精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物的制作方法

专利名称：精确长度的聚酰胺链、其制备方法和其与蛋白质的缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及精确长度(即精确的单体单元数目)的聚酰胺链及其制备方法。更具体地说，本发明涉及通过共价连接精确长度的聚酰胺链进行化学修饰目标分子如大分子(特别是生物上重要的多肽)和表面(例如金或玻璃)的方法，发明背景大家都知道许多物质诸如肽、多肽如蛋白质及生物缀合物的性能可通过在其上接枝有机链状分子来增强。这种接枝可提高作为连接结构基元的多个拷贝的连接体的物质的有效性、提高物质免受免疫系统影响和提高物质的半衰期。生物传感器表面也可在共价连接生物分子之前首先在表面(通常为金或玻璃)上接枝有机链状分子来增强，例如Biacore AB(瑞典)出售的葡聚糖涂覆的传感器。
常用于增强性能的有机链状分子是聚乙二醇基即“PEG基”的链，即基于重复单元-CH2CH2O-的链。参见例如Tsutsumi等人，Jpn.J.CancerRes.859-12(1994)，其中显示单甲氧基聚乙二醇的酯提高人肿瘤坏死因子α效能。PEG基的链为柔韧、两亲、非免疫原性的并且不易受蛋白水解酶的剪切。经PEG或PEG基链修饰的物质的制剂已降低了免疫原性和抗原性。参见例如Abuchowski等人，Journal ofBiological Chemistry 252(11)3578-3581(1977)，其中显示了PEG改变了牛血清清蛋白的免疫性能。PEG也用于提高其所连接物质的分子尺寸，由此提高其生物半衰期。这些PEG修饰物质的有益性质使得其在各种治疗应用中非常有用。
人们已知将PEG链或基于PEG的链接枝到蛋白质上。参见例如Zalipsky的美国专利5122614号，其描述了被转变成其N-琥珀酰亚胺碳酸酯衍生物的PEG。已知的还有用反应性基团修饰以便于接枝到蛋白质上的PEG链。参见例如Harris的美国专利5739208号，其描述了用砜部分活化而选择性连接到分子和表面的硫醇部分的PEG衍生物以及参见Harris等人的美国专利5672662号，其公开了具有单个丙酸或丁酸部分的PEG酸的活性酯。Zalipsky在BioconjugateChemistry 6150-165(1995)中对该领域进行了广泛详尽地综述。除了使用PEG外，Wright的EP 0605963 A2描述了包含与蛋白质上的醛基形成腙键的水溶性聚合物的连接试剂。
聚酰胺链也可用作增强性能的有机链状分子。此外，在啮齿动物中进行的急性毒性筛选也表明聚酰胺既无毒性也无免疫原性(Hai等人，Bioconj.Chem.9645-654(1998))。
但是，由于该领域的现有技术现状不能提供具有可测长度的有机链状分子的合成，也遇到了一些问题。
用于制备PEG或PEG基链[甚至是那些相当低分子量如3400的链(参见例如Kramer等人，Nature 395710(1998))]的技术涉及难控制的聚合步骤，其产生具有一平均值附近的宽范围链长的制剂，即它们涉及-(CH2CH2O)m-的聚合物制剂，其中m不是一个独立的值而是一个平均值附近的范围值。这在PEG链本身和已接枝PEG链的化合物的质谱上看得很明显。例如，在John等人，Chemistry & Biology 4939(1997)中，当标示相对分子量3400和5000的PEG链接枝到一种小肽上时，产生均值±1000的质量范围，即2000amu的范围的产物。这是现有技术方法的典型结果。当可获得足够的质量分辨时，光谱图显示出许多相隔44amu的信号。例如，参见Lu等人，Int.J.PeptideProtein Res.43127-138(1994)。这种大的质量范围相应于相应的链长范围。因此，含这种PEG或PEG基链的产物并不均一，其包括具有短、中和长链的分子。这种情况在具有两个PEG链的化合物情况下更糟，因为统计上它们必须由具有两个短链、一个短链和一个长链和两个长链的分子混合物组成，因此在质量上的变化比只具有一个链的产物更大。因为当这种链用于连接两个部分(如在Johnson等人，Chemistry & Biology，上述)时，链长影响质量、生物半衰期、免于来自免疫系统的作用和亚基的间隔，具有一个或多个常规PEG链的化合物的生物作用为所存在的各种物质(具短链、具中链和具长链的物质)及其相对浓度(因为对于一系列类似的化合物来说生物半衰期是质量的函数，因此其主要随时间变化)的平均作用。因为PEG非常有用，所以这种复杂的状况被容忍。
固相肽合成产生充分定义的重复单元“-NH-Y-CO-”的聚酰胺，但是需要保护衍生物和去保护步骤。重复单元-NH-Y-NH-CO-X-CO-如“-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)4-CO”的聚酰胺(例如Nylon 66)通过聚合二酸和二胺来制备。这种合成与涉及二酸和二胺的溶液聚合的更新的技术一起产生了具有宽范围链长的产物。所得到的这些聚酰胺的链长非均一性很大程度上归于没有保护基。
从用有机链状分子修饰的物质的许多潜在用途来看，本领域需要有用于修饰目标大分子或物质如表面的改良链。因此，需要有一种制备这种聚合物并使其具有可定长度的方法，它通过自动固相合成而无需保护基。具体地说，需要有精确长度的PEG基链(即含一个-(CH2CH2O)m-基团的链，其中m为一单值)以及构建这种链的方法。这样，可克服在目前所用于医药和非医药用途的PEG链中固有的及可看到的缺陷。本发明提供的精确长度的聚酰胺链和方法满足了这类需要以及其它需要。
本发明概述本发明涉及一种新类型的聚合物，含精确数量的重复单体单元(-NH-Y-NH-CO-X-CO-)的聚酰胺基链，其通过无需保护基的自动固相合成来合成，其中每个步骤中X和Y可独立变化。显示为噬菌体源结合肽的二聚物、支链结构物和多聚体分子容易与这些精确长度聚酰胺链装配，这些精确长度聚酰胺链可用于作为分子间隔基取代多肽和聚乙二醇。
更具体地说，本发明提供了具有精确重复单元数目的精确长度的水溶性有机聚酰胺基链，它是基于形成精确数目的单体单元的酰胺键构建的，同时本发明提供了制备这类链的方法。这种链具有式(III)-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且对于每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在。
更具体地说，本发明提供了基于精确数目的重复聚乙二醇基单元的精确长度的聚乙二醇基链以及制备这种链的方法。
本质上，本发明并不增加含-(CH2CH2O)m-基团链中的m(这将随m变大并取范围值而不是独立值导致非均一性)，而是通过酰胺键连接一系列含-(CH2CH2O)p-基团的单体单元，其中p为足够小的单体单元数目值从而使p为单一值而非范围值。
本发明的另一方面提供了在温和条件下用一个或多个精确长度的聚酰胺链修饰大分子(如蛋白质、肽、核酸、脂质体)或物质如表面的方法和化合物。
在本发明的另一方面，其中n’为1的式(III)的链通过下面步骤合成(a)用摩尔过量的试剂L-CO-L’(其中L和L’为离去基团并且相同或不同)酰化式Z-Q载体化合物的氨基或羟基，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基(可以为氨基酸残基)或目标分子；所述载体为一固相、基体或表面；(b)用摩尔过量的式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步骤(a)的产物；(c)用摩尔过量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化步骤(b)的产物；(d)活化步骤(c)产物的游离羧基；(e)用摩尔过量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(d)的产物；和(f)任选使用式HOOC-X-COOH的二酸衍生物和式NH2-Y-NH2的二胺重复步骤(c)-(e)，其中所述X和Y取代基和在任何前面氨解和酰化步骤中所用的X和Y取代基相同或不同。
在本发明的另一方面，n’为0的式(III)的链通过下面步骤合成(a)用摩尔过量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化式Z-Q载体化合物的氨基或羟基，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；所述载体为一固相、基体或表面；(b)活化步骤(a)产物的游离羧基；(c)用摩尔过量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(b)的产物；和(d)任选使用式HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中所述X和Y取代基和在任何前面酰化和氨解步骤中所用的X和Y取代基相同或不同。
本发明的另一方面为具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰胺基组成，所述组成具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n为1-100的整数；n’为0或1；q为一个1到10的整数；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且对于每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；V选自其性质有待修饰或增强并且具有任选的二价间隔基或连接基的一价或多价目标分子；具有多价连接基的报道基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-载体，其Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或不存在，Q为连接基或目标分子，所述载体为固相、基体或表面；U选自其性质有待修饰或增强并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；端基；肽链；保护基；载体和反应性基团。
本发明的又一方面是具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰胺基均一组成，所述组成具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n为1-100的整数；n’为0或1；q为一个1到10的整数；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且对于每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；V选自为少于50个氨基酸残基的肽并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；具有多价连接基的报道基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-载体，其Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或不存在，Q为连接基或目标分子，所述载体为固相、基体或表面；U选自为少于50个氨基酸残基的肽并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；端基；肽链；保护基；载体和反应性基团；其中U或V的至少一个是目标分子。
本发明的再一方面提供合适用于合成水溶性有机聚酰胺基链的试剂的试剂盒和含有这种试剂或其性质有待修饰或增强并且具有任选的二价间隔基或连接基的这种链和目标分子的试剂盒。
具体实施方案的说明在生物化学和医学中，需要生物相容的分子链在其末端显示出结合模量(参见例如Kramer等人的上述文献；Peters等人，Science2821439(1998)；Johnson等人在上述Chemistry & Biology中的文章和Terskikh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 941663-1668(1997))，有时为了其它目的也是如此(Zalipsky，Bioconjugate Chemistry，上述)。理想情况下，这些链应具有规定的结构，即具有规定的长度，而不是不同长度链的混合物。多肽链提供了一种可能性，但主要是易受水解蛋白剪切并可能证明是免疫原性的。聚乙二醇(“PEG”)提供了另一种可能性。
本发明提供了一种制备结合了多肽(精确长度，便于合成)和PEG(柔韧、两亲、非免疫原性、对蛋白酶不敏感)两者优点的新类型的生物适合的聚合物的方法并由此可用于代替合成和半合成结构的常规多肽或PEG分子间隔基。
通过本发明方法，人们不再局限于极少的商品PEG连接基的标准长度，长度可非常接近地微调。本方法也方便地使用商品物质，易于自动化，并消除了保护和去保护步骤。此外，正如期望的PEG基分子那样，本发明方法生产的聚酰胺完全溶于水和有机溶剂如二甲基甲酰胺，但不溶于乙醚。
本发明进一步提供了一种基于精确数目重复单体单元的酰胺键形成构建的精确长度的水溶性有机聚合物基链以及制备这种链的方法。众多有机前体可用于本发明的链。为了说明而非限定，本发明可由含-CH2CH2O-单元的参考单体来说明，其得到的产物称为聚乙二醇基(“PEG-基)链。但是，应理解此处所谓的“PEG-基”链意欲指任何“水溶性聚合物基”链或“水溶性有机”链。此外，由于所述连接基或链通过形成酰胺键来构建，所以应理解本发明的水溶性聚合物基链也可适当地称为“水溶性有机聚酰胺基”链。术语“连接基”和“链”可替换使用，因为本发明的链可用于将目标连接在一起和连接到单个目标上。
因此，本发明提供了以精确数目的单体单元为基础的精确长度的水溶性有机聚酰胺基链。非常短的精确长度的化学链被用于构建(优选在固相上)这些精确长度的水溶性有机聚酰胺基链。具体地说，本发明使用精确长度的非常短的链来构建精确长度的PEG基链。这种短链易于通过本领域技术人员已知的方法合成。此外，这些非常短的链的一些可通过商业渠道获得并且如Wilbur等人在BioconjugateChemistry 8572-584(1997)中所述已经用于短PEG连接基的溶液合成。
本发明也涉及通过共价连接此处所述的精确长度的聚酰胺基链化学修饰目标分子和表面(如金或玻璃)的方法。这些链具体可用于增强目标分子的性能，用于将另外的分子(诸如荧光团、金属螯合剂或其它报道基团、或药物分子)结合到目标分子上，或将几个较小的目标分子连接在一起而形成具有增强的性能的较大分子(二聚物、三聚物、四聚物和更高级的低聚物)。本发明也尝试使用所述水溶性有机聚酰胺基链修饰用于生物传感器和其它用途的表面诸如金或玻璃或塑料。
术语“目标分子”是指其性能有待通过连接此中所述精确长度的水溶性有机聚酰胺基链改进或增强的一价或多价目标分子，特别是大分子。这种目标分子可以是分子量至少为100并高至10000或10000以上的有机分子(包括生物源的分子以及具有无机组分的有机分子)。一般这种有机分子具有至少1000的分子量，更常具有约1000-2000的分子量。通常所述目标分子是生物学上重要的蛋白质、多肽、肽、氨基酸、核酸、脂质体或治疗剂。目标分子的例子(用于说明而非限定)包括血浆蛋白质诸如血纤蛋白原、免疫球蛋白或其片断、激素诸如胰岛素、细胞因子诸如肿瘤坏死因子和酶诸如组织纤溶酶原激活物。所述目标分子可衍生自天然或重组来源或可以是合成物诸如荧光团、金属螯合剂或其它报道基团。当所述目标分子是多价时，它可与几个本发明的链相连。为了容许目标分子的进一步增强或修饰，目标分子可在其和所述链之间具有多价连接基。
在本发明的另一实施方案中，用LiAlH4或乙硼烷还原聚酰胺链提供了一种新类型的多胺，它可以具有哌嗪的有用性质(参见例如Ferrari等人，Gene Ther.41100-1106(1997))同时也可对结构(线性、长度、疏水性、电荷间距)进行总的控制。
一般，本发明方法是三步固相法，涉及商业可得的二胺(或衍生物)，如下式(I)所示的短二胺单体NH2-Y-NH2和商业可得的此中称为“二酸衍生物”的可酰化的活化形式(诸如环酐)的二酸，如下面的式(II)所示的短二酸单体HOOC-X-COOH。
所述X和Y取代基独立地选自无反应性官能基的二价有机基团或不存在。X和Y可相同或不同。适用的二价有机基团是非反应性基团诸如取代或未取代、分支或线性、脂族或芳族基团诸如苯基或C1-C10亚烷基部分、C1-C10烷基基团或其组合，并可任选含有一个或多个杂原子。示例性的二价有机基团包括(用于说明而非限定)烷基基团诸如-(CH2)2-和-(CH2)6-；含杂原子的烷基基团诸如-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3-]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-等。
此中所用的术语“反应性官能基”是指(用于说明而非限定)任何游离氨基、羧基、硫羟、烷基卤、羟基或醛基。重要的是所述短单体原料没有任何干扰后文详细描述的本发明的酰化、活化和氨解步骤的官能度。但是，如果反应性官能基受保护而达到非反应性，那么这种反应性官能基可存在于X或Y上，例如可存在受保护的氨基。例如，X和Y取代基可含有受叔丁氧基羰基(Boc)保护的氨基。但是，应注意的是9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)并不十分适合作为在X或Y中氨基的保护基，因为它不耐受氨解条件。
