可以由市售的得自Calderiomyces fumago的酸性氯过氧化物在存在过氧化氢的酸性条件下经酶催化从茚合成二氢茚氧化物(环氧化物)，而所获得的环氧化物是外消旋的。
由于向系统中缓慢地添加H2O2(以避免酶的抑制)时，酸性卤过氧化物酶(氯过氧化物酶)作用于茚而产生环氧化物，除反应pH值保持在约7外，曾在相似的条件下对来源于各种培养物的中性卤过氧化物酶制剂进行了试验。然而，在各种H2O2添加条件下都不能检测到茚的生物转化，即使是使用(NH4)2SO4-浓缩的酶也是如此。
申请人发现，由这些中性卤过氧化物酶引起的茚的生物转化只有在溴化物离子一起添加到系统中时才发生。重要地是，发现中性条件下溴代醇稳定，并且可以通过提高pH值至碱性范围容易地转化成环氧化物，尽管在这些培养物中可能并不存在卤代醇环氧酶。结果显示，所形成的环氧化物并非总是外消旋的，取决于所使用的培养物。这样，建立了从这些培养物筛选手性环氧化物-合成活性物的新方法。当氯化物离子用来代替溴化物时，观察到形成很少的氯-二氢茚醇。
采用发酵上清液或者(NH4)2SO4沉淀试验具有相当高的中性卤过氧化物酶活性的九种培养物。发现真菌Curvularia protuherara MF 5400的浓缩制剂主要催化反式-2S-溴-1S-二氢茚醇的合成，在pH值提高至约12后，后者导致形成具有超过85％(ee)对映体所需的1S，2R-环氧化物。申请人也发现在碱性pH值下向环氧化物的转化是定量的。所有其它培养物以相等比率产生两种反式-溴代醇，因此是外消旋的环氧化物。
也发现反应的pH值对于使用真菌Curvularia protuherara MF 5400所得到的溴代醇和由此所得的环氧化物产率及螺旋特性起着重要的作用。在5.5至7.5左右的pH值范围内，较高的pH值有利，而较低的pH值加速生物转化。
优选的生物转化微生物是真菌Curvularia protuherata MF 5400，该菌株保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC 74332)。ATCC保藏物74322在本申请的美国申请日之前，真菌Curvularia pratuherata MF 5400的微生物样品已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301Parklawn Drive，Rockville，20852 MD。该培养物的保藏号是ATCC74332。大约在1995年3月16日提出转变为布达佩斯条约保藏物的申请。这一保藏物将在ATCC保持至少30年，并且在公开它的专利获得批准后公众可以获得该保藏物。应当清楚，该保藏物的可获取性，并不构成对实施本发明的许可，而由此侵犯由政府所授予的该专利权。ATCC74332的一般性特征以下简要描述物理特征与分类学特征，包括形态学、培养、生物学和生理学特征。
Curvularia pratuherata MF5400，Nelson和HodgeNRRL 4671在NRRL目录中和其它地方以前被称为Bipolaris sp。
在琼脂培养物中，NRRL 4671的菌落表现出下列形态在25℃，12小时光周期时，在燕麦片琼脂上的菌落在7天达到48mm，隆起，高区带紧密，边缘平滑，伴随着气生菌丝天鹅绒状至羊毛状，暗淡，具马蹄纹，暗黄色到淡黄棕色，然后赭橙黄，很快为灰色至暗灰色，最后开始出现孢子时为黑色，逆转为暗淡的浅灰棕色，没有渗出物。未观察到子座。
在25℃，12小时光周期时，在YM琼脂上的菌落在7天达到32-36mm，隆起，天鹅绒状至羊毛状，具有起伏边缘，紧密，透明至变暗的淡黄棕色，很快变为灰色，最后开始出现孢子时为橄榄绿黑色，逆转为暗淡的浅灰棕色到橄榄绿黑色。未观察到子座。
分生孢子梗达500μm高，7μm宽，直接从琼脂表面出现，直线至弯曲，成为朝着顶点的结节状膝状弯曲，通常不分支，壁平滑，有间隔，在乳酸酚中淡黄棕色到橄榄绿棕色。分生孢子产生细胞合轴，整合，多变，平滑，具有分生孢子产生部位结瘢。
分生孢子26-43μm长，11-14μm宽，宽的梭形至棒状，通常明显地弯曲，壁平滑，通常4-间隔，但是有时3-间隔，中央的细胞经常膨胀和/或弯曲，基部的和末端的细胞颜色通常更暗淡，有明显凸出的种脐，种脐延伸达1.5μm。分生孢子在麦片葡萄糖琼脂上，在12小时内或更短的时间内发芽，第一发芽管或微分生孢子从顶上细胞产生，第二发芽管从基部细胞产生。从分生孢子的顶上细胞产生的微分生孢子或者首先形成的发芽管10-21μm长，6-8μm宽，1-3个间隔，梨形到宽梭形。
由于弯曲的分生孢子和两极分生孢子萌芽，Curvularia spp.(J.B.Ellis.1971.丝孢纲暗色孢科，联邦真菌学研究所，Kew，英国；A.Sivanesan.1987；Bipolaris、弯孢霉属、Drechslera、Exserohilum的草栖物种和它们的终期形态，真菌学报，1571-261)可以一般性地区别于类似的物种Exserohilum和Dreschlera。大多数专家认为Curvularia和Bipolaris之间没有明显的差异，因此可能这就是指定Bipolaris的原因。在Curvularia内，这一分离物被确定为C.protuberata，这是由于其具有凸出的种脐的分生孢子，以及长度可超过40μm的占优势的4-隔分生孢子。培养条件的一般性描述在营养培养基中的优选碳源是碳水化合物，如葡萄糖、木糖、半乳糖、甘油、淀粉、糊精等。其它来源可以包括麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、阿糖、甘露糖、水杨苷、琥珀酸钠等。
优选的氮源是酵母浸膏、肉浸膏、蛋白胨、麸粉、棉籽粉、大豆粉和其它蔬菜粉(部分或完全脱脂的)、酪蛋白水解物、大豆水解物和酵母水解物、玉米浆、干酵母、小麦芽、羽毛粉、花生粉、蒸馏可溶物等；以及无机和有机氮化合物、例如铵盐(如硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵等)；尿素、氨基酸等。
碳和氮源，尽管组合使用有利，但不需要以它们的纯化形式使用，因为不太纯的物质，其中含有痕量的生长因子和大量的矿物营养物，也适于使用。如果需要，可以向培养基中添加无机盐，如碳酸钠或钙、磷酸钠或钾、氯化钠或钾、碘化钠或钾、镁盐、铜盐、钴盐等。需要时，尤其是当培养基泡沫严重时，可以添加消泡剂，如液态石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或硅氧烷。
