专利名称：一种骨胶原凝胶液的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程领域，是一种为进行双相接种法构建组织工程骨而制备骨胶原的方法，特别是一种骨胶原凝胶液的制备方法。
背景技术：
临床工作中，多种疾病的治疗如骨不连、骨缺损及各种骨融合手术均需要使用骨移植材料。目前，供临床使用的骨移植材料种类很多，均存在不同程度的缺陷，因此，目前尚无理想的骨移植材料来源。组织工程的兴起和发展为研制新型的、具有良好成骨活性的骨移植材料提供了新的思路和技术方法。经过十余年的发展，骨组织工程在各主要环节取得了巨大进步。然而，在种子细胞与支架材料复合进行组织构建时，种子细胞接种效率低下，严重影响了组织工程骨的质量并造成种子细胞的大量浪费，是目前亟待解决的技术难题。有研究应用鼠尾胶原进行种子细胞双相接种即先将种子细胞在适当条件下与胶原凝胶液均匀混合，在胶原凝聚前将混合物与组织工程支架复合，从而获得了极高的种子细胞上架率，构建成功了具有良好属性的组织工程软骨。但是，鼠尾胶原来源有限，并且存在伦理学障碍，难以应用于临床，因此需要寻找一种来源丰富、成凝胶性好、有利于组织工程骨成熟的胶原凝胶来源。
胶原是脊椎动物和人体主要的结构蛋白，占人体蛋白质总量的25-30％，广泛分布于骨骼、肌腱、皮肤、血管等各种组织和器官中。胶原的种类很多，其中I、II、III和IV型是最常用的四种胶原。有研究表明I型胶原对成骨细胞增殖及表型的表达具有促进作用，而其它类型的胶原是否对成骨产生负面影响目前尚不得而知。目前在各领域中应用的胶原主要来源于皮肤、肌腱等组织，但这些组织中除含有大量非胶原性成分外尚含有其它多种胶原成分，不易纯化，提取成本高。骨组织是一个巨大的胶原库，其胶原成分主要是I型胶原，并且含量高，占骨有机成分的90％以上。同时骨胶原来源于骨，且来源丰富，理论上其成分对成骨应无不利影响，因此骨是获得进行组织工程骨构建所需胶原凝胶液的较为理想的来源。
但是，与其它组织不同的是，骨胶原的交联程度高，常用的酸溶解法、中性盐法难以提取。碱溶法可用于提取骨胶原，有文献Kemp，GD.Tristram，GR.The preparation of an alkali-collagen fromdemineralized bone.Biochem J，1971，124(5)915-919.其技术特征是将脱钙骨基质用5％NaOH20℃条件下作用48小时，然后用盐酸将混合物的PH值调至4.0，有大量絮状沉淀产生，经过离心、溶解、盐析、透析、冻干等过程获得胶原。但是碱溶法提取的骨胶原，其溶液粘度低，成凝胶性差，在骨组织构建中应用受到很大限制。
发明内容
本发明的目的在于克服前述现有技术的不足，提供一种操作简单，提取效率高，胶原纯度高，成凝胶性好的骨胶原凝胶液的制备方法。
本发明采用了这样的技术方案一种骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于采用如下的制备工艺步骤1)脱钙骨基质粉的制备；2)脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除；3)去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性；4)胶原蛋白变性后的脱钙骨基质的胶原蛋白酶解；5)胶原蛋白纯化；6)凝胶液制备。
脱钙骨基质粉的制备是取新鲜动物长骨，去除周围软组织及骨膜、骨端松质骨，刮除骨髓，然后将皮质骨辟成碎块，经清水冲冼后，加入1∶1的甲醇-氯仿脱脂12-72小时，再加入摩尔浓度为0.1-1.0M的盐酸脱钙3-14天，经三蒸水漂洗后，再次经1∶1的甲醇-氯仿脱脂12-72小时，经组织粉碎机将已软化的皮质骨块搅碎成脱钙骨基质粉，风干备用。
脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除是取5份脱钙骨基质粉，加入150-250份浓度为0.01％-0.2％的NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用12-72小时，然后取出过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤。
去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性是将去除非胶原杂质后的脱钙骨基质粉加入50-100份含有摩尔浓度为2.0-6.0M的盐酸胍且PH值为7.4的Tris-HCl溶液中，置于4℃冰箱中作用12-72小时，然后取出过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤去除盐酸胍。