优选式(I)和(II)的单体为对称的，所以也优选X和Y取代基为对称的，否则端基(氨基或羧基)会不同，从而导致非均一性。例如琥珀酸(以其酸酐形式，其中X取代基为基团-CH2CH2-)是对称的，在酰化中只会形成一种酰胺产物HOOCCH2CH2CO-NH-，因此是一种适合的二酸。甲基琥珀酸酐能形成两种产物HOOCCH(Me)CH2CO-NH-和HOOCCH2CH(Me)CO-NH-，因此是不那么适合的酸。
优选所述式(I)或(II)的短单体为水溶性聚合物基单体，从而使X、Y或两者取代基为含约1到5个聚合物基团的精确长度的二价有机基团。在一个优选实施方案中，X或Y或两者为含约1到5个PEG(-CH2CH2O-)基团的二价有机基团。对称可通过审慎地选择例如在-CH2CH2CH2(OCH2CH2)pCH2-中的末端基团来保持，其中对于给定的式(I)或(II)的化合物来说p为1到5的整数但取一独立的值。许多其它基团适合用于本发明中代替PEG基团。它们包括(用于说明而非限定)亚甲基、丙二醇和其低聚物(即(-CH2CH2CH2O-)p)、-CH2CH2O-和-CH2CH2CH2O-基团的限定共聚物、四氢呋喃的限定低聚物和乙烯基吡咯烷酮的限定低聚物。
最有用的一种精确长度的短PEG基对称二胺是4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(Fluka Chemicals，Buchs，Switzerland)NH2-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH24，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺是式(I)的二胺单体，式中Y包含三个聚乙二醇基团(-OCH2CH2-)并且具有对称式-(CH2CH2CH2-O-CH2CH2)-O-(CH2CH2-O-CH2CH2CH2)-。
这种物质的一个合乎需要的特性是其如上所示的那样提供有三个PEG基团并且基本上免除了具有一、二、四或甚至五个PEG基团的同系化合物。这可作为当单体单元被说成“精确长度”时所需情况的例子。由这种物质制备的聚酰胺也是精确长度的，只要其以非连续步骤制备并且并非通过不受控制的与二酸的聚合而不象常规方法那样进行。其被称为PEG-基链或连接基，甚至PEG单元(-OCH2CH2-)处处被酰胺键或其它基团间断。
类似于4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺但具有一个、两个、四个或甚至五个PEG基团的单体单元也可易于通过本领域人员已知的方法合成。这种单体基本上消除了具有不同数目PEG基团的均匀化合物。
也可用于本发明中的精确长度的一种非PEG基二胺是下式的4，9-二氧杂-1，12-十二烷二胺NH2-(CH2)3-O(CH2)4-O-(CH2)3-NH2其由Johnson等人描述于Bioconjugate Chemistry 8447-452(1997)。这里，Y具有对称式-[(CH2)3-O-(CH2)2]-[(CH2)2-O-(CH2)3]-。
该文章例举了二酸组分的活性形式诸如HOOC-CH2OCH2-COOH和HOOC-CH2N(CH3)CH2-COOH的酸酐。
可用于本发明方法中的另一种非PEG基二胺是1，6-二氨基己烷，NH2-(CH2)6-NH2(“DAH”)。此外，有许多商业可得的二酸和二胺，其广泛详细地描述于通过引用并入本文的上述Hai等人的文章中。正如下面将描述的，可以通过选择每一步适合的二酸和二胺能够调节因子诸如沿所述链长方向的疏水性(这里使用二胺如1，6-二氨基己烷说明)、向链末端加入反应性基团如成肟基团和通过肽合成标准技术延长链。
优选的式(II)的二酸包括(用于说明而非限定)HOOC-CH2CH2-COOH。
通常，本发明方法是三步固相方法，涉及式(I)的二胺和二酸的衍生物，所述二酸具有式(II)，这里显示的为含氨基树脂(NH2-树脂)的情况。这种方法并不需要使用保护基。步骤1是一酰化步骤，它使用一种二酸的衍生物
步骤2是一活化步骤，其使用例如羰基二咪唑
最终，步骤3是一氨解步骤，其使用一种二胺
在本发明的优选方法中，存在X和Y的至少一个，并更优选两个都存在。但是，本发明并不打算使用X、Y或两者都不存在的式(I)和(II)的化合物。一种特殊情况是-CO-代替-CO-X-CO-的二酸碳酸的情况，重复单元变成-NH-Y-NH-CO-，然后产物应更准确地称为聚脲，其为一种类型的聚酰胺。在这种特殊的情况下，使用为二活性碳酸简便(convenient)形式的羰基二咪唑将酰化步骤和活化步骤合并成一个步骤
所述咪唑基-CO-NH-树脂然后可直接使用一种二胺进行氨解
如上所示，式(I)和(II)的单体单元被用于构建精确长度(即具有精确数目的重复单体单元-NH-Y-NH-CO-X-CO-)的链。在本发明的一个方面，每轮这种合成使用相同的式(I)的二胺NH2-Y-NH2和相同的式(II)的二酸HOOC-X-COOH。因此，在本发明的一个方面，式(I)和(II)的单体单元被用于构建具有精确数目的重复单元的水溶性有机聚酰胺基链，所述链具有式(III)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)n-(NH-Y’-NH)n’-，其中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或不存在并且可相同或不同，并且对于各所述重复单元而言可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或不存在。
需要着重指出的是如果需要，则X取代基、Y取代基或两者可在合成的每个步骤中各不相同，并且无需到处一样。在所述连接基的合成中，X和/或Y不同具有几个原因，最重要的一个原因是调节沿连接基长度方向的疏水性的能力，包括使连接基的一部分如一端比其它部分更亲水或疏水。这易于通过在链合成的其后循环过程中使用一个或多个不同的式(I)的二胺NH2-Y-NH2和/或一个或多个不同的式(II)的二酸HOOC-X-COOH来达到，即在每个酰化和氨解步骤中可独立地选择X和Y取代基。
在另一个优选的实施方案中，X和Y取代基中至少一个包含约1到5个-CH2CH2O-基团。这通过将式(I)或(II)或两者作为PEG基单体来达到。这样X可具有式-a-(CH2CH2O)p-b-和/或Y可具有式-a’-(CH2CH2O)p’-b’-，其中a、a’、b和b’为无反应性官能基的二价有机基团或不存在并且可相同或不同。优选a、a’、b和b’取代基从而如上所述保持单体单元的对称。整数p和p’为约1到5，但可为0。一种优选的本发明的聚酰胺基连接基具有下式(III)的一种变体-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-这里a、a’、b、b’、p和p’和上面的定义相同。或者，如果所述聚酰胺基连接基被用于非药用目的，那么p和p’可以为0。需要着重指出的是对于所述连接基每个合成步骤中的二酸组分和二胺组分而言，a、a’、b、b’、p和p’均独立地变化，正如上述式(III)的情况。这样式-a-(CH2CH2O)p-b-的X和式-a’-(CH2CH2O)p’-b’-的Y在沿本发明的连接基的长度方向可显示出多种组合。导入这种变化的一个原因是使得沿连接基长度方向的疏水性和亲水性变化，另一个原因可能是例如用为-CH2N(CH3)CH2-的X导入带电基团。
下面精确长度链说明本发明，并不以任何方式构成对本发明的限定。一个特别优选的本发明的链是式(III)的PEG基链，式中Y为-a’-(CH2CH2O)p’-b’-，其a’为-CH2-、b’为-(CH2)3-，并且p’为3，n’为0并且X为-(CH2)2--{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-其也可写成-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}3-该链也可称为-(‘PEG’-succ)n-链，其中‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。这种链的例子包括-(‘PEG’-succ)3-和-(‘PEG’-succ)8-。
所述-(‘PEG’-succ)n-链也是那些在每个重复单体单元中X和Y取代基保持相同的本发明的链的示例。其它这种链包括例如-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-诸如(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-和-(‘DAH’-succ)n-，其中‘DAH’代表式-NH-(CH2)6-NH-。
在重复单体单元中X和Y取代基不同的本发明的链的例子包括例如-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)n-和-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)z-‘DAH’-succ-‘PEG’-，其中z为1-49的整数。尽管在这些实例中使用的有两个Y取代基，但是应理解可在本发明的链中使用两个以上的不同Y取代基。此外，在这些实例中X保持相同；但是应理解X也可正如所述Y取代基一样变化。
式(III)的聚酰胺链可容易地作为一个中心重复单元-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-并入到水溶性有机聚酰胺基成分或物质即“产物”中。因此，在本发明的一个实施方案中，单个V或U取代基(如下定义)可通过连接一个或多个本发明的链修饰或增强。这种具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰胺基组成具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V这里n为1-100的整数；n’为0或1；q为1-10的整数；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或不存在并可相同或不同，并可随每个所述重复单元独立地变化；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或不存在；V选自其性能有待修饰或增强并且具有一任选的二价间隔基或连接基的一价或多价目标分子；具有多价连接基的报道基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-载体，这里Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或可不存在，Q为连接基或目标分子，并且所述载体是一固相、基体或表面；U选自其性能有待修饰或增强并且具有一任选的二价间隔基或连接基的目标分子；端基；肽链、保护基团、载体、和反应基团；正如上面所述，X和Y取代基可在所述链的合成中改变。
在其最简单的形式即q为1的情况下，式(IV)的组成包括通过本发明的链连接的U和V基团U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-V。
应理解本发明描述了链及其合成方法，而基团U和V只以实例的形式描述，其并不构成对本发明的限定。V可为一价或多价目标分子，其性能有待修饰或增强并且具有一任选的二价间隔基或连接基诸如肟连接基。V也可以是报道基团诸如具有多价连接基的荧光团或金属螯合剂。此中所用的术语“多价”意欲指大于一的价位，并包括术语“二价”。
V还可以是一个诸如为本领域人们熟悉的反应基，例如适合于聚合物的交联或生物分子的缀合的反应基。其例子包括(用于说明而非限定)溴乙酰基、氨酰基诸如酪氨酰基或丝氨酰基、氨基氧基乙酰基、乙醛酰基、巯基乙酰基、巯基丙酰基。此外，Bioconjugate Techniques，Hermanson，G.T.，Academic Press，San Diego，1996中描述了许多可用于生物分子缀合的基团。
V也可以是具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、-H和-Z-Q载体，这里Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或可不存在，Q为连接基或目标分子，并且所述载体是一固相、基体或表面诸如(用于说明而非限定)天然树脂和合成树脂；细胞和膜；硅集成电路片；传感器集成电路片；金、玻璃、塑料和其它生物传感器表面；和组织培养平板。
适合的作为“Q”取代基或连接到目标分子的间隔基/连接基的二价有机基团的例子包括(用于说明而非限定)Sasrin连接基-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-、-C(O)O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-、氨基氧乙酰基(NH2OCH2CO-)连接基、-COCH2ON＝CH-CO、-CH＝NOCH2CO-等。
正如上面所指出的，Q取代基可以为目标分子。一般，当目标分子为使用为人们熟知的固相技术合成的肽并且构成用于所述连接基合成的Z-Q载体试剂的一部分时可以是这种情况。端基可含有通过与目标分子结合的反应基(诸如烷基硫醇)。这种反应基受到保护(或通过构建PEG基连接基后的正交保护/去保护策略连接)。正交保护策略为本领域人员所熟悉。参见Methods in Enzymology第289卷。在一优选的实施方案中，V为其性质有待通过本发明的连接基修饰或增强的一价或多价目标分子，例如大分子或固相或基体。
U选自其性质有待修饰或增强并具有任选的二价间隔基或连接基诸如肟连接基的目标分子；选自H-、HC(O)CO-、NH2OCH2CO-和脂族酰基的端基；肽链，包括单肽链或多肽链；保护基诸如Boc或Fmoc；载体诸如一固相或基体；和如上所述的反应基。
在一优选的实施方案中，至少一个U或V是其性质有待通过与精确长度的聚酰胺基连接基连接来修饰或增强的目标分子。这种如上定义的“目标分子”是有机分子，优选为生物学上重要的蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质体或治疗剂。在另一优选的实施方案中，至少一个U或V是为少于50个氨基酸残基的肽并且具有一任选的二价间隔基或连接基的目标分子。
下面的组成用于本发明的说明，但并不以任何方式构成对本发明的限定。示例性的式(IV)的组成包括
H-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-H，其U和V为氢端基并且n为例如7；H-Ser-(“PEG’-succ)n-‘PEG’-Ser-H，其U和V为氨基酸并且n为例如16；(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中U和V为具有肟连接基的肽，例如具有-COCH2ON＝CH-CO-连接基的红细胞生成素模拟肽(“EMP”)，诸如酰胺-GRLPQCVWTMPGNHCAYLGG--COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-C(O)CH＝NOCH2CO--GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO1)，并且n为例如12或16；H-(‘PEG’-succ)n-Leu-PAM树脂，式中U为H，并且V为-Z-Q载体，这里Z不存在，Q为一氨基酸残基(Leu)，载体为PAM树脂；H-Tyr-(‘PEG’-succ)n3-Leu-OH，式中U为氨基酰基基团(Tyr-)，V为一个氨基酸残基(Leu)，n为例如3；肽-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)n)-NH2，式中U为氨基氧乙酰基基团(NH2OCH2CO-)，V为具有一连接基-Lys酰胺的目标肽分子，例如H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Iyr-Glu-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2(SEQ ID NO4或SEQ ID NO3加上作为部分连接基的赖氨酸)，n为例如8；H-Ser-(‘PEG’-succ)n-Abu-OH，式中U为氨酰基基团(Ser-)，V为目标分子氨基丁酸，n为例如8；H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)n-‘DAH’-succ-‘PEG’-H，其中U和V均为氢端基，n为例如3；肽-(‘PEG’-succ)n-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO6)，式中AoA为氨基氧乙酰基，并且n为例如8。目标肽分子可以为例如-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；和正如上面所述，本发明的链可用于修饰各种目标肽，特别是少于50个氨基酸残基并具有适合的端基如(用于说明而非限定)-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽，从而提供均匀组成。