以大量产生细胞的条件而言，优选浸没需氧培养条件。就小量产生而言，使用在培养瓶或者瓶中振荡或表面培养。此外，当生长在大罐中进行时，优选使用在生产罐中接种的营养型有机体，以避免生产过程中生长滞后。因此，首先需要将在斜面上产生的有机体的孢子或菌丝体接种到相对小量的培养基上，并培养所说的接种过的培养基(也称作种子培养基)，产生有机体的营养接种物，然后将培养过的营养接种物无菌转移到大罐中。产生该接种物的发酵培养基，在接种前一般经高压灭菌。在高压灭菌步骤之前，一般将培养基的pH值调节至约5.5。
可以以各种方法完成培养混合物的搅拌和通气。可以通过螺旋桨或类似的机械搅拌装置、通过旋转或振荡发酵罐，或者通过各种抽吸设备或使无菌空气穿过培养基进行搅拌。可以使无菌空气穿过发酵混合物进行通气。
发酵通常在约20℃和40℃之间的温度下进行，优选在25-35℃之间进行，发酵时间约5至12天，这可以随发酵条件和规模变化。优选产生培养物在220rpm的旋转摇动器上于28℃培养约10天。
为进行发酵优选培养/生产用的培养基包括下列培养基YME g/L麦芽提取物 20酵母浸膏 3葡萄糖 3CFM g/L土豆葡萄糖肉汤培养基 24酵母浸膏 3CFM微量元素溶液 1mLMOPS缓冲液，和氢氧化钠(使pH达7.0)20微量元素溶液包含KH2PO40.8CuSO4·5H2O 0.64FeSO4·7H2O 0.11MnCl2·4H2O 0.8ZnSO4·7H2O 0.15产物回收可以用通常用于回收其它已知物质的常规回收方法从缓冲液回收产物顺式(1S，2R)-二氢茚二醇。所产生的物质出现在缓冲液中，因此，可以用常规方法分离和纯化这些物质，所说方法例如减压浓缩、低压冻干、以常用溶剂(如乙酸乙酯等)抽提，pH值调整，用常用树脂(例如，阴离子或阳离子交换树脂，非离子吸附树脂等)处理，用常用吸附剂(例如，活性炭，硅酸，硅胶，纤维素，氧化铝等)处理，结晶，重结晶等。一种优选的方法是溶剂抽提，特别是利用乙酸乙酯抽提。制剂从本发明的中间体合成的产物化合物可以以剂量单位制剂经口服、注射(包括皮下注射，静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术)、吸入喷射或直肠施用，所说制剂包含常用的无毒性的药学上可接受的载体，佐剂和赋形剂。
本发明的方法和中间体可用于制备抑制HIV蛋白酶、预防或治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，预防或治疗后续病理症状(如爱滋病)的终产物。治疗爱滋病或者预防或治疗HTV感染被定义为包括(但不限于)治疗各式各样的HIV感染的疾病爱滋病，ARC(爱滋病相关综合症)，两者的无症状的和有症状的，实际的或潜在的与HIV接触。例如，可以用本发明的方法和中间体制备的最终产物化合物对怀疑过去接触过HIV之人进行HIV感染治疗，例如输血、器官移植、体液交换、咬伤，偶然的针刺或在外科手术中接触病人的血液等。
最终产物HIV蛋白酶抑制剂在建立和实施抗病毒化合物筛选测定法中也是有用的，包括将它们用作对照物。例如，最终产物化合物对分离酶突变体来说是有用的，这是筛选更有效的抗病毒化合物的极好工具。此外，这些化合物在确定或测定其它针对HIV蛋白酶的抗病毒剂的结合位点中有用(例如，通过竞争性抑制)。这样，由本发明的方法和中间体制备的最终产物化合物是为这些目的而销售的产品。
可以由本发明的方法和中间体制备的HIV蛋白酶抑制剂在EPO541,168中已公开。可以以其药物组合物的形式将HTV蛋白酶抑制化合物施用于需要这种治疗的患者，所述药物组合物包含药物载体和治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受的盐。EPO 541,168公开了合适的药学制剂、给药途径、所述化合物的盐形式和剂量。
本发明的化合物可以有不对称中心，并且以包含在本发明中的所有异构体形式如外消旋体、外消旋混合物和以单独的非对映立体异构或对映体的形式出现。对映体混合物包括1∶1混合物，以及任何其它混合物，例如，1∶4、4∶3、2∶1混合物。
以下详述新方法的代表性实验过程。这些过程仅仅是例举性的，并不限制本发明的新方法。
实施例1有机体和培养条件将从高盐环境(例如沙漠，沼泽地，海等)获得的真菌菌株保持在YMA培养基斜面(组成gm/L麦芽提取物，10；酵母浸膏，4；葡萄糖，4；琼脂，20；10mL微量元素溶液；pH值调至7.0)上。所述微量元素溶液由FeSO4·7H2O，1.0；MnSO4·H2O，10；CuCl2·2H2O，0.025；CaCl2·2H2O，0.10；H3BO3，0.056；ZnSO4·7H2O，0.20；和(NH4)6Mo7O24·4H2O组成。培养基斜面的生长物(Ca，1cm2)用来接种包含25mL KF种子培养基(组成(gm/L)玉米浆，5；番茄糊，40；燕麦粉，10；葡萄糖，10，10mL微量元素溶液；pH值调至6.8)的250mL锥形瓶。将种子培养物在28℃于220rpm下振荡下培养2至3天。用1mL种子培养物接种各250mL锥形瓶，每只锥形瓶包含25mL基本上由Hunter-Cevera和Sotos(Microb.Ecol.，1986.12121-127)描述的改进的CFM生产培养基。CFM生产培养基组成为(gm/L)土豆葡萄糖肉汤培养基，24；酵母浸膏，3；MOPS缓冲液，15；琼脂，2；1mL微量元素溶液；pH值调至7.0。微量元素溶液的组成为(gm/L)K2HPO4，0.8；CuSO4·5H2O，0.64；FeSO4·7H2O，0.11；MnCl2·4H2O，0.8；和ZnSO4·7H2O，0.15。于28℃在220rpm振荡下把生产培养物培养一段特定的时间。
