专利名称：：细胞毒性的吡啶并吖啶类生物碱的制作方法
技术领域：
：本发明提供新的细胞毒性吡啶并吖啶类(pyridoacridine)生物碱，其中的一种ShermilamineD是从被囊动物Cystodytesviolatinctus中分离而得。
背景技术：
：海洋生物，特别是软珊瑚、海绵和被囊动物，能产生许多次级代谢产物并表现出广泛的生物学活性(参考文献13Faulkner，D．J．Nat．Prod．Reports．，1997，14，259-302及其中所引用的参考文献)。生物碱是这些代谢产物中重要的一类；在1983年报道了一种海洋生物碱amphimedine的结构(参考文献14Schmitz，F．J．等，J．Am．Chem．Soc．1983，105，4835-4836)、后来合起来称为“吡啶并吖啶类”的新一类海洋生物碱中的第一个。从那时起，已报道了超过40个这类例子(参考文献1Molinski，T．F．化学评论，1993，93，1825-1838)。吡啶并吖啶类是具有显著特征的海洋衍生的生物碱，其主要基于11H-吡啶并[4，3，2-mn]吖啶结构，如下所示11H-吡啶并[4，3，2-mn]吖啶骨架一类显著细胞毒性的海洋吡啶并吖啶类生物碱是Shermilamine类(参考文献6Scheuer，P．J．等，有机化学杂志，1988，53，4619-4620。参考文献5Scheuer，P．J．等，有机化学杂志。1989，54，4231-4232。参考文献3Kashman，Y．等，有机化学杂志．1989，54，5335-5337。参考文献12Barrows，L．R．；Ireland，C．M．等，有机化学杂志，1994，37，3819-3827)，其结构式如下所示ShermilamineAR1=BrR2=(CH3)ShermilamineBR1=HR2=(CH3)ShermilamineCR1=HR2=(CH=C(CH3)2)Shermilamines类均分离自被囊动物，其中A和B得自Trididemnumsp．，C得自Cystodytessp．。发明概述本发明提供了具如下式(Ⅰ)的新的吡啶并吖啶类其中R独立选自含有氢或溴的基团。更具体地讲，本发明涉及从被囊动物Cystodytesviolatinctus中提取和分离的ShermilamineD(在式(Ⅰ)中R=H)。ShermilamineD表现出抗肿瘤活性。特别是，ShermilamineD对源自人实体瘤，如人肺癌、人结肠癌和人黑色素瘤等的细胞系均表现出抗肿瘤活性。而且对其他肿瘤细胞系如白血病和淋巴瘤也表现出抗肿瘤活性。对具式(Ⅰ)的化合物敏感的患恶性肿瘤的哺乳动物，本发明还提供了一种治疗方法。它包括给予有效治疗量的具式(Ⅰ)的化合物或其药用组合物。本发明还进一步提供了以式(Ⅰ)的化合物为活性成分的药用组合物，以及其制备方法。本发明的另一方面提供了制备化合物ShermilamineD(在式(Ⅰ)中R=H)的方法，其包括从被囊动物Cystodytesviolatinctus中的提取和分离。发明的最佳实施方案药用组合物的实例包括任何固体(片、丸、胶囊、颗粒等)或液体(溶液、悬浮液或乳剂)的、具适合口服、局部或非肠道给药方式的制剂。并且它们可能含有纯的化合物、或含有与之合用的任何载体或其他药学活性化合物。这些组合物在非肠道给药时可能需要经过灭菌处理。含式(Ⅰ)化合物的药用组合物的准确剂量按照药用制剂、使用方式以及宿主和肿瘤的具体治疗部位而变化。其他因素象年龄、体重、性别、饮食、给药时间、排泄速率、宿主状态、联合用药情况、反应敏感性及疾病的严重程度都应考虑之内。在最大耐受剂量范围内组合物可连续或定期用药。抗肿瘤活性细胞在Eagle’s极限必需培养基内保持于对数生长期，培养基中含Eagle’s缓冲盐、2．0mM的L-谷酰胺以及非必需氨基酸，不含碳酸氢钠(EMEM／neaa)；最后补充加入10％的胎牛血清(FCS)、10-2M的碳酸氢钠、0.1g／l青霉素-G和硫酸链霉素。