本发明组成也可利用几个链来形成分支结构。例如一种示例性组成是式(IV)的支化组成，其中U为氨基酰基(Ser-)，V为多价目标分子Lys2Lys-NHCH2CH2SH。赖氨酸“树”首先被合成，其具有四个游离氨基。四次循环产生四个式H-Ser-(‘PEG’-succ)4-的连接基，每个连接基连接到四个游离氨基中的一个上(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH。
分支组成的另一例子是式(IV)的均匀分支组成(其U为具有肟连接基的肽，V为一种氨基酸(Lys))(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-Lys((肽)-肟-(‘PEG’-succ)n)酰胺，这里一种示例性的肽为-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)并且n为例如2。
分支组成的再一个例子为式[肽-(‘PEG’-succ)n-Lys(肟)酰胺]qLys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-报道基团的均匀分支组成，式中U为目标肽，V为具有多价连接基-Lys(AoA)酰胺-Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-的报道基团，例如[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-荧光素，其中存在四个目标肽分子的拷贝，例如-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)。
式(III)的聚酰胺精确长度链(其中n’为0)易于通过涉及酰化步骤、活化步骤和氨解步骤的如方案I-A所示的三步合成法容易地合成。固相合成的标准技术(Fieds，ed.，Solid phase peptide synthesis，Meth.Enzymol.289)可与适当编程的ABI 430A仪器或自制的设备一起使用。所述反应也可相当容易地手工完成，尽管比较费时费事。在所述二酸碳酸的特定情况下，酰化和活化步骤如上所述的那样一起进行。
在本发明的一个实施方案中，具有精确数目重复单元并具有式(III)的水溶性有机聚酰胺基链(其中n’为1)
-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-(式中n为1-100的整数；X和Y为无反应官能基的二价有机基团或不存在并且相同或不同，并且对于各所述重复单元可各不相同；Y’为无反应官能基的二价有机基团或不存在)通过包括下面的步骤的方法合成(a)用摩尔过量的试剂L-CO-L’(这里L和L’为离去基团并且可相同或不同)酰化式Z-Q-载体化合物(这里Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；载体为固相、基体或表面)的氨基或羟基；(b)用摩尔过量的具有式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步骤(a)的产物；(c)用摩尔过量的具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化步骤(b)的产物；(d)活化步骤(c)的产物的游离羧基；(e)用摩尔过量的具有式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(d)的产物；和(f)任选使用具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物和具有式NH2-Y-NH2的二胺重复步骤(c)-(e)，其中所述X和Y取代基可与用于任何所述前面氨解和酰化步骤的X和Y取代基相同或不同。
该方法包括裂解例如在一试剂盒中用一适合载体包装的与所述载体结合的连接基以便随后连接到目标分子上。但是，所述方法也包括Q为含可裂解部分的连接基或通过含可裂解部分的连接基结合到载体上的目标分子，并且所述方法还包括裂解可裂解部分而从载体释放精确长度的水溶性有机聚酰胺基链的步骤。
此中所用术语“可裂解部分”是指能被选择性裂解而从固相释放聚酰胺基连接基或目标分子的部分。可裂解部分必须能在适于本发明的酰化、活化和氨解步骤的条件下抗裂解。这种可裂解部分为本领域技术人员所熟悉。
任选的重复步骤可利用X和Y取代基没有变化的二酸和二胺，从而产生相同重复单元的链诸如…-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-…。但是，分别使用其Y或X取代基与前面氨解或酰化步骤所用不同的至少一种二酸或至少一种二胺将提供重复单元不同的链，诸如
…-{NH-Y1-NH-CO-X1-CO}-{NH-Y1-NH-CO-X2-CO}--{NH-Y2-NH-CO-X2-CO}-{NH-Y2-NH-CO-X3-CO}-…本发明的一种优选方法如下面的方案I-A所示。
方案I-A酰化步骤使用适合于固相肽合成的树脂，例如Z-Q-载体，这里Z为NH2-或HO-并且Q和上面Q的定义相同，但一般是一个二价有机基团。活化形式的式(II)的二酸衍生物HOOC-X-COOH被用于酰化连接到所述载体上的氨基(或羟基)。其中X为-CH2CH2-的式(II)二酸琥珀酸HOOC-CH2-CH2-COOH的环酐特别适用于所述的酰化步骤。在使用环酐的情况下或在本发明的一种典型的酰化步骤中，树脂首先在一适合的溶剂中溶胀，然后通过在室温下涡动混合用过量活化形式的二酸(其溶解于适合的溶剂中)酰化。按照本领域技术人员熟知的肽合成技术(Methods inEnzymology 289卷)，通常加入一种碱诸如N，N-二-异丙基乙胺(“DIEA”)或4-二甲基氨基吡啶(“DMAP”)和添加剂诸如N-羟基苯并三唑(“HOBT”)帮助酰化。当酰化羟基树脂(例如来自瑞士Bachem的Sasrin树脂)时，优选存在DMAP并且酰化重复第二次而使酰化完全。当酰化氨基树脂(NH2-Q-载体)时，建议在进行活化步骤前进行Kaiser试验(Kaiser等人，Analyt.Biochem.84595(1970)或Methods in Enzymology289卷54页)来证实酰化完成。使用过量酰化试剂以便促使反应完全，否则会与固相肽合成的情况那样会使缺乏大量重复单元的链在几次循环后积累。
例如，将氨基树脂如Boc-Leu-Pam树脂(0.5g，约0.3mmol)在二甲基甲酰胺(“DMF”)中溶胀、去保护而形成H-Leu-Pam树脂。然后通过在室温下涡动混合10到30分钟用4毫摩尔琥珀酸酐(“SA”)酰化树脂。将SA溶解于8毫升DMF(Burdick and Jackson高纯级)中，其为0.5M的HOBT溶液，并往其中加入400微升DIEA。排出并用DMF洗涤树脂后，进行Kaiser茚三酮试验以检验酰化是否完成。如果没有完成，则重复酰化步骤。
如果使用裸树脂(例如Sasrin，Bachem)，则可使用O.5M DMAP代替HOBT，偶联时间约为30分钟(使用氨基树脂时为10分钟)并将偶联步骤重复一次。
活化步骤活化步骤涉及游离羧基的活化，即没有连接到链上的羧基的活化。当在酰化步骤中使用环酐时这种活化步骤是必需的，因为没有连接到链上的羧基是游离羧基(在方案II讨论的酰化步骤中使用双活化二酸的情况下)。活化的结果是往游离羧基上连接一个离去基团或用于这种活化步骤的试剂是本领域人员所熟悉的(Methods inEnzymology 289卷并在此中作为参考)将一个离去基团“L”连接到游离羧基上的试剂。优选使用过量的活化剂来使基本上所有羧基都被活化并因此避免缺乏大量重复单元的链的累积。适合的试剂是那些可过量使用而没有副反应的试剂，其包括碳酰二咪唑(“CDI”，其产生混合的酐咪唑基-CO-O-CO-X-等或酰基咪唑咪唑基-CO-X-等)和二琥珀酰亚胺基碳酸酯(其产生羟基琥珀酰亚胺酯)。也可成功地使用活化剂诸如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓(uronium)六氟磷酸盐(“HATU”)并且只以比游离羧基稍为过量的量使用。
在本发明的一典型活化步骤中，在排出并用适合的溶剂洗涤树脂后，用活化剂诸如CDI活化游离羧基，但因为CDI对湿度敏感所以要小心适当地存贮CDI。例如，在排出并用DMF洗涤树脂后，在涡动混合下用8毫摩尔CDI(Fluka)在8毫升DMF中的溶液活化游离羧基30分钟。
事实上用CDI的活化可看成为两步过程，首先羧酸用CDI活化羧酸形成咪唑基酸酐(这里“im”是咪唑基)
然后这种酸酐可与替代的咪唑分子反应而形成im-CO-X-CO-NH-Q-载体其在氨解步骤中通过氨解产生NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-载体或者所述酸酐可经直接氨解产生同样的产物NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-Q-载体两种途径均形成所需的产物。参见Aslam等人，Bioconjugation，387页(Macmillan Reference，1998)。
氨解步骤所述氨解步骤涉及均匀长度的式(I)的二胺NH2-Y-NH2或在本发明的一典型氨解步骤中，在排出并用适合的溶剂洗涤后，用大过量的式(I)的二胺氨解树脂结合的物质。在充分洗涤后，Kaiser茚三酮试验显示了特征蓝色，氨基树脂可进行下一轮的酰化/活化/氨解循环处理。
一种二胺即4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺特别良好地适用于所述氨解步骤。
例如，在简短地排出并用DMF洗涤后，在涡动混合下用PEG基二胺(例如4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，Fluka，4ml二胺用4mlDMF(0.5M的HOBT溶液)预混合)氨解树脂结合的咪唑30到60分钟。用DMF充分清洗后，Kaiser试验显示出特征蓝色，所述氨基树脂可进行下一轮的酰化/活化/氨解循环，即洗涤后，氨基可再用SA酰化来伸长所述链等。需要着重指出的是一些疏水二胺如1，6-二氨基己烷可能需要在所有三个步骤(酰化、活化和氨解)中使用N-甲基吡咯烷酮代替DMF。
所述酰化、活化和氨解步骤因此可再重复一次以便加入第二个-NH-Y-NH-CO-X-CO-单元，形成(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-NH-Q-载体或(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-(NH-Y-NH-CO-X-CO)-O-Q-载体等。一次酰化、活化和氨解步骤的循环得到(NH2-Y-NH-CO-X-CO)-Z-Q-载体。几个重复的酰化、活化和氨解步骤的循环产生式(III)的链-(NH-Y-NH-CO-X-CO)n-(这里n’为0)，或式(IV)的产物[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n]q-V，这里例如U为H并且V为-Z-Q-载体，n’为0并且n为重复循环的次数。例如，当使用琥珀酸酐和4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺进行两次的酰化、活化和氨解循环时，所述合成提供了一种如下的示例性的PEG基连接基-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)2-或产物U-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)2-V这里U为H并且V为-Z-O-载体。
在本发明的另一实施方案中，具有精确数目重复单元并具有式(III)的水溶性有机聚酰胺基链(其n’为1)-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-(式中n为1-100的整数；X和Y为无反应官能基的二价有机基团或不存在并且相同或不同，并且各所述重复单元可各不相同)通过包括下面步骤的方法合成(a)用摩尔过量的具有式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化式Z-Q-载体化合物(这里Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；载体为固相、基体或表面)的氨基或羟基；(b)活化步骤(a)的产物的游离羧基；(c)用摩尔过量的具有式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(b)的产物；和(d)任选使用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中所述X和Y取代基可与用于所述任何前面酰化和氨解步骤的X和Y取代基相同或不同。
如上所述，该方法也包括裂解连接在载体上的连接基或通过作为连接基Q存在的可裂解部分或在将目标分子连接到载体上的连接基中的可裂解部分将连接基从载体裂解。另外，这种方法也考虑在合成步骤中使用相同或不同的X和Y取代基。
本发明的另一种优选方法如下面的方案I-B所示，其为方案I-A的变体，其中省略了第一循环中的酰化步骤，但后面的循环中则包括酰化步骤。这样，方案I-B包括一个活化步骤和一个氨解步骤，接着一个或多个酰化/活化/氨解步骤的循环。所用的反应和试剂与方案I-A中描述的相同。
方案I-B活化步骤使用一种适合于固相肽合成的树脂，优选具有适合的酸-可裂解羟基连接基的树脂如Sasrin树脂(HO-CH2-(C6H3(OCH3))-O-CH2-树脂)或具有氨基的树脂。首先，将树脂在一适合的溶剂中溶胀。然后，在本发明的一典型的首先活化的步骤中，活化式Z-Q-载体树脂的羟基(或氨基)。用试剂诸如CDI的活化是用仍具有离去基团的基团酰化羟基(或氨基)(HO-变成im-CO-O-，NH2-变成im-CO-NH-)式中L为离去基团。
排出和洗涤后，可重复所述活化步骤。
氨解步骤氨解步骤如上所述，其中将均一长度的式(I)的二胺NH2-Y’-NH2加入到经活化的树脂中。例如，在简短地排出和洗涤后，如上所述将树脂结合的物质用PEG-基二胺氨解而得到H-HN-Y’-NH-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-载体酰化/活化/氨解步骤一个酰化/活化/氨解循环将产生H-[HN-Y-NH-CO-X-CO]-HN-Y-NH-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-载体等，重复所示三个步骤酰化/活化/氨解的循环直到连接基达到所需的长度。这产生式(III)的连接基-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-(式中n’为1)和式(IV)的产物[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V(式中U为H，V为-Z-Q-载体)。
在羟基树脂的情况下，通过末端氨基甲酸的脱羧从树脂裂解将形成式(IV)的产物(其中U和V为H)H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-H在氨基树脂的情况下，从树脂裂解将形成式(IV)的产物(其中U为H并且V为CONH2)H-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-CONH2V也可认为是H，其通过二价连接基-CONH-连接。
方案I-A和I-B所述的酰化/活化/氨解循环可使用相同或不同的二酸和二胺重复多次。因为低聚是定量进行的，一次一步，所以有机会在任何阶段改变二胺和二酸组分(例如使用其中X为-(CH2)4-的二酸代替X为-(CH2)2的二酸)并由此控制疏水性和长度。
一旦所需次数的循环达到了所需的连接基长度，可使用固相合成的标准技术使链延长(例如用肽)。
可编程肽自动合成器来进行所述各步骤。一旦组装了所需的链，可在端氨基上合成肽。因为在所述链的构建中没有使用保护基，可在以标准方法(Fields，上述)从树脂裂解前使用标准Boc(叔丁氧羰基)或Fmoc(芴甲氧基羰基)技术进行这种链延长。或者，可在从树脂裂解前或后，通过标准技术(Rose，J.Am.Chem.Soc.11620(1994))将端基用氨基氧乙酰基或醛前体修饰。所述PEG基链包含醚键和酰胺键，两者均可适于常规的肽去保护和裂解技术，包括液态氟化氢(“HF”)。
通过肽化学标准技术从树脂裂解和纯化后的产物具有式(IV)[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V并且包含具有精确数目式(III)重复单元的水溶性有机聚酰胺基链-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-应该指出的是本发明循环中的酰化和活化步骤类似于常规的固相肽合成循环的酰化步骤并不干扰常规的可能在所述连接基或产物中的取代基上存在的通常的保护基，无论所述保护基是Boc-、Fmoc-、丁基-或苄基基的基团。但是，氨解步骤涉及过量的伯胺，因此会影响氨基的Fmoc保护和色氨酸的甲酰基保护，所以在计划合成时应考虑这个情况。
本发明的另一合成反应涉及两个步骤酰化和氨解。通过在酰化步骤中使用过量双活化的二酸，无需在氨解步骤前活化游离酸基，正如方案II所示。