实施例2卤过氧化物酶测定基本上如Hunter-Cevera和Sotos(Microb.Ecol.，1986.12121-127)以前所述使用以酚红为基础进行测定。在测定前，将制备用培养瓶中的完全液体培养基液匀化以保证均一。将2mL各种完全液体培养基和酚红试剂组合在一起，添加0.010mL 3％(V/V)过氧化氢使卤过氧化物酶反应开始。不加过氧化氢的第二反应用作空白。于28℃温育反应混合物，2到4小时后，添加额外每份0.010mL的3％过氧化氢，接着使之产生短暂的涡流。在温育一夜后，将明显为蓝色(与空白比较)的反应混合物离心处理，以除去细胞团块。测定与空白比较的上清液在595nm的吸收值，以确定卤过氧化物酶活性物相对量。
实施例3在2-升锥形瓶中卤过氧化物酶的产生在包含500mL CFM培养基的2升锥形瓶中再培养在筛选中被鉴定为产生中性卤过氧化物酶的真菌菌株。用20mL 72-小时培养物接种该锥形瓶，于28℃在180rpm绕轨运行摇动器上培养。自培养瓶移走样品(10mL)，在桌上型离心机中在3000rpm下离心15分钟。将5mL体积的上清液与5mL酚红溶液混合，并在25℃下温育。在0、1、2和3小时时将20μl量的0.3％H2O2溶液添加到反应物中。于25℃温育24小时后，按以前描述的方法测定试验混合物的光吸收值。1单位的卤过氧化物酶被定义为在采用前述条件时，在595nm处，每催化增加1个OD单位所需的酶量。
实施例4酶制剂经离心完全液体培养基并收集培养物上清液(pH值约为中性)获得酚红筛选中鉴定为具有中性卤过氧化物酶活性的培养物。通过以下步骤获得浓缩制剂向上清液中添加硫酸铵(80％饱和)，在0.1M磷酸盐缓冲液(pH值7)中再溶解沉淀，过滤除去不溶性黑色素。当用酚红测定分析时，浓缩制剂通常以增加3-5倍之量给出酶活性物。将制剂在4℃贮存直到使用。
实施例5茚生物转化反应通常在环境温度下，在带有以500rpm搅拌的磁性搅拌棒的20-mL闪烁药水瓶中进行。向5mL酶制剂中添加0.05mL在丙酮中的10％(V/V)茚，得到1g/L初始底物浓液。借助注射泵开始添加H2O2(以0.4mM/分钟)和KBr(以0.8mM/分钟)(2.7mL/小时88mM H2O2和44mM KBr的贮存溶液)启动反应。除了取样期间外，药水瓶总是用石蜡膜密封。在反应1至2小时后停止添加，取样后用50％NaOH将混合物pH值调节至12。连续再搅拌5分钟，然后抽提混合物用来分析。
实施例6分析在剧烈涡旋下以等体积的己烷/乙醇(95/5)提取碱化前取出的样品，用相同的溶剂进一步使溶剂层的0.5mL样品稀释一倍。将正常相HPLC用于检测茚和溴-二氢茚醇。系统由溶剂运送泵，自动进样器，柱(直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆在10μm硅胶底物上，4.6 X25)和设定在220nm的UV检测器组成。流动相包含92％的己烷和8％的乙醇，流速为1.0mL/min。
用以上所述相同的方式处理和分析碱化后取出的样品的一半，以监测溴-二氢茚醇向环氧化物的转化。另一半样品仅用己烷提取。用正常相HPLC分离在己烷-提取样品中的1S，2R-和1R，2S-环氧化物，使用的色谱柱为纤维素三苯甲酸酯涂覆在10μM硅胶底物上，4.6 X25。流动相包含97％的己烷和3％的异丙醇，流速为1.0mL/min。洗脱液在230nm下监测。
根据两种环氧化物的峰面积计算出对映体过量。
随后进行有关手性二醇的测定。分离(1S，2R)和(1R，2S)二氢茚二醇，使用色谱柱为直链淀粉三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂覆在10μm硅胶底物上。流动相(92％己烷，8％乙醇)在室温下以1mL分钟的速率传送。检测在220nm下进行。一般是(1R，2S)-二氢茚二醇，和(1S，2R)-二氢茚二醇分别在注射之后的12分钟和14分钟洗脱出。
实施例7卤过氧化物酶筛选就产生中性卤过氧化物酶的能力，评估了约350至400种真菌菌株。这些真菌大多数是从含盐环境(例如沙漠，沼泽地，海等)分离的，这种环境已被证明为中性卤过氧化物酶产生菌的栖息地。表1列出了发现产生有效量的卤过氧化物酶的真菌。对两种选定的有机体进行了卤过氧化物酶产生动力学研究对Bipolaris sp(MF 5400)(也称为Curvulariaprotuberata MF5400)和Curvularia protuberata(JP547)而言，分别在8天和18天之后达到最大卤过氧化物酶活性。表1产生碱性卤过氧化物酶的真菌菌株物种 菌株弯孢 MF5395Alternaria sp. GB3432弯孢 GB1736Pestalotiopsis sp. CR538未鉴定的真菌 MF4715Curvularia sp. MF4697Bipolaris sp. MF5400Ulocladium sp. NRRL15200Cochliholus lunatusNRRL15293Curvularia protuberata JP547Ulocladium chartarum ATCC18045Drechslera haloidesATCC28856弯孢 MF5572
实施例8A茚氧化物转化成顺式-1-氨基-2-二氢茚醇
将0.15mL水(8.33mmole)加入到溶解在10mL乙腈中的1mL茚氧化物(8.33mmole)中。使混合物在冰浴中冷却至0-5℃。将浓硫酸逐滴加入，同时保持浴的温度低于10℃。当添加完所有酸时，使温度升至20-25℃。将澄清的溶液陈化30分钟。
这种混合物中添加2mL水，加热溶液30分钟。当甲基噁唑啉完全转化成顺式氨基二氢茚醇时，将反应混合物冷却至室温。
添加5N KOH溶液(3mL，15mmole)，这是硫酸理论值的90％。溶液对石蕊仍然是酸性。如果pH值升高，则出现2再酰化，氨基二氢茚醇的收率减少。过滤除去白色固体(K2SO4)。
在搅拌下添加15mL Dowex树脂(用乙腈润湿)。使搅拌过的树脂陈化15分钟，并取样做LC检定(稀释50倍)。当氨基二氢茚醇的LC峰消失时，过滤收集树脂，以乙腈洗涤，然后以甲醇洗涤。
用50mL在甲醇中的1N NH3处理湿树脂，在室温下搅拌浆状物30分钟。树脂再一次由过滤收集，保存甲醇/NH3。添加另一份1N NH3/MeOH(20mL)，并使树脂再成泥状物。在除去树脂后，合并氨基二氢茚醇的MeOH/NH3溶液，浓缩除去NH3。最终MeOH溶液的分析显示有1.0g(81％产率)顺式-1-氨基-2-二氢茚醇，准备作酒石酸解析剂用。B.制备外消旋茚氧化物将茚(95％，122mL)溶解在甲醇(812mL)和乙腈(348mL)中，然后过滤，滤液以0.05M磷酸二钠(116mL)稀释，接着用1M氢氧化钠水溶液将pH调节至10.5，用水(53mL)稀释过氧化氢(35％，105mL)，在3小时内加入，同时保持温度为25℃，并用1M氢氧化钠水溶液(总共120mL)保持内部pH值为10.5。