有一种筛选方法被用来确定和比较这些化合物的抗肿瘤活性，这种方法是通过对Bergeron等人描述的方法(参考文献15RaymondJ．Bergeron，PaulF．Cavanaugh，Jr．，StevenJ．Kline，RobertG．Hughes，Jr．，GaryT．Elliot和CarlW．Porter。亚精胺儿茶酚胺离子螯合物的抗肿瘤和抗疱疹活性，Biochem．Bioph．Res．Comm．1984，121，848-854)经修改后而得。实验时所采用的抗肿瘤细胞是P-388(DBA／2小鼠淋巴瘤细胞悬浮培养物)、A-549(人肺癌单层细胞培养物)、HT-29(人结肠癌单层细胞培养物)和MEL-28(人黑色素瘤单层细胞培养物)。将P-388细胞接种到16mm孔培养板中，每孔1×104个细胞，每孔1ml等份的MEM5FCS中含所需的药物浓度。另外单独设一无药培养组作为空白对照生长组，以确定细胞保持在指数生长期。所有测定均重复两次。在37℃、10％CO2、98％湿度下培养3天后，通过比较给药孔和空白孔中细胞的生长可确定IC50的近似值。将A-549、HT-29和MEL-28细胞接种到16mm孔培养板中，每孔2×104个细胞，每孔1ml等份的MEM10FCS中含所需的药物浓度。另外单独设一无药培养组作为空白对照生长组，以确定细胞保持在指数生长期。所有测定均重复两次。在37℃、10％CO2、98％湿度下培养3天后，以0．1％的结晶紫染色细胞，通过比较给药孔和对照孔中细胞的生长可确定IC50的近似值。结果给出于下表中<tablesid="table1"num="001"><table>IC50(μM)P-388A-549HT-29MEL-28ShermilamineD1．330．272．660．53</table></tables>提取和分离以EIMS质谱仪记录Low-resolution质子光谱，以BrukerARX-500分光计记录1H和13C-NMR光谱。所有化学位移以TMS(δ=0ppm)作为基准记录。被囊动物Cystodytesviolatinctus于1996年4月间由SCUBA收集于马达加斯加西北部Mayotte(科摩罗群岛)环礁的Prevoyante礁5米深的水下。对照样品(AM-35)贮存于巴黎国立历史自然博物馆。所收集的新鲜样品立即于-25℃冷冻。匀浆动物的冻干品(提取后重600g)，然后以甲醇-三氯甲烷1∶2(500ml×4)在室温下提取。真空蒸发提取物，得到以三氯甲烷提取的液相。蒸干三氯甲烷提取物得到油质残余物(1．6g)，粗提物以20％的甲醇溶液和四氯化碳萃取分离，蒸干有机提取物，层析残余物，首先通过SephadexLH-20(已烷，三氯甲烷，甲醇，2∶1∶1)，然后通过以甲醇冲洗的硅胶色谱柱，以三氯甲烷和1-10％的甲醇开始，化合物ShermilamineD(占粗提物的2％)在以5％甲醇的三氯化碳溶液中出现。ShermilamineD是泡沫状油，m／z376(C21H20N4OS)。NMR数据见下表ShermilamineD的NMR数据<tablesid="table2"num="002"><table>CNo．δc(m)aδH(m，JinHz)a，bHMBCtoCNo2150．7(d)8．40(d，4．8)3，3a，13b3106．8(d)7．20(d，4．7)2，8b3a140．2(s)--3b116．3(s)--4123．7(d)7．80(d，7．9)3b，6，7a5120．6(d)6．98(t，7．5)3a，3b，6，76131．7(d)7．33(bt，7．5)4，7a7116．4(d)6．84((d，8．1)3b，57a140．7(s)--8a132．9(s)--8b116．7(s)--9109．6(s)--9a121．4(s)--1129．7(t)3．50(bs)9a，1212163．5(a)--13a121．3(s)--13b137．3(s)--1427．4(t)2．