方案II酰化步骤在使用双活化二酸(诸如酰氯或活性酯，由“L”表示，其中L为离去基团)酰化连接到适用于固相肽合成的树脂上的氨基(NH2-Q-载体或HO-Q-载体)情况下或重要的是使用相对于存在的氨基过量的酰化剂以避免有利于“桥连”副反应，依此同一二价酸衍生物酰化两个氨基。这种桥连物质不能参与氨解和链延长并带来收率的损失以及出现必须在从载体裂解产物后除去的杂质。
一种特殊的情况是当所述二酸为碳酸的情况。碳酰二咪唑是这种二酸的适合的双活化形式。它的使用分别产生了咪唑基-CO-NH-Q-载体和咪唑基-CO-O-Q-载体。
氨解步骤所述氨解步骤涉及加入均一长度的式(I)的二胺NH2-Y-NH2
然后如上面方案I中所述将酰化和氨解步骤重复几次。
重要的是在每个方案I和II的反应步骤中使用足量的反应剂溶液来使树脂形成淤浆。因为随着循环次数的增加树脂极大地溶胀，优选使用类似于上面方案中所述的绝对浓度并依此调节体积。此外，当以约0.3毫摩尔的树脂开始时，对于合成较长的链来说优选使用8毫升以上的溶液。溶胀度取决于所用载体或树脂的类型(组成、交联度等)，还取决于取代(即多少mmol/g)以及长度。因此，液体(溶液)量不足可能导致达不到定量偶合。尽管酰化步骤易于通过Kaiser试验监测，但活化步骤则较难跟踪。当一次循环中活化步骤不完全时，在随后的循环中活化仍旧进行，而导致缺失，即产物可能缺失一个重复单元-(CO-X-CO-NH-Y-NH)-。过量反应剂的使用能消除这个问题。术语“过量”是指二酸(或衍生物)、活化剂和二胺试剂的摩尔过量对于二酸、活化剂和二胺来说分别优选约3-20倍、10-40倍和20-200倍的摩尔过量；更优选约4-15、15-30和40-180倍的摩尔过量；最优选约5-14、20-28和50-150倍的摩尔过量。
有许多树脂适用于固相肽合成并因此也良好地适用于本发明的合成方案。这些树脂可从商业渠道获得或通过标准技术合成，其包括例如叔丁氧羰基-Leu-O-CH2-苯基(乙酰胺基)树脂(“Boc-Leu-PAM”树脂，Bachem，Bubendorf，瑞士)、9-芴甲氧基羰基-半胱胺-Sasrin树脂(“Fmoc”-半胱胺-Sasrin树脂，Bachem)、Fmoc-氨基丁酸-Sasrin树脂(Bachem)、Fmoc-Lys(4-甲基三苯甲基)-甲基二苯甲基胺树脂(“Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA”树脂)等。上述的任何树脂均可氨基去保护并用于采用二酸衍生物的酰化。
类似地，诸如Sasrin(Bachem)、Wang或PAM的羟基树脂可直接用二酸衍生物酰化。或者，诸如Sasrin(Bachem)、Wang或PAM的羟基树脂可通过CDI活化而形成im-CO-O-CH2-连接基-树脂，注意在Sasrin的情况下，其形成im-CO-O-CH2-(C6H3(OCH3))-O-CH2-树脂。参见Bethel等人，J.Biol.Chem.2542572-2574(1979)。这种活化的羟基树脂可用二胺氨解形成上面Bethel等人所述的NH2-Y-NH-CO-O-Q-树脂。
在正交保护的二氨基树脂诸如Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA-树脂的情况下，在酰化前一般只有一个氨解去保护。否则，二酸衍生物诸如SA可直接与树脂诸如Sasrin偶联而形成具有可用于活化的游离羧基的树脂。氨基去保护后的树脂可通过式NH2-Q-载体说明，式中Q为二价有机基团，例如-CH(R’)-CO-(式中R’为氨基酸侧链，正如在去保护Boc-Leu-的情况下)、-CH2-CH2S-(在去保护Fmoc-半胱胺的情况下)、-CH2-CH2-CH2CO-(在去保护的Fmoc-氨基丁酸的情况下)、-CH(CH2-CH2-CH2-CH2NH-Mtt)CO-(在Fmoc-去保护的Fmoc-Lys(Mtt)的情况下)，或者可代表侧链保护的多肽，在这种情况下NH2-Q-载体的NH2基团被认为是指先前在载体上合成的多肽的游离氨基。NH2-Q-载体也可用于代表MBHA树脂。当树脂由HO-Q-载体表示时，Q为设计用来在从树脂裂解上述链时，从酰化(酯连接)链释出端羧基的连接基团。这种基团为人们所熟悉(Methods in Enzymology 289卷)并被结合到可从Bachem和其它供应商购置的PAM树脂和Sasrin树脂中。然后使用适合于具体所用树脂的标准技术从树脂裂解出产物。载体可以是例如工业PAM、Sasrin或MBHA树脂的聚苯乙烯树脂，或用于固相肽合成和在Methods in Enzymology 289卷提及的其它类似载体。但是，也考虑载体的其它物质和结构。
在本发明的另一实施方案中，发现一旦活化树脂用二胺氨解形成NH2-Y-NH-CO-X-CO-O-Q-载体，就可用二酸衍生物酰化游离氨基并且聚酰胺延长过程可进行许多次循环而得到良好收率的所需产物。这与某些副反应如两个活化基团通过二胺的桥连会很快使技术上不可行的情况不同。在通过标准技术从树脂裂解后，聚酰胺释放出端氨基，可供官能化(例如产生对称分子)。
如上所述，本发明的聚酰胺基链可用于修饰目标分子或物质如表面。这些链可与大分子的残基如多肽的氨基酸残基偶联而不会剧烈改变残基上存在的电荷或没有就地导入可能干扰大分子结合性能的基团，这些链通过在各种条件下(特别是在生理学相关的条件下)稳定的键连接。特别适用于将本发明的PEG基链与多肽和蛋白质相连的途径包括如通过引用并入本文的Rose等人的欧洲专利0243929中所述的那样通过在多肽链的氨基端和羧基端的腙和肟化学连接。
按照本发明的一个优选实施方案，蛋白质和其它有机目标分子可通过缀合本发明的精确长度水溶性有机聚合物基链如此中所述的PEG基链来化学修饰。由于通过水溶性聚合物的连接赋予了所需的性能，这种蛋白质缀合物的生产是有意义的。这些所需的性能包括增大的在水溶液中的溶解度、提高的存贮稳定性、降低的免疫原性、增加的对酶降解的抗性、增宽的各种给药系统的相容性和增加的体内半衰期。当所述多肽被用作注入体内的治疗剂或当所述多肽被用于非医学用途诸如用于检测和/或定量目标化合物的测定(通常是免疫测定)时，用PEG或其它水溶性聚合物进行的多肽的修饰带来的这些性能特别有意义。
“修饰的”目标分子或物质是通过缀合一个或多个本发明的聚酰胺基链来修饰的分子或物质。本发明的“均匀”修饰的组成是指基本上所有修饰目标分子或物质具有基本相同的聚酰胺基链，即不存在连接的聚合物分子量范围的化学组成。例如，本发明的PEG基链可具有以式(III)的X、Y或两种取代基形式存在的-(CH2CH2O)p-基团，产生下式-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-，或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-一个这种示例性链具有下面的PEG基式-(NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO)n-在均匀组成中存在的PEG基链均具有相同的p或p’整数值并且所述组成会基本上不包括具有不同p或p’值的同系PEG基链。需要着重理解其参照是在给定单体单元诸如-{NH-Y-NH-CO-a-(CH2CH2O)p-b-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-或-{NH-a’-(CH2CH2O)p’-b’-NH-CO-X-CO}-内的一个常数p或p’。也可能在不同的循环选择具有不同p或p’值的单体单元，并且确实也可能在合成的每个循环改变a、a’、b、b’、p、p’和X并仍获得均一组成。
本发明的聚酰胺基链通过如肟键的共价缀合连接到目标分子上。“共价缀合”或“缀合”是指通过生物缀合物化学的标准技术(上述的Bioconjugate Techniques)，特别是通过在Rose等人的欧洲专利0243929中所述的N-和C-端标记技术将聚酰胺基链连接到目标分子上。例如，PEG基链可包含能与蛋白质上的醛基反应形成肟键的端氨基氧乙酰基(NH2OCH2CO-)基团，或者它可包含与蛋白质上的氨基氧基(例如通过如Werlen等人在Cancer Research 56809-815(1996)中所述用BrCH2CO-NHCH2CH2NHCOCH2ONH2将硫醇烷基化导入)反应的乙醛酰基(O＝CHCO-)，或者它可包含能烷基化蛋白质上的硫醇的溴乙酰基。或者，在PEG基链和目标分子之间的缀合可通过在链(例如其中V为-OH并且n’为O)上的端羧基的活化(例如用一种二酰亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺)和在目标分子上的氨基(诸如赖氨酸侧链)的酰化来实施，或者缀合可通过在目标分子上的羧基的活化(例如用水溶性碳化二亚胺)接着通过加入具有游离氨基的PEG基链(例如其中，U为H)来实施。
如果修饰分子被用于抗原的或免疫原性的目的，本领域技术人员都知道所用的任何间隔基不应是强免疫原性的。如果缀合聚合物将被用于结合目的，任何间隔基基团应能增强或至少不影响诸如结合、亲和力、产品稳定性或溶解性的性质。
本发明提供了一种制备用一个或多个精确长度的聚乙二醇基链修饰的蛋白质的方法。更具体地说，描述了用一个或多个精确长度的聚乙二醇基链在温和条件下修饰大分子目标诸如蛋白质、肽、其它有机化合物诸如塑料或含大分子的表面的方法和化合物。
一种优选的缀合方法是以标准化学为基础的，其以下面的方式进行。PEG基链具有在合成时连接的氨基氧基乙酰基(例如通过用活化的Boc-氨基氧基乙酸酰化)、消除保护并且使用固相肽合成的标准技术(Methods in Enzymology 289卷和实施例)将PEG基链从树脂上裂解、纯化和鉴定。目标分子具有末端丝氨酸或苏氨酸残基，其按照Rose，J.Am.Chem.Soc.11630-33(1994)和欧洲专利0243929在温和条件下用高碘酸氧化成乙醛酰基。将氨基氧基组分和醛组分在室温和弱酸性pH(2到5)下以1-10mM的浓度在水溶液中以大致相等的比例混合，通过反相高压液相色谱(HPLC)和电子喷雾离子化质谱(ES-MS)跟踪缀合反应(肟化反应)。反应速度取决于浓度、pH和空间因素，但在通常几小时内处于平衡，而平衡极有利于缀合物(Rose等，Bioconjugate Chemistry 7552-556(1996))。一种组分稍微过量(最高至五倍)迫使缀合反应向完成方向移动。如上对肟的所述，进行产物的分离和鉴定。肽和小蛋白质(如胰岛素)可通过反相HPLC纯化(Rose，J.Am.Chem.Soc.，上述和Rose等人，Bioconjugate Chemistry，上述)，而较大蛋白质(例如抗体和它们的片断)最好通过离子交换色谱纯化或通过凝胶过滤技术纯化，诸如Werlen等人，Cancer Research 56809-815(1996)中所述的对三肟的纯化。
缀合的另一种方法以下面的方式进行。PEG基链在购自Bachem的Sasrin树脂上合成。使用树脂生产商(Bachem)推荐的方法，通过用1％TFA的二氯甲烷溶液重复处理，从树脂上裂解所述链并将所裂解的链的溶液用吡啶甲醇溶液中和。假定为多肽的情况那样，在室温下(没有加热)蒸发掉溶剂并将裂解的链纯化后，将连接到树脂上的羧基活化(例如用HATU)并通过肽化学标准技术偶联到目标分子(或表面)上的亲核基团(如氨基)上。
如果需要，可通过本领域普通技术人员熟悉的各种纯化方法诸如大小排阻色谱法、疏水作用色谱法、离子交换层析、制备性等电聚焦等将修饰的目标分子或物质从反应混合物中纯化出来。大分子纯化、特别是蛋白质纯化的通用方法和原理可参见例如Scopes的“Protein PurificationPrinciples and Practice”，第二版，Springer-Verlag，New York，NY(1987)，其通过引用并入本文。
如上所述，本发明的PEG基连接基具体可用于增强目标分子或物质的性能。例如，已有许多文献报道了在蛋白质上偶联水溶性聚合物、特别是聚乙二醇的优点，包括在生理pH下(此时，天然蛋白质不溶或只部分溶解)，提高修饰蛋白质(与天然蛋白质相比)的溶解性、降低由天然蛋白质产生的免疫应答、增加药物动力学分布、增加贮存期限和增加生物半衰期。更概括地讲，本发明具体在生物学上重要的目标分子如多肽情况下的一项重要优点是大分子可通过连接PEG或水溶性聚合物基连接基修饰但基本不会降低或影响大分子的生物活性。术语“生物活性”包括酶活性、结合受体(包括抗体)的能力、结合配体的能力、诱导免疫应答的能力、产生治疗效果的能力等。
本发明的另一优点是通过本发明的精确长度PEG基链修饰的大分子如多肽基本上是均一化合物，不像通过连接几个不同长度的水溶性聚合物[如含-(CH2CH2O)m-基团的聚合物，其中聚合物间的m值差异很大]制备的化合物。因此，本发明提供了具有缀合水溶性聚合物带来的优点而又减少了修饰带来的均一性的损失的修饰目标。均一性对于生物药物降低批次间差异和便于产品开发、鉴定、结果的表达(均匀化合物而非混合物)和获得管理部门批准是及其重要的。
目标多肽包括单克隆和多克隆抗体；激素；细胞因子，包括集落刺激因子诸如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；干细胞生长因子；淋巴因子；IL-2和IL-3；生长因子，包括PDGF，EGF；肽激素，包括hGH和红细胞生成素；凝血因子，包括因子VIII；免疫原；酶和酶抑制剂；配体；疫苗抗原等。目标多肽可从其天然源、遗传工程细胞分离或通过各种体外合成方法生产。下面专利申请(其通过引用并入本文)报告了各种生物上重要的蛋白质的PEG基修饰美国专利4179337、4609546、4261973、4055635、3960830、4415665、4412989、4002531、4414147、3788948、4732863和4745180；EP 152847、1984年1月11日公开的EP 98110和JP 5792435。未修饰状态的这些蛋白质是如此中所述用于修饰的目标分子。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在此中可互换使用，是指天然存在或重组形式以及其它与天然存在的肽或蛋白质形式足够相同而具有类似生物或化学活性的非天然存在肽或蛋白质形式。
尽管本发明的链可称为“连接基”，本发明也考虑在无需连接另一分子的目标分子上使用这些链。因此，单个目标大分子可连接单个式(III)的链而形成式(IV)的产物(其q为1)U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-V以致U(或V)为目标分子并且V(或U)为端基。在本发明的另一实施方案中，单个目标分子具有几个在各种位置与其连接的式(III)的链。
在以连接基的功能使用本发明的链时，相同或不同的两个目标分子连接于单个式(III)的链，从而在式(IV)的产物中基团U和V相同或不同但均为目标大分子。后一种实施方案可称为具有“哑铃形”结构。
因此，本发明的另一实施方案提供了经本发明的PEG基链修饰的目标分子。此中它们被称为“聚合物缀合物”。如上所讨论，优选目标分子为多肽，更优选为具有生物重要性的多肽。
本发明也考虑通过与不同实施方案的PEG基链的反应，由一个或多个不同的本发明的PEG基链修饰的个别的目标分子。此外，个别目标分子可在目标分子的单个位置上用多个PEG基链修饰。
特别有意义的是使用本发明的PEG基连接基以便修饰用作药物和用于测定的多肽。用于测定的多肽包括特异性结合的蛋白质、由特异性结合的蛋白质识别的多肽和酶。特异性结合的蛋白质是指抗体、激素受体、凝集素等。术语“抗体”意欲包括具有天然免疫球蛋白序列的多克隆和单克隆抗体、合成抗体衍生物等。此外，可将抗体修饰而结合任何不同的标记物、荧光的、放射性的、酶的、生物素/抗生物素蛋白等。合成抗体衍生物包括经突变和选择用于改变结合特异性的天然免疫球蛋白序列、通过遗传修饰细菌产生的各种源于免疫球蛋白基因的多肽(一般为单链)、为了包含修饰的恒定区而修饰的抗体等；这种基于抗体形成的原理的合成的抗体衍生物的一篇综述文章为Winter等人，Nature，349293-299(1991)。一种抗体是球蛋白型的糖蛋白，其应答抗原的给药而在动物体中形成并能与所述抗原特异结合。它们也被称为免疫球蛋白。抗体片断可保留一些选择性结合其抗原或半抗原的能力。与抗原或半抗原结合的能力通过抗原结合试验测定(参见例如AntibodysA Laboratory Manual，Harlow和Lane编，Cold Spring Harbor，New York(1988)，其通过引用并入本文)。这种抗体片断包括(但不限于)Fab、Fab’和(Fab’)2。天然抗体是从动物或从动物或杂交动物(杂交瘤)细胞系分离的抗体。
目标大分子多肽也可以通过原核微生物或已用天然或修饰的多肽-编码DNA序列转化的真核细胞(优选人类起源)生产。目标多肽也可通过噬菌体信息库技术鉴定，然后如实施例那样化学合成。其中氨基酸序列保持基本一致[即序列相同，或其不同处在于一个或多个氨基酸的改变(缺失、加入、取代)，而这种改变不会引起诱变修饰蛋白质和天然蛋白质间实际不利的功能不同]的天然存在多肽的变体可在此中使用。
当此中所述的任何目标分子如多肽、水溶性聚合物和其衍生物存在于(或分离自)各种pH下的水溶液时，会自然形成这类分子的盐。所有具所示生物活性的肽和其它大分子的盐均被认为在本发明的范围内。例子包括羧酸残基的碱金属、碱土金属和其它金属的盐、氨基残基的酸加成盐(如HCl)、通过相同分子内的羧酸和氨基残基间的反应形成的两性离子。