在6小时之后，加入1M偏亚硫酸氢钠水溶液(26mL)，同时通过添加1M NaOH(39mL)水溶液保持pH高于8.3，加入水(700mL)，混合物用二氯甲烷(580mL和300mL)提取。将合并的包含茚氧化物的提取物(117g)浓缩至600mL体积。C.制备(1S，2R)-茚氧化物按照O’Donnell等，在有机化学杂志，43，4540(1978)描述的方法制备(1S，2R)-茚氧化物。为此目的，本文参考该文献。D.顺式-1-氨基-2-二氢茚醇的制备由二氯甲烷稀释成600mL总体积的茚氧化物(117g)再以乙腈(600mL)稀释，冷却至-20℃。然后添加甲磺酸(114mL)。将混合物温热至25℃，并陈化2小时。加入水(600mL)，将混合物在45℃加热5小时。分离有机相，将水相进一步加热回流4小时，使浓度达200g/L。用50％氢氧化钠水溶液将pH调节至12.5。然后冷却至5℃并过滤，真空干燥，产生顺式-1-氨基-2-二氢茚醇。E. 1S-氨基-2R-二氢茚醇的制备将(1S，2R)-茚氧化物(85％ee)(250g，0.185mole)溶解在氯苯(300mL)和庚烷(1200mL)中，在低于约-10℃的温度下，慢慢将其添加至乙腈(1250mL)中的甲磺酸溶液(250mL，0.375mole)里。将反应混合物温热至22℃并陈化1.0小时。将水添加到混合物中，经蒸馏浓缩直至内部温度达到100。反应混合物在100℃下加热2-3小时，然后冷却至室温。加入氯苯(1000mL)，搅拌混合物，分离有机相。剩下的水相含1S-氨基，2R-二氢茚醇(85％ee，165g，60％)，用50％氢氧化钠水溶液将其pH值调至12，经过滤收集产物，在40℃下真空干燥，产生1S-氨基，2R-二氢茚醇(85％ee，160g)。F. 1S-氨基-2R-二氢茚醇的制备将(1S，2R)-茚氧化物(85％ee)(250g，0.185mole)溶解在氯苯(300mL)和庚烷(1200mL)中，在低于约-10℃的温度下慢慢添加至乙腈(1250mL)中的发烟硫酸溶液(21％SO3，184mL)里。将反应混合物温热至22℃并陈化1.0小时。将水添加到混合物中，经蒸馏浓缩直至内部温度达到100。反应混合物在100℃下加热2-3小时，然后冷却至室温。加入氯苯(1000mL)，搅拌混合物，分离有机相。剩下的水相含1S-氨基，2R-二氢茚醇(85％ee，205g，74％)，将其用等体积的乙腈稀释，用50％氢氧化钠水溶液将其pH值调至12.5，分离有机相，剩下的水相用另外的乙腈提取，真空浓缩，产生1S-氨基，2R-二氢茚醇(85％ee，205g)。
另外，剩下的水相含1S-氨基2R-二氢茚醇(85％ee，205g，74％)，将其用等体积的丁醇稀释，用50％氢氧化钠水溶液调节pH至12.5，分离有机相。用氯苯洗涤有机相。加入L-酒石酸，经蒸馏除去水，以使氨基-二氢茚醇酒石酸盐结晶。G.苄腈的使用于25℃将茚氧化物溶解在苄腈(50mL)中，加入硫酸(98％，2.25mL)。混合物以5M氢氧化钠水溶液稀释，用二氯甲烷提取(50mL)。真空浓缩有机提取物，产生噁唑啉5.03g。H.顺式-1-氨基-2-二氢茚醇的分离将顺式-1-氨基-2-二氢茚醇(100g)溶解在甲醇中(1500mL)，加入L-酒石酸(110g)的甲醇(1500mL)溶液，将混合物加热至60℃，冷却至20℃。过滤并真空干燥，产生为甲醇溶剂化物的1S-氨基，2R-二氢茚醇酒石酸盐(88g)。J. 1S-氨基-2R-二氢茚醇的制备将1S-氨基，2R-二氢茚醇L-酒石酸盐甲醇溶剂化物(88g)在水(180mL)中溶解，加热至55-60℃。经过滤使溶液澄清，用50％氢氧化钠水溶液将pH值调节至12.5。在2小时内将混合物冷却至0-5℃，然后在该温度下陈化1小时，过滤，用冷水洗涤，在40℃下真空干燥，产生1S-氨基，2R-二氢茚醇(100％ee，99％纯度，37g)。K. 1，2-二氢茚醇转化为顺式-1-氨基-2-二氢茚醇
物质 分子量克或毫升数 微摩尔数1，2-二氢茚而醇150 300毫克2乙腈 412.5mL 47.3水 180.04mL 2硫酸 980.22mL 45N KOH 571.6mL 8.0Dowex10mL50 X4(H+)甲醇(1M NH3)30mL于0-10℃向溶解在含有0.04mL水的3mL乙腈中的300mg 1，2-二氢茚二醇中逐滴加入体积为0.22mL的浓硫酸。完成添加后，移走冰浴，将混合物温热至室温。30分钟陈化后，取出澄清的溶液样品进行Ic检定(稀释500倍)。当所有的二醇都被消耗掉时，进一步用水处理溶液，在蒸汽浴上加热回流，以水解噁唑啉。L.从顺式-(1S，2R)-二氢茚二醇制备顺式-1S-氨基-2R-二氢茚醇将顺式-(1S，2R)-二氢茚二醇(1g)溶解在乙腈(10mL)中，冷却至0℃，加入浓硫酸。在温热20℃时陈化混合物40分钟。加入水(0.8mL)，将混合物加热回流。添加5M氢氧化钾水溶液物(1.6mL)以将pH值调节至高于11，通过过滤除去所形成的固体(硫酸钾)，产生顺式-1S-氨基-2R-二氢茚醇(0.79g，66％产率)水溶液。M.从顺式-1.2-二氢茚二醇制备顺式-1-氨基-2-二氢茚醇顺式1，2-二氢茚二醇(1.0g)溶解在乙腈(20mL)中，冷却至-40℃，加入发烟硫酸(21％SO3，0.8mL)。在逐渐温热至0℃时，将混合物老化1小时。加入水，将混合物加热至80℃，加热1小时，产生顺式-1-氨基-2-二氢茚醇水溶液。
实施例9酰胺9的制备
将在50升园底烧瓶中的(-)-顺式-1-氨基-茚-2-醇(884g，5.93mol)在17.8L干燥的THF(KF＝55mg/mL，KF代表水的Karl Fisher滴定率)和三乙胺(868mL，6.22mol)中的溶液冷却至15℃，所说烧瓶装备有热电偶探针，机械搅拌器，氮气入口接头和鼓泡器。然后，在75分钟内，用冰-水冷却将内部温度保持在14-24℃之间时，加入3-苯丙酰氯(1000g，5.93mol)。添加之后，将混合物在18至20℃陈化30分钟，用HPLC分析检查(-)-顺式-1-氨基-2，3-茚-2-醇的消失。