胶原蛋白变性后的脱钙骨基质粉的胶原蛋白酶解是将经胶原蛋白变性后的脱钙骨基质加入200份-800份摩尔浓度为0.1-1.0M的醋酸溶液中，再加入0.05-2份胃蛋白酶，置于磁力搅拌器上，在5℃-25℃环境中连续搅拌24-96小时，获得脱钙骨基质液。
胶原蛋白的纯化是将经过胶原蛋白酶解的脱钙骨基质液在2-10℃温度下，在转速为6000-20000rpm的离心机上离心10-60分钟后，取其上清液，在上清液中加入NaCl晶体使上清液浓度达2M，在有大量紫状沉淀产生时，再次在前述相同条件下离心，取沉淀物，加入100-200份摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶解并装入透析袋，在摩尔浓度为10-20mM的Na2HPO4溶液中透析2-24小时灭活胃蛋白酶，再放入摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶液中透析24-72小时后，再重复上述盐析、离心、溶解、透析操作一次，获得的粘性胶原凝胶液装入烧杯中冻干，取得纯化的冻干骨胶原。
凝胶液制备及固化是将冻干骨胶原用摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶解，制成浓度为0.1-10％的骨胶原凝胶液。
本发明针对影响胶原溶解的两个主要环节交联的程度及其位置；特异性非胶原蛋白成分的存在而设计，首先用低浓度碱将特异性非胶原蛋白成分去除，再应用胃蛋白酶选择性切断交联集中分布的胶原分子两端的非螺旋区，从而使骨胶原由不溶变为可溶。方案中加入盐酸胍这一强蛋白变性剂，通过其与胶原分子的氨基酸侧链间形成氢键来破坏胶原分子间形成的氢键，并且阻断胶原分子间疏水键的作用，从而增强骨胶原的可溶解性，提高骨胶原的提取效率。本发明具有操作简便，提取效率高，胶原纯度高，成凝胶性好等优点。
具体实施例方式
下面将本发明应用于猪骨胶原的提取，来说明本发明的实施方案。一种骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于采用如下的制备工艺步骤1)脱钙骨基质粉的制备；2)脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除；3)去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性；4)胶原蛋白变性后的脱钙骨基质的胶原蛋白酶解；5)胶原蛋白纯化；6)凝胶液制备。
脱钙骨基质粉的制备取新鲜猪长骨，去除周围软组织及骨膜、骨端松质骨，刮除骨髓，然后将皮质骨劈成碎块，大量清水冲洗后，加入1∶1的甲醇-氯仿中脱酯24小时，再加入摩尔浓度为0.6M的盐酸脱钙8天(每48小时更换脱钙液一次)，大量三蒸水漂洗后，再次用1∶1的甲醇-氯仿脱酯24小时，组织粉碎机将已软化的皮质骨块搅碎成脱钙骨基质粉，风干备用。
脱钙骨基质粉的非胶原性杂质的去除称取5.0克脱钙骨基质粉，加入150克浓度为0.1％NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用24小时，然后过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤。
去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉加入100克含摩尔浓度为4.0M盐酸胍且PH值为7.4的Tris-HCl的溶液中，置于4℃冰箱中继续作用24小时，然后过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤去除盐酸胍。
胶原蛋白变性后的脱钙骨基质的胶原蛋白酶解经胶原蛋白变性后的脱钙骨基质加入500克摩尔浓度为0.5M的醋酸溶液中，再加入0.5克胃蛋白酶(Sigma公司)，置于磁力搅拌器上，在10℃-20℃环境中连续搅拌48小时，获得脱钙骨基质液。
胶原蛋白的纯化经过胶原蛋白酶解后的脱钙骨基质液在4℃、10000rpm条件下离心20分钟，取上清液加入NaCl晶体使其浓度达到2M，此时有大量紫状沉淀产生，再次在前述相同条件下离心，取沉淀物，加入100克浓度为0.5M冰醋酸溶解并装入透析袋，在浓度为20mM的Na2HPO4溶液中透析8小时灭活胃蛋白酶，再放入浓度为0.175M冰醋酸溶液中透析48小时(每8小时更换一次透析液)，重复上述盐析、离心、溶解、透析操作一次，最后得粘性胶原溶液，将胶原溶液装入大烧杯中冻干，最后得纯化的冻干骨胶原。
凝胶液制备将冻干骨胶原用摩尔浓度为0.5M冰醋酸溶解，得浓度为4％的骨胶原凝胶液。将该胶原凝胶液置入冰浴中，用浓度为1M的NaOH和0.1M的NaOH将溶液的PH值调节至7.35-7.45，然后迅速加入到六孔板中，置37℃水浴中孵育30分钟，形成胶原凝胶。
权利要求