如上所述，目标分子可以是核酸，包括(用于说明而非限定)核苷酸、低聚核苷酸和线性或环化、单链或双链DNA和RNA。为了增强核酸的性能诸如增强测定条件下的迁移率，通常需要将一聚合物链导入到核酸中。这已经通过使用环氧乙烷基连接基获得了成功(参见例如Grossman等人的美国专利5777096)。因此，可以期待用本发明的精确长度PEG基链修饰的核酸具有类似增强的性能。
所述目标分子也可以是脂质体。脂质体具有许多用途，但是特别有意义的是作为药物传递的载体。为了增强脂质体的性能，通常需要将功能化合物诸如蛋白质、肽等导入到脂质体表面。因为这已经通过使用其它PEG基连接基达到(参见例如Tagawa等人的美国专利5556948号)，所以期待用本发明的精确长度PEG基链修饰的脂质体具有类似的增强性能。
此外，本发明的PEG基链也可连接到基质或固相诸如(用于说明而非限定)硅集成电路片或传感器集成电路片或金或玻璃的表面或其它生物传感器表面、组织培养板、细胞或膜、或合成或天然树脂上。人们可通过使用导入到固相中的互补官能基化学选择性地将PEG基链配位到固相上。这种固相可易于通过交替浸渍于式(I)的二胺浴和式(II)的二酸衍生物浴(中间插入活化浴和洗涤浴)而将本发明的PEG基链连接到其表面。
当目标分子用作人和兽的有效治疗剂时，如用于癌症治疗和传染病治疗时，所述修饰的目标分子一旦生产和纯化就可混入到这种用途的药用组合物中。
用作兽药时，治疗剂可以是任何防止或减轻疾病或稳定或减轻动物病情的分子。治疗剂可包括(但不限于)抗肿瘤抗生素、抗病毒蛋白质、放射性同位素、药剂或毒素。可以期待用此中所述的聚酰胺基链修饰的治疗剂具有与未修饰的治疗剂相同或类似的生物活性但改善了上面讨论的性能。
所述修饰治疗剂可在无毒、惰性药学可接受的含水载体介质中配制。“药学可接受的载体”是指任何标准药用载体诸如磷酸盐缓冲的盐水；水；或乳液如油/水乳液；可能包括各种类型的润湿剂。所述修饰治疗剂可在无毒、惰性药学可接受的含水载体介质中配制，所述介质的优选pH范围为3到8，更优选为6到8。当用于体内治疗时，经灭菌的修饰治疗剂组合物将包括溶解于具可接受pH的水缓冲液(复制后)中的修饰蛋白质。这种修饰治疗剂可用各种赋形剂诸如氨基酸、聚合物、多元醇、糖、缓冲剂、保存剂、其它蛋白质等配制。具体例子包括辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物；聚乙二醇单硬脂酸酯化合物；聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯；蔗糖；果糖；右旋糖；麦芽糖；葡萄糖；葡聚糖；甘露糖醇；山梨醇；肌醇；半乳糖醇；木糖醇；乳糖；海藻糖；牛或人血清清蛋白；柠檬酸盐；乙酸盐；林格溶液和Hank氏溶液；生理盐水；磷酸盐；半胱氨酸；精氨酸；肉碱；丙氨酸；甘氨酸；赖氨酸；缬氨酸；亮氨酸；聚乙烯基吡咯烷酮；聚乙二醇等。优选这种制剂在4℃下稳定至少6个月。
组合物形式的修饰治疗剂可用本领域人员熟悉的方法对受治疗者给药，这里“给药”是指供给受治疗者有效量的化合物或药用组合物。给药的方法包括(但不限于)经口、静脉、经皮和肠胃外给药。给药可在整个治疗过程中连续或间歇进行。决定给药的最有效方式和剂量的方法为本领域技术人员熟知并且随用于治疗的化合物或组合物、治疗目的和受治疗动物或病人的不同而不同。所述组合物可包含其它增加有效性或促使达到具体目标分子的所需量的化合物。所述组合物必须能安全地用于经所选途径给药、无菌和有效。为保持无菌性和增加修饰治疗剂的稳定性，所述组合物可冻干和在使用前复制。
所述制剂优选适合于以治疗有效量对人或动物肠胃外给药。所述量可通过使用所关注病情的动物模型临床前试验获得的体内效能数据或与体内效能相关的普遍接受的体外测定来决定。
以试剂盒的形式提供本发明的聚酰胺基链也是有意义的，可提供感兴趣的目标分子的方便和可重复的修饰。所述试剂盒可包括含有本发明的聚酰胺基链的溶液、缓冲剂、反应指示化合物、说明书、蛋白质浓度测量试剂(如用于Bradford测定)等。试剂溶液优选以预定量提供。或者，所述试剂盒可包括含有用于合成聚酰胺基链的衍生物形式的二酸的溶液和含二胺的溶液以及上述的材料。所述试剂盒也可包含其性能有待改进或增强的目标分子。
试剂盒可包含一系列与已知分子量和组成的目标分子连接的已知组成、分子量和构型(是否为单聚合物、双聚合物或多聚合物)的聚酰胺基链单一溶液(或粉末形式)，其可用作例如作为评估缀合反应的完成和/或收率的标准物或用于提供分子量标准物。
一种可用于合成具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链的优选试剂盒包括(a)Z-Q-载体，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；并且所述载体为固相、基体或表面；(b)具有式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物；和(c)具有式NH2-Y-NH2的二胺；所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在。
另一种示例性的本发明的试剂盒也可用于增强或修饰目标分子并且包括(a)用于合成具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链的试剂，所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；包括(i)Z-Q-载体，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；并且所述载体为固相、基体或表面；(ii)具有式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物，其中X为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(iii)具有式NH2-Y-NH2的二胺，其中Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(b)其性能有待修饰和增强的目标分子，并且其具有任选的二价间隔基或连接基。
前述的试剂盒可进一步包括一个或多个下面物质至少一种式HOOC-X-COOH的另外的二酸或其衍生物，式中X取代基与第一种二酸中的X取代基不同；至少一种具有式NH2-Y-NH2的另外的二胺，式中Y取代基与第一种二胺中的Y取代基不同；和一种选自碳酰二咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐的活化剂。
本发明的另一实施方案是可用于增强或修饰目标分子的试剂盒，其包括(a)具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链，所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(b)其性能有待修饰或增强的目标分子，并且其具有任选的二价间隔基或连接基。
本发明的修饰目标分子或物质可用于诊断目的的改进试剂盒或改进的测定试剂，例如用于结合测定如免疫测定。例如，携带有抗原肽的修饰的目标分子组成提供了固相免疫测定中增高的检测灵敏度。较大的、二价或多价修饰物质可更易于结合到诸如用于免疫测定的多孔板的表面。多价物质可具有增强得多的结合亲和力(例如上面Terskikh等人所述)，并且PEG基链可用于装配合成的多价结构物(参见实施例)。修饰目标分子、特别是含多个PEG基链的目标分子可用于使用信号放大步骤进行分析物检测的体外测定，如像分支DNA基测定。放大通过向单一分析物分子连接多个PEG基链(而不是单一PEG基链)来获得，其中连接到每个PEG基链上的报道基团都在随后的测定步骤中有助于检测信号。增加血细胞比容的治疗剂可通过本发明的PEG基聚酰胺连接基连接两个红细胞生成素模拟肽制备(实施例11和12)。
本发明还提供PEG基链的体外用途。PEG基链可用于“标记”目标分子，从而可进行目标分子的随后检测和/或各种方式的定量。最简单来说，连接PEG基链可让人们进行简单的大小分离而将PEG基链标记的目标分子与混合物中的其它分子分离。显然人们可在该方法中简单地通过改变聚合物的方式利用有机聚合物的不同物理化学性质的优点。例如，微疏水的PEG基链可容许进行基于疏水性的分离，或者人们可使用按需要选择或排斥PEG基链的聚合物结合柱。此外可选择或修饰PEG基链从而使其可直接检测。这赋予了所述PEG基链可包含多个可检测位点(或重复单元)的优点，从而使每个存在于聚合物中的位点被检测系统结合或识别，从而导致检测信号的放大。
实施例缩写词Abu 氨基丁酸amu 原子质量单位AoA 氨基氧基乙酰基Boc 叔丁氧基羰基2BrZ 2-溴苄氧基羰基Bzl 苄基
CDI 羰基二咪唑DAH 1，6-二氨基己烷，H2N-(CH2)6-NH2‘DAH’ DAH的残基DCM 二氯甲烷DIEA 二异丙基乙胺DMAP 4-二甲基氨基吡啶DMF 二甲基甲酰胺EMP 红细胞生成素模拟肽EPO 红细胞生成素Fmoc 9-芴基甲氧基羰基HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐HF氟化氢HOBT N-羟基苯并三唑MALDI-TOF 矩阵辅助的行程激光解吸离子化时间MBHA 甲基二苯甲基胺Mtt 4-甲基三苯甲基NMP N-甲基吡咯烷酮OSu 羧酸或Fmoc保护基的N-羟基琥珀酰亚胺酯PAM 苯基(乙酰胺基)甲基，即严格地为-C6H4CH2CONHCH2C6H4-(聚苯乙烯)，如Boc-Leu-OCH2-PAMPEG 聚乙二醇，-CH2CH2O-的低聚物‘PEG’ -NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-，其为PEG基二胺的残基，NH2CH2CH2CH2- (OCH2CH2)3-CH2NH2SAC4H4O3，琥珀酸酐
succ-COCH2CH2CO-，琥珀酸的残基t-Bu叔丁基TFA 三氟乙酸TFMSA 三氟甲磺酸实施例1H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM树脂的合成在H-Leu-PAM树脂(Bachem)上进行‘PEG’-succ-的三个循环，得到H-[NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-CO-CH2CH2CO]3-Leu-PAM树脂。
将0.5g(约0.3mmol)Boc-Leu-PAM树脂(Bachem，瑞士)在DMF中溶胀并在一台ABI 430A肽合成器上用TFA去保护。排出TFA并将树脂以常规方式用DMF洗涤。这产生准备用于酰化的H-Leu-PAM树脂(以其TFA盐的形式)。有时这种产物被写成H-Leu-OCH2-PAM树脂，有时为H-Leu-PAM树脂，但是两者均指标准的PAM肽合成树脂。
这里“Leu”是亮氨酸的残基(-NH-CH(C4H9)-CO-)，该产物正确的写法为“H-Leu-PAM”树脂，而非经常使用的“Leu-PAM”。与此类似方式以及正如上面缩写词部分所指出的，‘PEG’为残基(-NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-)，并且类似地当在末端时，所述端基(这里为氢)应显示出来。
酰化将如上制备的H-Leu-PAM树脂在DMF中溶胀、排出并用4毫摩尔SA在室温下，涡流搅拌30分钟酰化。将SA溶解于8毫升的DMF(Burdick and Jackson高纯级)中，其为0.5M的HOBT(Fluka)溶液并往其中加入400微升的DIEA。排出并用DMF洗涤树脂后，Kaiser茚三酮试验表明酰化完全。
活化将游离羧基用8毫摩尔CDI(Fluka)在8毫升DMF中活化30分钟。
氨解在简短排出并用DMF洗涤后，将树脂结合的imidazolide用‘PEG’基二胺NH2CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH2(4ml二胺与4ml为0.5M HOBT溶液的DMF预混)氨解。用DMF充分清洗后，Kaiser试验显示出特征蓝色并且这种氨基树脂可供下一次的酰化/活化/氨解循环。
再重复两次所述酰化、活化和氨解循环而得到H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM树脂。产物通过进一步的链延长并接着如实施例2所述的那样裂解来鉴定。
实施例2H-Tyr-(‘PEG’-succ)3-Leu-OH的合成将来自实施例1的H-(‘PEG’-succ)3-Leu-PAM树脂的第三个‘PEG’的树脂结合氨基使用标准HBTU活化和DIEA作为碱在ABI 430A上用Boc-Tyr(2BrZ)酰化，然后将树脂以正常方式处理以去保护/裂解(用TFA去除Boc、用HF在5％对甲苯酚的存在下在0℃60分钟去除苄基侧链保护2BrZ并从树脂上裂解)。蒸发掉HF后，用-20℃乙醚提取对甲苯酚。将得到的树脂饼和产物溶于50％乙腈中并将树脂滤除。通过冷冻干燥将产物从滤液中分离。反相高效液相色谱(Nucleosil300 5μm C8柱，250×4mm id，0.6mL/min，溶剂A为1g TFA/1升水，溶剂B为1g TFA溶解于100ml水后用乙腈稀释成1升，梯度为从100％A到100％B)分析表明只有一个主组分，其通过电子喷雾离子化质谱鉴定为所要的H-Tyr-(‘PEG’-succ)3-Leu-OH(实测质量1201.5，计算值为1201.6)。
实施例3H-Ser-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH的合成以类似于实施例1中所述的方式在Abu-Sasrin树脂上进行PEG-succ的八个循环而得到H-[NHCH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2NH-CO-CH2CH2CO]8-Abu-Sasrin树脂用Fmoc-Ser(t-Bu)酰化第八个‘PEG’的树脂结合氨基。树脂的一部分用哌啶Fmoc去保护并然后用TFA处理以除去丁基侧链保护和从树脂上裂解。另一部分如生产商(Bachem)建议的那样使用1％TFA的DCM溶液从树脂上裂解，完全去除Fmoc和丁基保护。已知(参见Bachem提供的关于Sasrin树脂的小册子)Sasrin树脂易于减慢(24小时)二胺的氨解，导致作为酰胺的生长链的释放和树脂上羟基的释出。虽然在所述氨解中这种反应只发生小的程度，但在随后的步骤中任何释出的链均被洗涤掉并且因此不会污染产物。
两种产物均给出非常纯净的色谱图，并且其质谱分析得到预期的质量Fmoc-Ser(But)-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH在分别相应于M＋4H+和M＋3H+的m/z 722.9和963.5处给出了信号，得到质量为2887.5，计算值为2887.5；H-Ser-(‘PEG’-succ)8-Abu-OH在分别相应于M＋5H+、M＋4H+和M＋3H+的m/z 523.0、653.6和871.0处给出信号，得到质量为2609.3，计算值为2609.2。在质谱图中没有观察到缺-CH2CH2O-(44amu)的痕量物质，其足够的强度表明杂质低至1％的水平。
完全受保护的产物可良好地溶解于水/乙腈/TFA的HPLC溶剂系统中。这是一种所期待的聚乙二醇的性质，而完全保护的肽通常不溶于大多数溶剂。正如大家所熟悉的，具有末端游离羧酸的受完全保护的产品对于在片断缩合(汇集合成)中活化和偶联是有用的。Ser基团的去保护后，可用高碘酸在非常温和的条件下将其氧化而提供适合于形成非肽键(如肟)的醛基。这种氧化和肟化由Rose在上述的J.Am.Chem.Soc.中描述。
实施例4(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH的合成将Fmoc-半胱胺Sasrin树脂(Bachem，200mg，0.51mmol/g)进行Fmoc去保护(由于如所述的氨基数目的增加，取比通常更少的树脂)。成对进行Fmoc-Lys(Fmoc)的两个循环而产生具有四个游离氨基(代替原来的一个)的赖氨酸“树”。
如实施例1所述在树脂上进行四个‘PEG’-succ循环。然后将树脂用Fmoc-Ser(t-Bu)酰化、Fmoc-去保护并然后在三异丙基硅烷的存在下用TFA处理除去丁基和从树脂上裂解。通过HPLC分离所需产物(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH并通过质谱鉴定(质量5647.9)。所述硫醇在pH7的磷酸盐缓冲液中用5-碘乙酰氨基荧光素(Fluka)烷基化而形成所期待的携带荧光团的烷基化四分支产物。通过HPLC分离产物并通过质谱鉴定。它给出了分别相应于M+9H+、M＋8H+、M＋7H+、M＋6H+和M＋5H+的在m/z 671.9、755.7、863.5、1007.1和1208.2处的信号，得到6037.0的质量，计算值6037.2。所述Ser残基可通过温和高碘酸处理(其并不影响荧光团)氧化并且如上面的Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的那样与肽或其它携带氨基氧基的分子形成四肟。
分支产物(H-Ser-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NHCH2CH2SH的收率比用线性‘PEG’-succ甚至那些具有8个重复单元的低聚物获得的收率低得多，可能是由于在分支结构情况下被二胺近处分隔的活性羧基的增强的桥连倾向。为此，当通过肟化构建分支结构时，可能优选缩合例如含线性‘PEG’-succ化合物(肽)-(PEG’-succ)n-‘PEG’-COCH2ONH2与分支的(O＝CHCO-)4Lys2-Lys-NH2而不是缩合(肽)-COCH2ONH2与分支的含‘PEG’-succ化合物(O＝CHCO-(‘PEG’-succ)4)4Lys2Lys-NH2。