通过高效液态色谱(HPLC)分析监测反应结果25cm Dupont C8-RX柱，60∶40乙腈/10mM(KH2PO4/K2HPO4)，1.0mL/min.，注射体积＝20mL，检测波长＝200nm，样品制剂＝500倍稀释。近似的保留时间保留时间(分钟) 鉴定物6.3 顺式-氨基-二氢茚醇用吡啶鎓对-甲苯-磺酸盐(241g，0.96mol，0.16当量)处理反应物，并搅拌10分钟(反应混合物在用等体积的水稀释1mL样品后pH值在4.3-4.6之间)。然后，添加2-甲氧基丙烯(1.27L，13.24mol，2.2当量)，加热至40℃，反应进行2小时。将反应混合物冷却至20℃，用乙酸乙酯和5％NaHCO3水溶液(10L)分配。搅拌混合物，进行相分离。用5％NaHCO3水溶液(10L)和水(4L)洗涤乙酸乙酯提取物。经常压蒸馏干燥乙酸乙酯提取物，将溶剂转换成环己烷(～30L总体积)。在蒸馏和浓缩(乙酸乙酯提取体积的20％体积)结束时，使得热环己烷溶液慢慢冷却至25℃，使产物结晶。将所形成的浆状物进一步冷却至10℃，陈化1小时。过滤分离产物，用冷的(10℃)环己烷(2×800mL)洗涤湿的饼状物。于40℃真空(26″Hg)干燥洗涤过的饼状物，产生1.65kg丙酮化合物9(86.4％，98％面积，经HPLC)。1H NMR(300.13MHz，CDCl3，主要为旋转异构体)δ7.36-7.14(m，9H)，5.03(d，J＝4.4，1H)，4.66(m，1H)，3.15(m，2H)，3.06(br s，2H)，2.97(m，2H)，1.62(s，3H)，1.37(s，3H)13C NMR(75.5MHz，CDCl3，主要为旋转异构体)δc168.8，140.9，140.8，140.6，128.6，128.5，128.4，127.1，126.3，125.8，124.1，96.5，78.6，65.9，38.4，36.2，31.9，26.5，24.1。分析C21H23NO2计算值C，78.47；H，7.21；N，4.36；实测值C，78.65；H，7.24；N，4.40。
实施例10环氧化物11甲苯磺酸盐的制备
将在50升4-颈园底烧瓶中的丙酮化合物9(1000g，3.11mol)和2(S)-缩水甘油甲苯磺酸酯(853g 3.74mol，1.2当量)的15.6升THF(KF＝22mg/mL)溶液经真空-氮气清吹脱气3次，并冷却至-56℃，所说烧瓶装备有热电偶，机械搅拌器和氮气入口接头。然后在2小时内添加六甲基二硅叠氮化锂(LiN[(CH3)3Si]2)(2.6L，1.38M，1.15当量)，同时保持内部温度在-50至-45℃之间。在-45至-40℃搅拌反应混合物1小时，然后在1小时内温热至-25℃。在-25至-20℃搅拌反应混合物4小时(直到开始的丙酮化合物为3.0％面积)。
反应通过HPLC分析监测25cm×4.6nm Zorbax Silica柱，在己烷中的20％乙酸乙酯，2.0mL/min，注射体积＝20mL，检测＝254nm，样品制剂＝100倍稀释。近似的保留时间保留时间(分钟) 鉴定物5.5 酰胺96.5 缩水甘油甲苯磺酸盐1013.5环氧化物11
在-15℃以DI水急冷(6.7L)反应混合物，用乙酸乙酯分配。搅拌混合物并进行相分离。用1％碳酸氢钠水溶液(5L)和饱和NaCl(0.5L)的混合物洗涤乙酸乙酯提取物。经真空(28″Hg)蒸馏浓缩乙酸乙酯提取物(28.3升)，加入另外的乙酸乙酯以使溶剂转换成乙酸乙酯(最终体积＝11.7L)。将乙酸乙酯浓缩物进行进一步溶剂转换，(转换成甲醇)，以使产物结晶，并且浓缩至最终体积为3.2升。残留的乙酸乙酯溶剂通过充入10升甲醇并收集10升蒸馏物而除去。将形成的浆液于22℃搅拌1小时，然后冷却至5℃，陈化0.5小时。经过滤分离产物，用冷甲醇(2×250mL)洗涤湿的饼状物。于25℃真空(26″Hg)干燥洗涤过的湿饼状物，产生727克环氧化物11(61.2％，经HPLC主要环氧化物98％面积)。13C NMR(300MHz，CDCl3)δ171.1，140.6，140.5，139.6，129.6，128.8，128.2，127 2，126.8，125.6，124.1，96.8，79.2，65 8，50.0，48.0，44.8，39.2，37.4，36.2，26.6，24.1。
实施例11倒数第二个产物14的制备
在72升园底烧瓶中加热回流(内部温度为84-85℃)2(S)-t-丁基羧酰胺-4-N-Boc-哌嗪12(1950g，6.83mol，99.5％ee)(ee＝对映体过量)和环氧化物11(2456g，97.5∶2.54S/R环氧化物的浆液，6.51mol)在异丙纯(2-丙醇，18.6升)中的浆液，所说园底烧瓶具有四个入口，装备有机械搅拌器、回流冷凝器，蒸汽浴，聚四氟乙烯涂覆的温差电偶和氮气入口。在40分钟之后，获得一种均质的溶液。将混合物加热回流28小时。
在回流期间的内部温度为84-85℃。反应进程由HPLC分析监测25cm Dupont C8-RX柱，60∶40乙腈/10mM(磷酸二氢钾/磷酸氢二钾)，1.0mL/min，检测波长＝220nm，样品制剂＝2微升，反应混合物用乙腈稀释成1mL。近似的保留时间保留时间(分)鉴定物4.8 哌嗪128.9 环氧化物1115.2 偶联的产物1328小时后，剩下的环氧化物11和偶联的产物13(经HPLC分析)分别为1.5％面积和91-93％面积。将混合物冷却至0到5℃，加入20.9升6N盐酸，同时保持温度在15℃以下。完成添加后，将混合物温热至22℃。在这时注意气体的产生(异丁烯)。在20-22℃将混合物陈化6小时。
反应进程由HPLC监测条件与以上相同。近似的保留时间保留时间鉴定物7.0 顺式-氨基茚醇11.9倒数第二个产物1415.1偶联的产物13将混合物冷却至0℃，缓慢加入7.5升50％氢氧化钠把混合物的pH值调节至11.6，在添加期间同时保持温度低于25℃。用乙酸乙酯(40升)和水(3升)分配混合物，搅拌混合物并进行相分离。减压下(29”Hg)浓缩有机相(60升)，将溶剂转换成DMF，浓缩至终体积为10.5升(KF＝1.8mg/mL)。在乙酸乙酯中产物14时HPLC检测产率为86.6％。不加纯化直接将倒数第二化合物14用于下一步骤中。对于分离的产物1413CNMR(75.4 MHz，CDCl3)δ175.2，170.5，140.8，140.5，139.9，129.1，128.5，127.9，126.8，126.5，125.2，124.2，73.0，66.0，64.8，62.2，57.5，49.5，47.9，46.4，45.3，39.6，39.3，38.2，28.9。
