专利名称：一种灵芝多糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灵芝多糖的制备方法，尤其涉及一种灵芝大分子多糖的制备方法。
背景技术：
从灵芝中分离提取水溶性多糖目前普遍采用乙醇分步沉淀法，易于大规模生产，其主要原理是通过降低水溶液的介电常数使多糖脱水，从而产生沉淀来达到分离多糖的目的，适用于大多数水溶性多糖，但得到的多糖杂质多，有效成分含量低，特异性不高。如进一步采用不同浓度的乙醇分步沉淀来纯化，选择性较差，回收率低，得到多糖含量在30％左右，且是多糖的混合物，同时要使用大量的有机溶剂，提高了成本。另外，也有一些实验室的研究，水提物通过去除蛋白和透析后得到灵芝多糖，但工艺复杂，需要加入氯仿和正丁醇等有机溶剂，不易成为工业化生产。
灵芝大分子多糖成分的免疫调节的作用已有大量的研究报道，并可通过提高机体的免疫功能而达到抗癌作用，是抗癌作用的有效成分。但往往一种植物或真菌中含有多种多糖成分，分子量的大小也各不相同，其活性也各不相同，灵芝中也含有不同的分子量段的多糖成分，为提高多糖的效果，须将无活性或活性不高的成分去除，富集有活性的多糖部分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵芝大分子多糖的制备方法，以克服现有技术中提取的多糖纯度低、特异性不高、难以工业化生产的缺点。
本发明的原理是将灵芝提取物中有活性的多糖部分用合适的超滤膜来富集的原理，去除没有活性的多糖成分。
本发明的提供的一种灵芝大分子多糖的制备方法，包括如下步骤
1.灵芝的粗提以灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，加入5-15倍重量的水中，常温浸泡10-60分钟，加热至60-100℃，保持此温度60-120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取1-2次，合并滤液。
2.灵芝粗提液的粗滤滤液用50-200目的滤网粗滤，再用100微米的膜过滤。
3.灵芝滤出液超滤使用超滤膜进行超滤，超滤膜的分子量截留值为50万道尔顿，压力低于0.3Mpa，滤液被分为二部分，大于50万分子量的部分和小于50万分子量的部分。
4.干燥大于50万分子量的部分直接干燥，即获得所需的大分子多糖。
通过上述制备方法可获得质量稳定、有效成份含量高、且平均分子量被严格控制在大于50万道尔顿的灵芝多糖成分，本方法不仅保持了多糖的抗肿瘤活性，而且灵芝多糖的含量得到提高，多糖含量超过50％。所以本制备方法是一种简便、快速、高效、成本低、无污染、多糖纯度高的适合工业生产的方法。
制备所得的大分子灵芝多糖的生物活性检测根据Stanley报道的方法，选择8～10周龄、体重(28±1)g的Balb/c小鼠，处死，抽取小鼠大腿、小腿骨中的骨髓，分散后培养于含10％L929细胞培养上清(L929细胞株培养3d后，去除细胞的培养基)的完全DMEM培养基中。3d后，去除贴壁的细胞，将非贴壁细胞置于添加10％L929细胞培养上清的完全DMEM培养基中。继续培养3d后，去除非贴壁的细胞，收集贴壁的细胞，即为小鼠骨髓来源的巨噬细胞。小鼠巨噬细胞激活率测定将1×105个/mL的巨噬细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加入180μL，并加入样品20μL。于37℃、5％的CO2条件下培养3天，加入20μL AlamarBlue试剂，再培养6hr，用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对巨噬细胞的激活率。计算公式为巨噬细胞激活率(％)＝[80856×Aλ570(样品)-11726×Aλ600(样品)]/[80856×Aλ570(对照)-11726×Aλ600(对照)]×100％。
分子量大于50万部分对小鼠巨噬细胞激活率大于200％，可明显增强巨噬细胞的吞噬能力，从而增强机体的抗肿瘤能力。
多糖含量的检测用苯酚-浓硫酸法，精密称取本品0.5g置100ml烧杯中，加水约80ml，煮沸提取1小时后冷却至室温，加入100ml容量瓶中。用水稀释至刻度，摇匀，再稀释25倍。精密吸取样品1.0ml，置15ml试管中，分别加入苯酚-硫酸试剂，在490nm处测定吸收度A。以葡聚糖为标准品计算总糖的含量，并用DNS测定还原糖含量，多糖的含量等于总糖减还原糖。分子量大于50万部分的多糖含量大于50％以上。
具体实施例方式实施例11.灵芝的粗提以灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，加入5倍重量的水中，常温浸泡60分钟，加热至60℃，保持此温度60分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取一次，合并滤液。
2.灵芝粗提液的粗滤滤液用100目的滤网粗滤，再用100微米的膜过滤。
3.灵芝滤出液超滤使用超滤膜进行超滤，超滤膜的分子量截留值为50万道尔顿，压力低于0.3Mpa，滤液被分为二部分，大于50万分子量的部分和小于50万分子量的部分。
4.干燥大于50万分子量的部分喷雾干燥，即获得所需的多糖。
制备的多糖对小鼠巨噬细胞激活率为320％。多糖含量为55％。
实施例21.灵芝的粗提以灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，加入10倍重量的水中，常温浸泡30分钟，加热至70℃，保持此温度60分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取一次，合并滤液。
2.灵芝粗提液的粗滤滤液用200目的滤网粗滤，再用100微米的膜过滤。
3.灵芝滤出液超滤使用超滤膜进行超滤，超滤膜的分子量截留值为50万道尔顿，压力低于0.3Mpa，滤液被分为二部分，大于50万分子量的部分和小于50万分子量的部分。
4.干燥大于50万分子量的部分直接冷冻干燥，即获得所需多糖。
制备的多糖对小鼠巨噬细胞激活率为290％。多糖含量为53％。
权利要求
1.一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤①灵芝的粗提以灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，加入5-15倍重量的水中，常温浸泡10-60分钟，加热至60-100℃，保持此温度60-120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取1-2次，合并滤液。②灵芝粗提液的粗滤滤液用50-200目的滤网粗滤，再用100微米的膜过滤。③灵芝滤出液超滤使用超滤膜进行超滤，超滤膜的分子量截留值为50万道尔顿，压力低于0.3Mpa，滤液被分为二部分，大于50万分子量的部分和小于50万分子量的部分。④干燥大于50万分子量的部分直接干燥，即获得所需的大分子多糖。
全文摘要
本发明提供了一种灵芝大分子多糖的制备方法，该方法包括对灵芝进行粗提、粗滤、超滤和干燥四个步骤，该制备方法可以得到分子量大于50万的灵芝大分子多糖，多糖含量超过50％，而且抗肿瘤活性和免疫增强活性增强。
文档编号C08B37/00GK1618819SQ20041006730
公开日2005年5月25日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者唐庆九, 张劲松, 杨焱, 贾薇, 刘艳芳, 唐传红 申请人:上海市农业科学院