1.一种骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于采用如下的制备工艺步骤1)脱钙骨基质粉的制备；2)脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除；3)去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性；4)胶原蛋白变性后的脱钙骨基质的胶原蛋白酶解；5)胶原蛋白纯化；6)凝胶液制备。
2.按权利要求1所述的骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于所说的脱钙骨基质粉的制备是取新鲜动物长骨，去除周围软组织及骨膜、骨端松质骨，刮除骨髓，然后将皮质骨辟成碎块，经清水冲冼后，加入1∶1的甲醇-氯仿脱脂12-72小时，再加入摩尔浓度为0.1-1.0M的盐酸脱钙3-14天，经三蒸水漂洗后，再次经1∶1的甲醇-氯仿脱脂12-72小时，经组织粉碎机将已软化的皮质骨块搅碎成脱钙骨基质粉，风干备用。
3.按权利要求1所述的骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于所说的脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除是取5份脱钙骨基质粉，加入150-250份浓度为0.01％-0.2％的NaOH溶液，置于4℃冰箱中作用12-72小时，然后取出过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤。
4.按权利要求1所述的骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于所说的去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性是将去除非胶原杂质后的脱钙骨基质粉加入50-100份含有摩尔浓度为2.0-6.0M的盐酸胍且PH值为7.4的Tris-HCl溶液中，置于4℃冰箱中作用12-72小时，然后取出过滤，过滤剩余物用三蒸水反复洗涤去除盐酸胍。
5.按权利要求1所述的骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于所说的胶原蛋白变性后的脱钙骨基质粉的胶原蛋白酶解是将经胶原蛋白变性后的脱钙骨基质加入200份-800份摩尔浓度为0.1-1.0M的醋酸溶液中，再加入0.05-2份胃蛋白酶，置于磁力搅拌器上，在5℃-25℃环境中连续搅拌24-96小时，获得脱钙骨基质液。
6.按权利要求1所述的骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于所说的胶原蛋白的纯化是将经过胶原蛋白酶解的脱钙骨基质液在2-10℃温度下，在转速为6000-20000rpm的离心机上离心10-60分钟后，取其上清液，在上清液中加入NaCl晶体使上清液浓度达2M，在有大量紫状沉淀产生时，再次在前述相同条件下离心，取沉淀物，加入100-200份摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶解并装入透析袋，在摩尔浓度为10-20mM的Na2HPO4溶液中透析2-24小时灭活胃蛋白酶，再放入摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶液中透析24-72小时后，再重复上述盐析、离心、溶解、透析操作一次，获得的粘性胶原凝胶液装入烧杯中冻干，取得纯化的冻干骨胶原。
7.按权利要求1所述的骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于凝胶液制备是将冻干骨胶原用摩尔浓度为0.1-1.0M的冰醋酸溶解，制成浓度为0.1-10％的骨胶原凝胶液。
全文摘要
本发明涉及生物医学工程领域，是一种为进行双相接种法构建组织工程骨而制备骨胶原的方法，特别是一种骨胶原凝胶液的制备方法，其特征在于采用如下的制备工艺步骤1)脱钙骨基质粉的制备；2)脱钙骨基质粉的非胶原杂质的去除；3)去除非胶原杂质的脱钙骨基质粉的胶原蛋白变性；4)胶原蛋白变性后的脱钙骨基质的胶原蛋白酶解；5)胶原蛋白纯化；6)凝胶液制备。本发明具有操作简单，提取效率高，胶原纯度高，成凝胶性好的优点。
文档编号C08H1/06GK1763135SQ200510057329
公开日2006年4月26日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者周强, 吕仁发, 许建中, 王序全 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院