实施例12化合物J的一水合物的制备
化合物J向上一步骤的14在DMF(10.5L，KF＝10mg/mL)所溶液中添加8L筛干的DMF(KF＜30毫克/L)，在30″Hg真空系用蒸汽浴加热混合物，以蒸馏掉大部分水和/或任何残余的异丙醇或乙酸乙酯溶剂。最终的浓缩体积是13.5L(KF＝1.8mg/mL)，然后将三乙胺(2.86L，20.51mol)加入到25℃的溶液中，然后加入3-吡啶甲基盐酸盐(96％，1287g，7.84mol)。将所形成的浆状物加热至68℃。
反应进程由HPLC监测条件与以上相同。近似的保留时间保留时间鉴定物2.7 DMF4.2 3-吡啶甲基氯化物4.8 化合物J9.1 倒数第二个产物14于68℃使混合物陈化，直到剩余的倒数第二个化合物14通过HPLC分析为0.3％面积。
在68℃下搅拌混合物4小时，冷却至25℃，用乙酸乙酯(80升)与饱和碳酸氢钠(24升)和蒸馏水(14升)的混合物分配，在55℃下搅拌混合物，进行相分离。用水(20升)在55℃下洗涤乙酸乙酯层3次。减压下浓缩洗涤过的乙酸乙酯层至最终罐体积为30升。常压浓缩结束时，将水(560mL)加入到热溶液中，冷却混合物至55℃，加入化合物J一水合物的晶种。将化合物冷却至4℃，过滤并收集产物。用冷的乙酸乙酯洗涤产物(2×3升)，于25℃在室内真空下干燥，产生2905克(70.7％)化合物J一水合物白色固体。
实施例13吡嗪-2-叔丁基羧酰胺17
2-吡嗪羧酸(8) 3.35kg(27mol)草酰氯 3.46kg(27.2mol)叔丁胺(KF＝460μg/mL) 9.36L(89mol)EtOAc(KF＝56μg/mL)27LDMF120mL1-丙醇 30L在N2下机械搅拌时，在72升3-颈烧瓶中将羧酸16悬浮在27L EtOAc和120mL DMF中。将悬液冷却至2℃。加入草酰氯，保持温度在5和8℃之间。
在5小时内完成添加步骤。在放热的添加过程中，产生CO和CO2。所形成的HCl大量地保持在溶液中。存在一种很可能是吡嗪酸氯化物的HCl盐的沉淀。用叔丁胺急冷反应的含水样品进行形成酸氯化物的测定。在完成时，不足0.7％的酸被保留。
完成酸氯化物的形成测定是重要的，因为不完全的反应导致形成双叔丁基草酰胺杂质。
反应可以经HPLC监测25cm Dupont Zorbax RXC8柱，流速1mL/min，检测波长250nm；在30分钟时，从98％的含水0.1％H3PO4和2％的CH3CN，到50％的含水0.1％H3PO4和50％的CH3CN线性的梯度洗脱液。保留时间酸16＝10.7分钟，酰胺17＝28.1分钟。
使反应混合物在5℃陈化1小时。将所形成的泥状物冷却至0℃，以保持内部温度低于20℃的速率加入叔丁胺。
添加需要6小时，因为反应大量放热。清除一部分所产生的为绒毛状白色固体的氯化叔丁铵。
使混合物在18℃下再陈化30分钟。过滤移走沉淀的铵盐。用12升EtOAc洗涤滤饼。用6L3％碳酸氢钠和2×2L饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机相。用200克Darco G60碳处理有机相，经Sollca Flok过滤，用4L EtOAc处理滤饼。
碳处理有效地除去产物中的某些紫色物质。
在10mbar下将17的EtOAc溶液浓缩至原体积的25％。加入30L 1-丙醇，连续蒸馏直到达到20L的最终体积。
这时，EtOAc低于1H NMR的检测限(＜1％)。在该溶剂改变中的内部温度为＜30℃。在常压下回流几天时，3的1-丙醇/EtOAc溶液是稳定的。
等分样的蒸发产生茶色固体，m.p.87-88℃。13C NMR(75MHz，CDCl3，ppm)161.8，146.8，145.0，143.8，142.1，51.0，28.5。
实施例14rac-2-叔丁基羧酰胺-哌嗪18
物料吡嗪-2-叔丁基羧酰胺17 2.4kg(13.4mol)在1-丙醇溶液12L 20％Pd(OH)2/C 16％重水144克中。
将吡嗪-2-叔丁基羧酰胺17/1-丙醇溶液置于5gal高压灭菌器中。加入催化剂，在H240psi(3atm)下，于65℃使混合物氢化。
24小时后，反应吸收理论量的氢，GC显示有少于1％的17。冷却混合物，用N2清吹，通过Solka floc过滤除去催化剂。用2L温热的1-丙醇洗涤催化剂。
发现在洗涤滤饼期间使用温热的1-丙醇会改善过滤并降低产物在滤饼上的损失。
反应由GC监测30m Megabore柱，从100℃到160℃(以10℃/分钟，保持5分钟，然后10℃/分钟，至250℃)，保留时间17＝7.0分钟，18＝9.4分钟。反应也可以由以EtOAc/MeOH(50∶50)为溶剂和以茚三酮为显影剂的TLC监测。
等分样的蒸发表明，酰化和氢化的总产率是88％，18的浓度是133g/L。
等分样的蒸发产生白色固体的18，m.p.150-151℃；13C NMR(75MHz，D2O，ppm)173.5，59.8，52.0，48.7，45.0，44.8，28.7。
实施例15(S)-2-叔丁基羧酰胺-哌嗪双(S)-樟脑磺酸盐(S)-19
物料rac-2-叔丁基-羧酰胺-哌嗪18 4.10kg(22.12mol)在1-丙醇溶液中 在25.5Kg溶剂中(S)-(+)-10-樟脑磺酸 10.0Kg(43.2mol)1-丙醇 12L乙腈 39L水 2.4L将在1-丙醇中的胺18加入到100L烧瓶中，该烧瓶连接有间歇式浓缩器。在10mbar和低于25℃的温度下将溶液浓缩至约12L。
此时，产物已从溶液中沉淀出来，但在将混合物加热至50℃时，产物又回到溶液中。
均匀等分样的分析表明，18的浓度为341g/L。经HPLC测定浓度25cm Dupont Zorbax RXCS柱，流速为1.5mL/min，检测波长为210nm，流动相(等度洗脱)(98/2)CH3CN/0.1％H3PO4水溶液。18的保留时间2.5分钟。