实施例5肽二聚物(肽)-肟-(‘PEG-succ)16-‘PEG’-肟-(肽)的合成在该实施例中使用未修饰的Sasrin树脂(0.25mmole，Bachem)。用SA(10摩尔)在5ml含1摩尔DMAP的DMF中酰化树脂结合的羟基40分钟。重复这种酰化反应以确保Sasrin树脂的羟基的高度酰化。在这个阶段的产物为HOOC-CH2CH2-CO-O-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-聚苯乙烯，其为如方案1所述的HOOC-X-CO-O-Q-载体的形式，其中Q为Sasrin连接基-CH2(C6H3(OCH3))-O-CH2-，所述载体为Sasrin珠的聚苯乙烯，X为-CH2CH2-。
用DMF洗涤后，用8毫摩尔CDI在8毫升DMF中活化所述酸的游离羧基30分钟。
如实施例1所述用‘PEG’氨解活化树脂。如实施例1那样再进行7个‘PEG’-succ循环。(在另一情况下，再进行5个而不是7个循环)。
然后在标准条件下使用HBTU/DIEA用Boc-Ser(Bzl)酰化端氨基。通过用1％TFA/DCM溶液多次处理，如Sasrin生产商推荐的那样用吡啶甲醇溶液中和每个等份样来从树脂上转移所述链。这个阶段通过在室温下旋转蒸发分离产物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-COCH2-CH2CO-OH，或更简单Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-OH并通过反相HPLC纯化。(在另外的情况下，制备Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-OH)。在标准条件下用HATU(一当量)NMP溶液活化羧基10分钟并将活化化合物用‘PEG’(半当量，以有利于‘PEG’的两个氨基的酰化)氨解2天。通过反相HPLC分离产物并通过电子喷雾离子化质谱鉴定为对称化合物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-Ser(Bzl)Boc其也可写成Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-Ser(Bzl)Boc在上面结构中，可理解对称中心‘PEG’的两个端氨基用Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)8-己酰化右手Ser(Bzl)因此为-CO-CH(CH2OBzl)NH-而不是更常见的-NH-CH(CH2OBzl)CO-，因此Ser残基显示为斜体以表明这个情况。实测质量为5613(计算值5612.9)。在所述另一情况下产物是对称化合物Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser(Bzl)Boc其也可写成Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)12-‘PEG’-Ser(Bzl)Boc并且实测质量为4403.4(计算值4403.4)。
通过用TFA(每毫克20微升TFA)以标准方法处理4分钟后加入三氟甲烷磺酸(每毫克2微升)在室温下处理25分钟除去保护基(Boc，Bzl)。将去保护的物质沉淀并用预先冷却到-20℃的乙醚洗涤三次而得到对称的化合物H-Ser-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-Ser-H或H-Ser-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-Ser-H其通过反相HPLC分离并通过电子喷雾离子化质谱鉴定实测质量为5232，计算值为5232.4。
可将未保护的丝氨酸基如上面Rose，J.Am.Chem.Soc.所述用HIO4氧化形成端醛基
在标准肟化条件下加入NH2OCH2C(O)-肽得到哑铃形二肟肽-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-C(O)CH＝NOCH2CO-肽其也可写成肽-COCH2ON＝CHC(O)-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-C(O)CH＝NOCH2CO-肽或(肽)-肟-(‘PEG’-succ)16-‘PEG’-肟-(肽)其可通过HPLC分离并通过质谱鉴定。
适合使用的肽序列的例子是上面的Johnson等人在Chemistry &Biology中所述的肽序列-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-(SEQ ID NO1)。
这种肽与分子量约3400的连接基的二聚显示出导致生物活性约1000倍的提高。实施例7描述了这种肽如何以适合的形式(氨基氧基乙酰基和二硫键存在)生产而供肟化成氧化PEG连接基。
实施例6与PEG连接基结合的肽(肽)-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8-)-酰胺的合成在该实施例中使用MBHA树脂(0.5毫摩尔，Novabiochem，瑞士)。树脂结合的氨基在标准条件下用Fmoc-Lys(Mtt)酰化。去除Fmoc基后(20％哌啶的DMF溶液，20分钟)，在实施例1的条件下增加八个‘PEG’-succ循环。第八个‘PEG’基的端氨基用Boc-Glu(Ochxl)酰化。然后用等份的1％TFA/DCM溶液去除Mtt基(但不是Boc基)直到不再有黄色释放出来。在使用标准Boc化学、用序列H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-(SEQ IDNO2)延伸所述肽前将游离氨基用Fmoc-O-Su(1毫摩尔在4毫升含0.4毫升N-甲基吗啉的DMSO中，1小时；用Kaiser试验检查并且如果需要重复酰化，但是第二次只使用0.2毫升N-甲基吗啉)。在上面Terskikh等人的文献中已描述了序列H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-(SEQ ID NO3)。当适合留间隔时这种肽的五个拷贝提供了五个数量级的与病理细胞系更好的结合。
Fmoc基团(和在色氨酸的侧链上的甲酰基)用哌啶的DMF溶液去除，并且游离氨基用Boc-NHOCH2CO-OSu酰化(完全和以上所述的Fmoc-O-Su偶联相同)。Boc基团用TFA去除，树脂用10％DIEA/DMF溶液中和、用DMF洗涤后用DCM洗涤并接着用1∶1DCM∶MeOH洗涤并高真空下干燥。如实施例2那样进行用HF的裂解和产物分离。通过反相HPLC分离的产物通过电子喷雾离子化质谱鉴定H-Ser-Val-Trp-Arg-Trp-Leu-Pro-Tyr-Asp-Lys-Tyr-Glu-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2(SEQ ID NO4)，实测质量4261.9，计算值4261.1。
只使用4个‘PEG’-succ循环如上制备具更短连接基的化合物。这种化合物具有3051.5的实测质量，计算值为3051.6。
这些具有PEG基连接基和氨基氧基乙酰基(NH2OCH2CO-)的肽被用于肟化反应来使用上面Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的化学制备二聚物和更高级的聚肟。
实施例7肽二聚物(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys-((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺的合成在该实施例中使用MBHA树脂(0.5毫摩尔，Novabiochem，瑞士)。在ABI 430A仪器上通过标准Boc化学将序列Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-(SEQ ID NO1)(Johnson等，Chemistry & Biology，见上面)、接着将Boc-氨基乙酸偶联到树脂上。通过两个30分钟的用10毫升混合物[巯基乙醇(6ml)和DIEA(3ml)在DMF(21ml)中]的处理除去His侧链的二硝基苯基。用DMF洗涤树脂后，以标准方法用TFA除去Boc基团，然后通过两次用水(2ml)和乙醇胺(2.4ml)在DMF(35.6ml)中的混合物(每次10ml)处理由色氨酸上除去甲酰基。树脂用DMF充分清洗后，用DCM洗涤并接着用1∶1DCM∶MeOH洗涤，排出并高真空干燥。用HF裂解和去保护，如实施例2那样进行产物分离。电子喷雾离子化质谱分析表明产物具有所期待的NH2OCH2CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH2(SEQ ID NO1)的质量(实测值2250.8，计算值2249.7)。
如下形成二硫键。将48毫克上述肽(约21.3微摩尔)溶解于48毫升水中并用氢氧化铵溶液将pH调节到7.0(玻璃电极)。加入25当量0.92M过氧化氢贮备液。室温下30分钟后，用0.5毫升乙酸酸化该溶液并立即注入制备反相HPLC中。二硫键的形成由损失两个质量单位证实实测值2247.8，计算值2247.7。
在该实施例中使用MBHA树脂(0.5毫摩尔，Novabiochem，瑞士)。树脂结合的氨基在标准条件下用Fmoc-Lys(Fmoc)酰化。去除Fmoc基后(20％哌啶的DMF溶液，20分钟)，在实施例1的条件下增加两个‘PEG’-succ循环。然后用Boc-Ser(Bzl)酰化‘PEG’基的端氨基。在用TFA除去Boc基并将树脂洗涤和干燥后，用液体氟化氢处理树脂并按实施例2的方法将产物分离。反相HPLC分析表明为单一主产物，其通过电子喷雾离子化质谱鉴定为所期待的产物(实测质量为1529.4，计算值为1528.8)H-Ser-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ-Lys(H-Ser-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ)-NH2。
产量为180mg纯化产物。在Gaertner等人在BioconjugateChemistry 3262-268(1992)的所述条件下，将端丝氨酸残基在咪唑缓冲剂(340mg咪唑溶于100ml水中，用6M HCl调节到pH 6.95)和乙腈的混合物7∶2(体积)中用高碘酸氧化。通过反相HPLC分离氧化(二醛)产物后，通过质谱鉴定发现分别相应于期待的二醛、二醛一水合物和二醛二水合物的质量1466.9、1484.9和1502.9(计算值分别为1466.8、1484.8、1502.8)O＝CH-CO-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ-Lys(O＝CH-CO-‘PEG’-succ-‘PEG’-succ)NH2在以0.1％TFA用0.1％TFA在90％乙腈中的梯度的制备HPLC分离后，通过在室温下旋转蒸发回收二醛至约10mM的浓度(所述氧化为定量氧化)。
二醛用两倍过量的NH2OCH2CO-Gly-Gly-Leu-Tyr-Ala-Cys-His-Met-Gly-Pro-Met-Thr-Trp-Val-Cys-Gln-Pro-Leu-Arg-Gly-NH2(SEQ IDNO1)(具有二硫键)在室温下肟化(按照Rose.，K.，1994)18小时而导致这种肽和二醛间的期待的二肟的形成。通过反相HPLC分离这种二肟并通过质谱鉴定实测质量为5926.0，计算值为5926.0。
实施例8H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-H的合成在DMF中溶胀后，将Sasrin树脂(0.3毫摩尔)用CDI(8毫摩尔于8毫升NMP中，NMP为0.5M的4-二甲基氨基吡啶溶液)活化30分钟、排出并再次活化。将活化树脂用‘PEG’氨解，然后用SA酰化并如前所述(除了洗涤步骤中用NMP代替DMF外)用于制备H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-CO-O-CH2-C6H3(OCH2)-树脂。用TFA裂解30分钟从树脂裂解出产物并用冷乙醚(在其冰点)沉淀。通过制备反相HPLC分离产物。电子喷雾质谱显示其质量为2437.18±0.81。对于对称的H-(‘PEG’-succ)7-‘PEG’-H来说其质量计算值为2436.98。
实施例9H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’-H的合成除了在替换的氨解循环中使用‘DAH’代替‘PEG’外，该实施例与实施例8的步骤类似。这样，在Sasrin树脂上制得(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’。尽管当使用更亲水的‘PEG’二胺工作时优选DMF，但是当使用疏水二胺如DAH工作时，在实施例1和5-7的方法中使用NMP代替DMF是有益的。用TFA从树脂裂解并用冷乙醚(在其冰点)沉淀后，通过反相HPLC将产物分离。电子喷雾质谱显示其质量为1920.78±0.59。H-(‘DAH’-succ-‘PEG’-succ)3-‘DAH’-succ-‘PEG’-H的质量计算值为1920.49。
实施例10聚酰胺稳定性评价将实施例8和9生产的化合物以1mg/ml的浓度分别溶解于1％碳酸氢铵溶液中。在不同的试管中，将这些溶液用胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶(酶∶底物比率1∶100，37℃)处理。以一定间隔抽出等份试样(20微升)并用HPLC分析。即使24小时后，也没有消化发生，而在相同条件下胰岛素用酶的对照培育表明只在4小时后就发生广泛地消化。因此聚酰胺比多肽对蛋白酶的作用稳定得多。相反，来自上面Terskikh等人所用的骆驼抗体的铰链区的肽酰胺H-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Gln-Pro-Lys-Pro-Glu-Pro-Glu-NH2(SEQ ID NO5)尽管对糜蛋白酶和弹性蛋白酶稳定，但它在24小时后就被胰蛋白酶深度消化。
实施例11A、EMP-二聚物(工业PEG)的合成和HPLC/质谱分析此中称为“工业EMP-二聚物”的EMP二聚物使用此中称为“工业EMP二聚物”并表示为O＝CH-工业PEG-CH＝O的平均相对分子量3400的工业PEG二醛连接基(Shearwater Polymers)制备。携带AoA基的单体肽(Johnson等，Chemistry & Biology，同上)NH2OCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO1)和二硫键通过Boc化学使用标准技术在MBHA树脂(上述的Fields和上述的Rose，J.Am.Chem.Soc.和实施例7)上合成。然后将肽从树脂裂解并用HF(含5％对甲苯酚，0℃ 60分钟)去保护，用乙醚沉淀并通过制备HPLC纯化。然后用工业PEG连接基进行肟化而得到二聚物酰胺-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH2ON＝CH-工业PEG-CH＝NOCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(SEQ ID NO1的二聚物)。斜体字用于指示所示的是非常规取向(C到N端而非常规的N到C端)的一种肽。肟化如下进行将2.4mg EMP肽(1.06微摩尔；比醛基1.2倍过量)溶解于0.2ml水中并加入到溶解于0.45ml乙酸盐缓冲液(0.15M，反离子钠，6M盐酸胍)的1.5mg(0.44微摩尔)PEG-二醛中。在室温下暗处保存16小时后，通过制备HPLC进行产物分离并通过分析HPLC和MALDI-TOF质谱进行鉴定。
这种EMP-二聚物的反相HPLC色谱图和质谱分析利用MAIDI-TOF技术(其产生单质子化物质)，因为对于在电子喷雾四极仪(其生产多质子化物质)上的谱图分析太复杂。
前人用来自相同供应商的PEG制备的这种二聚物的工作(Johnson等，Chemistry & Biology，同上)证实了在EPO决定的细胞增殖测定中的0.1nM的ED50值，这比所述肽单体低1000倍。尽管其具有纯的色谱图，但质谱图显示有40个以上的组分，每个相差PEG重复单元-CH2CH2O-，即44amu的间隔。不可能通过HPLC分离各组分。在相应于具78个-CH2CH2O-基的分子的分布的中心处(8024amu)的质量峰与所宣称的PEG的相对分子量(3400，即77个重复单元，231个键，发现这里为±20个重复单元或60个键)一致。
B、EMP-二聚物(精确长度PEG)的合成和HPLC/质谱分析此中称为“精确长度EMP-二聚物”的EMP二聚物使用此中称为“精确长度EMP二聚物”的一种本发明的精确长度PEG基聚酰胺链制备。所述精确长度EMP-二聚物具有比工业EMP-二聚物更长的长度。
所述精确长度EMP-二聚物是基于对称的聚酰胺连接基-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-并如下合成。