96(bt，4．0)8a，9a，15，17，181558．7(t)2．62(bt，4．8)14，17，181744．9(q)2．50(s)15，181844．9(q)2．50(s)15，17NH-8-10．2(bs)-NH-13-9．05(bs)9a．11．13b</table></tables>1．NMR溶剂为CDCl3，1H在500MHz测定，13C在125MHz测定。2．NMR溶剂为CDCl3-CD3OD(4∶1)参考文献1．Molinski，T．F．化学评论，1993，93，1825-1838)2．Scheuer，P．J．等，有机化学杂志，1990，55，4426-42313．Kashman，Y.等，有机化学杂志，1989，54，5335-53374．Schmitz，F．J．，Helm，D．v．d．有机化学杂志m．1991，56，804-8085．Scheuer，P．J．等，有机化学杂志，1989，54，4231-42326．Scheuer，P．J．等，有机化学杂志，1988，53，4619-46207．Steffan，B．等，四面体，1993，49，6223-62288．Spector，I．等，细胞生理学杂志l．1993，157，481-4929．Burres，N．S．等，癌症研究，1989，49，5267-527410.Ciufolini，M．A．等，美国化学会志，1995，117，12460-1246911．Taraporewala，I．B．等，医用化学杂志，1992，35，2744-275212．Barrows，L．R．；Ireland，C．M．等，医用化学杂志，1994，37，3819-382713．Faulkner，D．J．Nat．Prod．Reports．，1997，14，259-30214．Schmitz，F．J．等，美国化学会志，1983，105，4835-483615．RaymondJ．Bergeron，PaulF．Cavanaugh，Jr．，StevenJ．Kline，RobertG．Hughes，Jr．，GaryT．ElliotandCarlW．Porter．亚精胺儿茶酚胺离子螯合物的抗肿瘤和抗疱疹活性，Biochem．Bioph．Res．Comm．1984，121，848-854)权利要求1．具下式(Ⅰ)的化合物其中R独立选自氢或溴。2．权利要求1的化合物ShermilamineD具有下式3．对患恶性肿瘤的哺乳动物，采用其敏感的、根据权利要求1的具式(Ⅰ)的化合物进行治疗的方法，其包括给予患病个体治疗有效量的化合物或其药用组合物。4．对患恶性肿瘤的哺乳动物，采用其敏感的、根据权利要求2的ShermilamineD进行治疗的方法，其包括给予患病个体治疗有效量的ShermilamineD或其药用组合物。5．包含作为活性成分的权利要求1的具式(Ⅰ)化合物的药用制剂6．包含作为活性成分的权利要求2的ShermilamineD的药用制剂。7．治疗患恶性肿瘤哺乳动物的方法，该方法包括以治疗有效量的权利要求1的具式(Ⅰ)化合物与其它抗肿瘤化合物联合给予患病个体8．治疗患恶性肿瘤哺乳动物的方法，该方法包括以治疗有效量的权利要求2的ShermilamineD与其它抗肿瘤化合物联合给予患病个体。9．权利要求2的ShermilamineD的制备方法，其包括从被囊动物Cystodytesviolatinctus中的提取和分离。全文摘要ShermilamineD是一种具显著细胞毒性的吡啶并吖啶类生物碱,已被从被囊动物Cystodytesviolatinctus中提取分离出来。根据1－D和2－DNMR资料确定了此化合物的结构(1)。文档编号C07D513/16GK1283198SQ9881269公开日2001年2月7日申请日期1998年11月3日优先权日1997年11月3日发明者Y·卡斯曼,G·科伦－戈尔兹拉格,M·阿克尼恩,D·加西亚格拉沃洛斯申请人:格雷厄姆·基思·拉夫尔斯,拜奥马研究所有限公司