加入乙腈(39L)和水(2.4L)，产生淡棕色溶液。
由KF滴定进行的水含量测定和1H NMR测得的CH3CN/1-丙醇比率共同说明CH3CN/1-丙醇/H2O的比率是26/8/1.6。在溶液中的浓度是72.2g/L。
于20℃以4部分在30分钟之内加入(S)-10-樟脑磺酸。在加入CSA后，将温度升高至40℃。几分钟后，形成一种浓稠的白色沉淀。将白色的浆状物加热至76℃，以溶解所有的固体。然后，在8小时内使淡棕色溶液冷却至21℃。
产物在62℃沉淀。产物在21℃过滤，不需要陈化。用5L CH3CN/1-丙醇/H2O(26/8/1.6)溶剂混合物洗涤滤饼产物。在35℃，在真空炉中氮吹条件下干燥，得到5.6kg(39％)19化合物。为白色晶体，m.p.288-290℃(分解)[α]D25＝18.9°(c＝0.37，H2O).13C NMR(75MHz，D2O，ppm)222.0，164.0，59.3，54.9，53.3，49.0，48.1，43.6，43.5，43.1，40.6，40.4，28.5，27.2，25.4，19.9，19.8。
按照下述手性HPLC测定，所说物质的ee为95％将19的等分样(33毫克)悬浮在4mL EtOH和1mL Et3N中，加入Boc2O(11毫克)，使反应混合物陈化1小时。真空中完全除去溶剂，将残渣溶解在约1mL EtOAc中，采用带SiO2的巴氏吸管过滤，用EtOAc为流动相。将蒸发的产物组分以约1mg/mL再溶解在己烷中。在Daicel Chiracell AS柱上分离旋光对映体，以己烷/IPA(97∶3)为溶剂系统，流速为1mL/min，检测波长为228nm。保留时间S对映体＝7.4分钟，R＝9.7分钟。
实施例16从盐19制备(S)-2-叔丁基羧酰胺-4-叔丁氧羰基-哌嗪12
物料(S)-2-叔丁基羧酰胺哌嗪双(S)-(+)-CSA盐19，95％ee 5.54Kg(8553mol)二-叔丁基碳酸氢盐 1.86Kg(8.53mol)Et3N 5.95L(42.6mol)EtOH Punctilious 200样品55LEtOAc 2L在100升3-颈烧瓶中在N2下用添加漏斗向(S)-(+)-CSA盐19中加入乙醇，接着在25℃下加入三乙胺。添加Et3N后，固体易于溶解。将Boc2O溶解在EtOAc中，加入到添加漏斗上。以保持温度在25℃下的速率添加Boc2O的EtOAc溶液。添加需要3小时。在添加完Boc2O后，将反应混合物陈化1小时。
反应可以由HPLC监测25cm Dupont Zorbax RXC8柱，1mL/min流，检测波长228nm，等度洗脱(50/50)CH3CN/0.1MKH2PO4(以NaOH调节pH值＝6.8)。12的保留时间＝7.2分钟。以与以前的步骤相同的系统进行手性测定。反应也可以用TLC监测，其中以100％EtOAc为溶剂。(Rf)＝0.7。
然后，在内部温度小于20℃时，在10mbar真空度下在间歇式浓缩器中将溶液浓缩至约10L。通过缓慢流入20L EtOAc中完成溶剂转换，并且再浓缩至约10L。将反应混合物进入具有60LEtOAc的抽提容器中洗涤。用16L5％碳酸钠水溶液、2×10L Di水和2×6L氯化钠饱和水溶液洗涤有机相。将合并的水相洗涤液用20L EtOAc反提取，有机相用2×3L水和2×4L氯化钠饱和水溶液洗在100L间歇式浓缩器中，在10mbar真空度和小于20℃的内部温度下将合并的EtOAc提取物浓缩至约8升。通过缓慢流入约20L环己烷中完成溶剂转换，并且再浓缩至约8L。向泥状物中加入5L环己烷和280mLEtOAc，在所有物质均进入溶液时加热回流混合物。将溶液冷却，并在58℃时加入晶种(10g)。在4小时内将浆状物冷却至22℃，于22℃陈化1小时后过滤分离产物。用1.8L环己烷洗涤滤饼，并且在氮气流下在真空炉中干燥，产生1.87Kg(77％，HPLC测得＞99.9面积％，R-异构体在检测水平下)淡棕色粉末状12。[α]D25＝22.0°(c＝0.20，MeOH)，m.p.107℃；13C NMR(75MHz，CDCl3，ppm)170.1，154.5，79.8，58.7，50.6，46.6，43.6，43.4，28.6，28.3。
实施例17外消旋的茚氧化物的制备将茚(95％，122mL)溶解在甲醇(812mL)和乙腈(348mL)中，然后过滤。滤液以0.05M磷酸二钠(116mL)稀释，然后以1M氢氧化钠水溶液调节pH值至10.5。用水稀释过氧化氢水溶液(35％，105mL)，在3小时内添加，同时保持25℃的温度，并且用1M氢氧化钠水溶液(总共120mL)保持10.5的内部pH值。
在6小时之后，添加1M偏亚硫酸氢钠水溶液(26mL)，同时加入1M氢氧化钠水溶液(39mL)保持pH值高于8.3。加入水(700mL)，用二氯甲烷(580mL，和300mL)抽提混合物。将含茚氧化物的提取物(117g)浓缩至600mL体积。
虽然以上说明书介绍了本发明的原则，为举例说明之目的给出实施例，但是应当理解，本发明实际上包含所有通常的变化、改进和修饰，包括如所附权利要求的范围和其等同的范围。
权利要求
1.一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚、过量的溴化物离子源以及卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
2.一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚与卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的溴化物离子源与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
3.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚、过量的溴化物离子源以及卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约9.0和约13.0之间；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。