使用上述的技术在Sasrin树脂(Bachem)上制备所述PEG聚酰胺连接基Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-OH。按树脂生产商的建议用1％TFA的DCM溶液自所述树脂上裂解所述物质并用制备HPLC纯化。搅拌下往Boc-Ser(Bzl)-(PEG-succ)6-OH(9.7毫克，4.4微摩尔)的NMP溶液中加入HATU试剂(1.6毫克，4.4微摩尔)和用NMP稀释10倍的DIEA溶液(15微升，8.8微摩尔)。在相应于羧酸基预活化5分钟后，将活性酯用PEG基二胺(4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺，‘PEG’，用NMP稀释100倍，24微升，1.15微摩尔)氨解过夜。得到的对称Boc-Ser(Bzl)-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser(Bzl)-Boc直接通过制备HPLC纯化(产量7毫克，1.6微摩尔，73％)。用标准TFMSA裂解方法(300微升TFA 4分钟，接着加入30微升TFMSA 25分钟)去除两个Boc基和苄基。产物用冷乙醚(在其熔点，存在少量固态醚)沉淀，用冷乙醚洗涤三次并在干燥器中干燥。将去保护连接基Ser-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-Ser的Ser残基如上面Rose，J.Am.Chem.Soc.中所述氧化成乙醛酰官能基(O＝CH-CO-)。第二个Ser被写成斜体字以指示该连接基是对称的第一个Ser为NH2-CH(CH2OH)CO-，第二个Ser为-CO-CH(CH2OH)-NH2，即指示非常规途径循环。
将得到的二醛连接基再通过HPLC纯化。将具有形成的二硫键的氨基氧基乙酰基-EMP肽衍生物溶液(96微升，21.3mM/0.1M乙酸盐缓冲液，pH 4.0，反离子钠；比醛基1.5倍过量)与二醛(200微升，3.5mM/水)混合并让其在室温下反应48小时。通过反相HPLC分离二聚产物酰胺-GRLPQCVWTMPGMHCAYLGG-COCH2ON＝CH-CO-(‘PEG’-succ)12-‘PEG’-CH＝NOCH2CO-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-酰胺(一种SEQ ID NO1的二聚物)，产量为1.2毫克(20％收率)，并且通过分析HPLC和电子喷雾离子化质谱鉴定。斜体字用于指示所示的是非常规取向(C到N端而非常规的N到C端)的一种肽。
尽管所述精确长度EMP-二聚物具有比工业EMP-二聚物更多的键(243比231)和42个-CH2CH2O-单元，但所述精确长度EMP-二聚物均匀得多。在质谱图上没有具太少-CH2CH2O-重复(44个质量单位)物质的信号。只稍微比主信号强的信号是由于钠和钾的阳离子化，而这种阳离子化是电子喷雾离子化质谱的常见特征。其实测质量(8417)非常接近于8420的理论值。它证明了可以制备具有更长和更短的链16和4个-‘PEG’-succ-重复单元的二聚物。使用上至-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-的间隔基获得了优良的色谱图和质谱图。
实施例12在细胞培养测定(人类白血病的UT-7 EPO依赖性细胞系)中测定具不同长度连接基的精确长度EMP-二聚物的EPO活性。重组EPO和EMP单体肽包括其中作为对照，所述单体在表1中表示为“mono”。
在所述精确长度EMP-二聚物中的短连接基(在表1中表示为“s”)为-(‘PEG’-succ)2-‘PEG’-(succ-‘PEG’)2-。中度连接基(在表1中表示为“m”)为-(‘PEG’-succ)6-‘PEG’-(succ-‘PEG’)6-，而长连接基(在表1中表示为“1”)为-(‘PEG’-succ)8-‘PEG’-(succ-‘PEG’)8-。
表1每个肽样品的平均OD浓度(μM)OD OD OD ODm s l mono1×10-1.884 .930 .891 .8783.33×10-2.902 .925 .890 .6731.11×10-2.876 .935 .906 .3733.70×10-3.888 .919 .931 .2101.24×10-3.916 .798 .838 .0784.12×10-4.805 .756 .848 .0781.37×10-4.760 .534 .835 .0894.57×10-5.637 .299 .695 .0891.52×10-5.597 .194 .632 .0895.08×10-6.712 .171 .525 .0891.69×10-6.641 .298 .614 .0895.65×10-7.469 .163 .547 .0891.88×10-7.363 .117 .502 .0896.27×10-8.350 .114 .356 .0892.09×10-8.287 .088 .231 .0896.97×10-9.280 .089 .193 .0892.32×10-9.246 .083 .217 .0897.74×10-10----- .099 .194 .0892.58×10-10----- .129 .170 .089阴性对照.089 .076 .074 .090
表2重组EPO样品的平均ODEPO(ng/ml) OD50 .91716.7 .9205.56 .8851.85 .878.617 .650.206 .362.0686.179.0229.124.00762 .108.00254 .101阴性对照 .078从上面的结果明显可以看出表3所示的ED50(产生50％最大响应的有效剂量)值。
表3物质 ED50(pM)EMP单体 20000重组EPO25EMP-s(短二聚物) 100EMP-m(中二聚物)1EMP-l(长二聚物) 0.1表3表明连接了中和长聚酰胺链的EMP二聚物在细胞测定中比重组蛋白质标准具有高得多的活性。
实施例13下面实验探索分支结构的用途，在其构建中使用了非PEG的聚合物。
本发明的PEG基聚酰胺被用于合成此中被称为“化学体”的peptabody的化学变体(Terskikh等人，同上)。通过标准技术(上面所述的Fields的技术和上面的Rose在J.Am.Chem.Soc.中所述的技术)在Fmoc-Lys(Mtt)-MBHA树脂(0.5mmol)上合成带一个AoA基团的单体肽H-ADGACRNPWC-(‘PEG’-succ)8-Lys(AoA)-酰胺(SEQ ID NO6)。简要地说，去除Fmoc保护，进行PEG’-succ的8个循环，然后将Boc-Cys(4-MeBzl)偶联到端氨基上。去除Mtt保护(进行多轮的1％TFA/DCM处理直到溶液不再发黄)并将氨基用Fmoc-OSu(2mmol在5ml具作为碱的N-甲基吗啉的DMF中)酰化。通过Boc化学反应将肽链延伸到N-端。用10％哌啶/DMF处理7分钟去除Fmoc保护，因为更强的条件导致在Asp-Gly处形成琥珀酰亚胺。这种哌啶处理从Trp吲哚上去除了甲酰基保护。氨基用Boc-AoA-OSsu(0.6mmol在5ml含作为碱的N-甲基吗啉的无水DMSO中，没有更强的条件或Trp的酰化或Boc-NHOCH2CO-的N的酰化发生)酰化。从树脂裂解并用HF去保护后，通过HPLC纯化，如对于EMP肽所述用过氧化氢形成二硫键，通过HPLC分离产物并通过分析HPLC和电子喷雾离子化质谱鉴定实测质量为3709.1，理论质量为3709.4。
以Fmoc-半胱胺-Sasrin树脂(Bachem)为起始并偶联两轮的Fmoc-Lys(Fmoc)以及随后偶联Boc-Ser(t-Bu)，通过标准技术制备四价拷贝Ser-Lys(Ser)-Lys(Ser-Lys(Ser))-NHCH2-CH2SH。去保护和裂解(270mg树脂，2.7ml TFA，30mim，过滤，在氮气流下蒸发到小体积，用冷乙醚沉淀)后，产物通过HPLC纯化。将该硫羟如下进行烷基化往磷酸盐缓冲溶液(2.5ml，0.25M磷酸盐，pH 7.0，1mM EDTA)中首先混入1ml纯化的拷贝(10mM水溶液)并立即混入5-碘乙酰氨基荧光素(Fluka，1ml，10mM/DMF)。暗处放置90分钟后，将荧光素标记的拷贝用HPLC纯化，得到7.8mg产物，66％的收率。将Ser残基氧化并通过HPLC分离后，将四乙醛酰基荧光素标记的拷贝(28μl，3.4mM/水)在室温下用H-ADGACRNPWC-(‘PEG’-succ)8-Lys(AoA)-酰胺(SEQID NO6)(二硫化物形式，66μl，6mM/0.1M乙酸盐缓冲液，pH4.0，反离子钠，比每个存在的醛基1.04倍过量)肟化48小时。产物通过HPLC纯化并用分析HPLC和电子喷雾离子化质谱鉴定[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-荧光素，其中所述“肽”为-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)。
与上面Terskikh等人的peptabody类似，这种四聚产物被称为四聚化学体。这种四聚化学体的HPLC色谱图和质谱图显示结合到BCL1肿瘤细胞系(Terskikh等人，同上)的源于噬菌体的肽ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)的四个拷贝(具有半胱氨酸间的二硫键)。与具有五个肽、72个键的连接基长度和没有报道基团的85000相对分子量的Terskikh peptabody相比，所述的化学体具有4个结合肽、167个键的PEG-聚酰胺间隔基长度和一个荧光素报道基团和15858(实测值；接近15839的理论值)的相对分子量。在质量15521处的一个小信号相应于一个存在缺失32的一个单-“PEG”-succ-重复单元的非常小的组分。
这种缺失在固相肽合成中是常见的，由于采用了标准肽化学方法，期待偶合步骤的优化(更高的浓度、更长的时间、更高的温度、更好的溶剂、添加剂诸如4，4’-二甲基氨基吡啶)来产生更长的链，特别是由于用这些无位阻且非常易溶的化合物，应不存在难以用肽建立并通常伴随着β-结构形成的序列。
噬菌体源的肽因此可在生物相容的链的端点显示在整个合成分子上，而不会有重组表达和重折叠的问题。通过上述方法，化学体可容易地用ADGACRNPWC(SEQ ID NO6)以及用噬菌体肽SVWRWLPYDKYE(SEQ ID NO3)制备，而具有相应序列的相应peptabodies不能以可溶形式产生(Terskikh等人，同上)。宽范围的精确制备的二聚物和多价结构诸如化学体现可容易地通过此中所述的方法合成。
在该说明书中提及的所有出版物和专利申请均以相同程度通过引用并入本文，如同每个出版物或专利申请被具体和单独通过引用并入本文一样。
现已将本发明进行了全面说明，本领域技术人员应理解在没有背离所附权利要求书的精神或范围下可对本发明进行许多改变和修正。
序列表<110>Gryphon Sciences<120>精确长度的聚酰胺链<130>GRFN-029/03WO<140><141><150>60/124，266<151>1999-03-11<150>60/105，261<151>1998-10-22<150>60/098，351<151>1998-08-28<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>1Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln1 5 10 15Pro Leu Arg Gly20<210>2<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>2Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr1 5 10<210>3<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>3Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr Glu1 5 10<210>4<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>4Ser Val Trp Arg Trp Leu Pro Tyr Asp Lys Tyr Glu Lys1 5 10<210>5<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>5Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Lys1 5 10 15Pro Gln Pro Lys Pro Glu Pro Glu20<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成<400>6Ala Asp Gly Ala Cys Arg Asn Pro Trp Cys1 5 10
权利要求
1.一种具有精确数目重复单元的水溶性有机聚酰胺基链，所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；和Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在。
2.权利要求1的链，其中一个或多个X和Y取代基为对称基团。
3.权利要求1的链，其中X和Y取代基的至少一个包含1到5个-CH2CH2O-基团。
4.权利要求1的链，其中所述二价有机基团选自取代、未取代、分支和线性、脂族和芳族基团，并可任选含有杂原子。
5.权利要求4的链，其中所述二价有机基团选自苯基、C1-C10亚烷基部分、C1-C10烷基基团，任选含杂原子，或其组合。
6.权利要求5的链，其中所述二价有机基团选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
7.权利要求1的链，具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}-。
8.权利要求7的链，具有下式-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}-。
9.权利要求7的链，具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}z--NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-其中z为一个1到49的整数。
10.权利要求1的链，具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-。
11.权利要求10的链，具有下式-{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
12.权利要求10的链，具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
13.权利要求10的链，具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
14.具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰胺基组成，所述组成具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n为1-100的整数；n’为0或1；q为一个1到10的整数；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；V选自其性质有待修饰或增强并且具有任选的二价间隔基或连接基的一价或多价目标分子；具有多价连接基的报道基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-载体，其Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或可不存在，Q为连接基或目标分子，所述载体为固相、基体或表面；和U选自其性质有待修饰或增强并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；端基；肽链；保护基；载体和反应性基团。
15.权利要求14的组成，其中X和Y取代基的一个或多个是对称基团。
16.权利要求14的组成，其中X和Y取代基的至少一个包含1到5个-CH2CH2O-基团。
17.权利要求14的组成，其中所述二价有机基团选自取代、未取代、分支和线性、脂族和芳族基团，并可任选含有杂原子。
18.权利要求17的组成，其中所述二价有机基团选自苯基、C1-C10亚烷基部分、C1-C10烷基基团，任选含杂原子，或其组合。
19.权利要求18的组成，其中所述二价有机基团选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
20.权利要求14的组成，具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}]q-V。
21.权利要求20的组成，具有下式[U-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}]q-V。