4.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量茚与卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的溴化物离子源与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约9.0和约13.0之间；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。
5.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚、过量的溴化物离子源以及卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约9.0和约13.0之间；(d)将pH值降低至约6.5和约3.0之间；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
6.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约5.0到约8.0的缓冲液中制备1当量的茚与卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的溴化物离子源与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约9.0和约13.0之间；(d)将pH值降低至约6.5和约3.0之间；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
7.按照权利要求1-6之任一的方法，其中所说的缓冲液是具有约6.5到约7.5之间的pH值的磷酸盐缓冲液。
8.按照权利要求1-6之任一的方法，其中所说的卤过氧化物酶是含有卤过氧化物酶的真菌细胞悬液。
9.按照权利要求1-6之任一的方法，其中所说的卤过氧化物酶是含有卤过氧化物酶的真菌细胞培养物的上清液。
10.按照权利要求1-6之任一的方法，其中所说的卤过氧化物酶是真菌细胞培养物上清液铵盐沉淀之后的再悬浮液，所说的上清液含有卤过氧化物酶。
11.权利要求10的方法，其中所说的真菌细胞是Curvulariaprotuberata MF5400，或者来自ATCC74332。
12.按照权利要求1-6之任一的方法，其中所说的溴化物离子源是NaBr或KBr或它们的混合物。
13.一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚、过量的KBr以及Curvularia protuberata MF5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
14.一种从茚定量合成(1S，2S)-溴-二氢茚醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚与Curvulariaprotuberata MF5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的KBr与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)产生(1S，2S)-溴-二氢茚醇。
15.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚、过量的KBr以及Curvularia protuberata MF5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约12.5；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。
16.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚环氧化物的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚与Curvularia protuberata MF 5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的KBr与约1到约2当量H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH提高至约12.5；和(d)产生(1S，2R)-二氢茚环氧化物。
17.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚、过量的KBr以及Curvularia protuberata MF5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进约1到约2当量的H2O2，温育所形成的第二混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约12.5；(d)将pH值降低至约5.0；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
18.一种从茚定量合成(1S，2R)-二氢茚二醇的方法，该方法包含以下步骤(a)在pH值约7.0的磷酸盐缓冲液中制备1当量的茚与Curvularia protuberata MF 5400卤过氧化物酶的混合物；(b)向以上混合物中缓慢地混合进过量的KBr与约1到约2当量的H2O2的第二混合物，温育所形成的第三混合物，直到基本上所有的茚被消耗掉；(c)将pH值提高至约12.5；(d)将pH值降低至约5.0；和(e)产生(1S，2R)-二氢茚二醇。
全文摘要
本发明公开了一种利用真菌卤过氧化物酶的作用和随后的各种化学步骤(例如调整pH)将茚定量生物转化为(1S,2R)－茚氧化物和(1S,2R)－二氢茚二醇的方法。
文档编号C07D401/06GK1190994SQ96195618
公开日1998年8月19日 申请日期1996年5月15日 优先权日1995年5月19日
发明者M·M·查尔特赖恩, N·C·肯诺尔斯, G·M·加尔里泰, 小R·C·奥勒温斯基, T·R·维尔霍文, 张劲游 申请人:麦克公司