22.权利要求20的组成，具有下式[U-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}z--NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH]q-V其中z为一个1到49的整数。
23.权利要求14的组成，具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n]q-V。
24.权利要求23的组成，具有下式[U-{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n]q-V。
25.权利要求23的组成，具有下式[U-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO}n]q-V。
26.权利要求23的组成，具有下式[U-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n]q-V。
27.权利要求14的组成，其中所述目标分子选自蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质体和治疗剂。
28.权利要求14的组成，其中所述目标分子是一种选自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽。
29.具有精确重复单元数目的水溶性有机聚酰胺基均一组成，所述组成具有下式[U-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’]q-V式中n为1-100的整数；n’为0或1；q为一个1-10的整数；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；V选自为少于50个氨基酸残基的肽并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；具有多价连接基的报道基团；反应性基团；和具有多价连接基的端基，所述端基选自-OH、-NH2、-H和-Z-Q-载体，其中Z为二价间隔基诸如-NH-、-O-或不存在，Q为连接基或目标分子，所述载体为固相、基体或表面；和U选自为少于50个氨基酸残基的肽并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子；端基；肽链；保护基；载体和反应性基团；其中U或V中的至少一个是目标分子。
30.权利要求29的组成，其中所述二价有机基团选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3-]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
31.权利要求29的组成，其中所述任选的二价连接基为-COCH2ON＝CH-CO-。
32.权利要求29的组成，其中所述目标分子选自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)。
33.权利要求29的组成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQID NO1)；肟为-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-；n为12或16。
34.权利要求29的组成，其具有下式肽-Lys(NH2OCH2CO- (‘PEG’-succ)8)-NH2，其中所述肽具有序列-SVWRWLPYDKYE-(SEQID NO3)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
35.权利要求29的组成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；肟为-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
36.权利要求29的组成，其具有下式(肽)-(‘PEG’-succ)8-Lys(氨基氧基乙酰基)-酰胺，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
37.权利要求29的组成，其具有下式[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-荧光素，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；肟为-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
38.一种水溶性有机聚酰胺基均一组成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)n-‘PEG’-肟-(肽)，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；肟为-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-；n为12或16。
39.一种水溶性有机聚酰胺基均一组成，其具有下式肽-Lys(NH2OCH2CO-(‘PEG’-succ)8)-NH2，其中所述肽具有序列-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-，succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
40.一种水溶性有机聚酰胺基均一组成，其具有下式(肽)-肟-(‘PEG’-succ)2-Lys((肽)-肟-(‘PEG’-succ)2)酰胺，其中所述肽具有序列-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；肟为-COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
41.一种水溶性有机聚酰胺基均一组成，其具有下式(肽)-(‘PEG’-succ)8-Lys(氨基氧基乙酰基)-酰胺，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
42.一种水溶性有机聚酰胺基均一组成，其具有下式[肽-(‘PEG’-succ)8-Lys(肟)酰胺]4Lys2Lys-NHCH2CH2S-CH2C(O)NH-荧光素，其中所述肽具有序列-ADGACRNPWC-(SEQ ID NO6)；肟为COCH2ON＝CHC(O)-；‘PEG’代表式-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-；succ代表式-CO-(CH2)2-CO-。
43.合成具有精确数目重复单元的水溶性有机聚酰胺基链的方法，这种链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；和Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；该方法包括下面的步骤(a)用摩尔过量的试剂L-CO-L’，其中L和L’为离去基团并且相同或不同，酰化式Z-Q载体化合物的氨基或羟基，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；所述载体为一固相、基体或表面；(b)用摩尔过量的式NH2-Y’-NH2的二胺氨解步骤(a)的产物；(c)用摩尔过量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化步骤(b)的产物；(d)活化步骤(c)产物的游离羧基；(e)用摩尔过量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(d)的产物；和(f)任选使用式HOOC-X-COOH的二酸衍生物和式NH2-Y-NH2的二胺重复步骤(c)-(e)，其中所述X和Y取代基与在任何前面所述氨解和酰化步骤中所用的X和Y取代基相同或不同。
44.权利要求43的方法，其中Q为含可裂解部分的连接基或通过含可裂解部分的连接基与载体结合的目标分子，所述方法还包括裂解所述可裂解部分而从载体上释放精确长度的水溶性有机聚酰胺基链。
45.权利要求43的方法，其中X和Y取代基中的一个或多个为对称基团。
46.权利要求43的方法，其中X和Y取代基中的至少一个包含1到5个-CH2CH2O-基团。
47.权利要求43的方法，其中所述二价有机基团选自取代、未取代、分支和线性、脂族和芳族基团，并可任选含有杂原子。
48.权利要求47的方法，其中所述二价有机基团选自苯基、C1-C10亚烷基部分、C1-C10烷基基团，任选含杂原子，或其组合。
49.权利要求48的方法，其中所述二价有机基团选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
50.权利要求43的方法，其中所述链具有下式-{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}-。
51.权利要求43的方法，其中所述链具有下式-[{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO]--{NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}]z--NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-其中z为一个1-49的整数。
52.权利要求43的方法，其中所述游离羧基用一种活化剂活化，所述活化剂选自碳酰二咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。
53.合成具有精确数目重复单元的水溶性有机聚酰胺基链的方法，这种链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-式中n为1-100的整数；和X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；该方法包括下面的步骤(a)用摩尔过量的式HOOC-X-COOH的二酸衍生物酰化式Z-O载体化合物的氨基或羟基，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；所述载体为固相、基体或表面；(b)活化步骤(a)产物的游离羧基；(c)用摩尔过量的式NH2-Y-NH2的二胺氨解步骤(b)的产物；和(d)任选使用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2重复步骤(a)-(c)，其中所述X和Y取代基与在任何前面所述的酰化和氨解步骤中所用的X和Y取代基相同或不同。
54.权利要求53的方法，其中Q为含可裂解部分的连接基或通过含可裂解部分的连接基与载体结合的目标分子，所述方法还包括裂解所述可裂解部分而从载体上释放精确长度的水溶性有机聚酰胺基链。
55.权利要求53的方法，其中X和Y取代基中的一个或多个为对称基团。
56.权利要求53的方法，其中X和Y取代基中的至少一个包含1到5个-CH2CH2O-基团。
57.权利要求53的方法，其中所述二价有机基团选自取代、未取代、分支和线性、脂族和芳族基团，并可任选含有杂原子。
58.权利要求57的方法，其中所述二价有机基团选自苯基、C1-C10亚烷基部分、C1-C10烷基基团，任选含杂原子，或其组合。
59.权利要求58的方法，其中所述二价有机基团选自-(CH2)2-、-(CH2)6-、-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-、-[(CH2)3-O-(CH2)2-(CH2)2-O-(CH2)3]-、-CH2-O-CH2-和-CH2-N(CH3)-CH2-。
60.权利要求53的方法，其中所述链具有下式-{NH-CH2-(CH2CH2O)3-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
61.权利要求53的方法，其中所述链具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
62.权利要求53的方法，其中所述链具有下式-{NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO--NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO}n-。
63.权利要求53的方法，其中所述游离羧基用一种活化剂活化，所述活化剂选自碳酰二咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。
64.一种可用于合成具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链的试剂盒，所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；所述试剂盒包括(a)Z-Q-载体，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；并且所述载体为固相、基体或表面；(b)具有下式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物；和(c)具有下式NH2-Y-NH2的二胺。
65.权利要求64的试剂盒，包括至少一种具有下式HOOC-X-COOH的其它二酸，其中X取代基与第一种二酸或其衍生物的X取代基不同。
66.权利要求64的试剂盒，包括至少一种具有下式NH2-Y-NH2的其它二胺，其中Y取代基与第一种二胺中的Y取代基不同。
67.权利要求64的试剂盒，还包括一种选自碳酰二咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐的活化剂。
68.一种用于增强或修饰目标分子的试剂盒，包括(a)用于合成具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链的试剂，所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；和Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；包括(i)Z-Q-载体，其中Z为H2N-或HO-；Q为连接基或目标分子；并且所述载体为固相、基体或表面；(ii)具有下式HOOC-X-COOH的二酸或其衍生物，其中X为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(iii)具有下式NH2-Y-NH2的二胺，其中Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(b)其性能有待修饰或增强，并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子。
69.权利要求68的试剂盒，其包括至少一种具有下式HOOC-X-COOH的其它二酸，其中X取代基与第一种二酸或其衍生物的X取代基不同。
70.权利要求68的试剂盒，其还包括至少一种具有下式NH2-Y-NH2的其它二胺，其中Y取代基与第一种二胺的Y取代基不同。
71.权利要求68的试剂盒，其还包括一种选自碳酰二咪唑、二琥珀酰亚胺基碳酸酯和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐的活化剂。
72.权利要求68的试剂盒，其中所述目标分子选自蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质体和治疗剂。
73.权利要求72的试剂盒，其中所述目标分子是一种选自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽。
74.一种用于增强或修饰目标分子的试剂盒，其包括(a)具有精确数量重复单元的水溶性有机聚酰胺基链，所述链具有下式-{NH-Y-NH-CO-X-CO}n-{NH-Y’-NH}n’-式中n为1-100的整数；n’为0或1；X和Y为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在并相同或不同，并且随每个所述重复单元可各不相同；和Y’为无反应性官能基的二价有机基团或者不存在；和(b)其性能有待修饰或增强，并且具有任选的二价间隔基或连接基的目标分子。
75.权利要求74的试剂盒，其中所述目标分子选自蛋白质、多肽、肽、核酸、脂质体和治疗剂。
76.权利要求75的试剂盒，其中所述目标分子是一种选自-GGLYACHMGPMTWVCQPLRG-(SEQ ID NO1)；-SVWRWLPYDKYE-(SEQ ID NO3)；和-ADGACRNPWC-(SEQ IDNO6)的肽。
全文摘要
本发明提供了精确长度的链及其制备方法。这些链通过二酸的衍生物和二胺在载体上以分步方式反应形成。所述反应剂之一包含水溶性低聚物,优选聚乙二醇。这些链然后可用于化学修饰目标大分子诸如生物学上重要的多肽。
文档编号C07K17/08GK1330675SQ99812465
公开日2002年1月9日 申请日期1999年8月23日 优先权日1998年8月28日
发明者K·罗斯 申请人:格莱风科学公司