专利名称：以l-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质亲和沉淀技术领域，更具体地，涉及再生型亲和沉淀剂技术领域，特别是指以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物。
背景技术：
亲和配基能识别生物大分子，特别是酶和抗体等蛋白质，并且能专一性地与亲和对象该物质的分子相结合，亲和配基一般通过多种作用力类型(如范德华相互作用、静电相互作用、氢键和疏水相互作用等)与生物大分子特异性结合。在实际应用过程中，考虑到配基选择的各项要求，比如特异性、安全性和高效性等等，亲和配基的选择在亲和沉淀的过程中显得至关重要。当环境参数如pH、温度、离子强度和盐度等发生改变，或存在特定离子、有机溶剂以及带相反电荷的聚电解质 时，许多大分子聚合物的溶解状态会发生可逆性的改变，这些物质就称之为可逆溶解聚合物。亲和沉淀是在可逆溶解聚合物上连接配基，以专一性地结合目标蛋白，结合完成后，改变条件(PH值、温度、离子强度或加入某种试剂)，使该聚合物沉淀，与水溶液分离。然后再改变操作条件使目标蛋白从聚合物-配基复合物上洗脱下来，聚合物重新溶解循环使用。由于亲和沉淀过程中，目标分子与配基的亲和作用是在水溶性状态下进行，传质阻力小，吸附速度快，因此适合在分离过程的初期使用，有利于减少分离步骤，提高产率，降低成本。然而一般能用于亲和沉淀的可逆溶解聚合物数量很少，且存在着难以回收再利用的问题，增加了分离成本，从而影响了亲和沉淀技术的应用。因此，解决载体循环使用问题成为技术关键。可逆溶解聚合物的回收条件必须与有利于生物分子稳定性及活性的保持，且需价格低廉，易于得到。另外，回收聚合物还存在回收率不高导致其循环使用的次数大大降低。因此，研发用于亲和沉淀生物分子、既能保持生物大分子的稳定性及活性，又可循环使用的聚合物成为本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂及制备方法和应用以及相关再生型聚合物，该再生型亲和沉淀剂采用专一的、安全的和高效的亲和配基连接到溶解可逆聚合物上形成，进行亲和沉淀，其回收率高，产率提高，从而大大降低工业成本，利于亲和沉淀技术的推广，适于大规模推广应用。为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种pH响应再生型亲和沉淀齐 ，其特点是，包括pH敏感溶解可逆聚合物P_N和亲和配基，所述pH敏感溶解可逆聚合物Pmmdn的粘均分子量为7.25X 104g/mol,等电点为4.5,由式(2)所示化合物、式(3)所示化合物、式(4)所示化合物和式(5)所示化合物经无规共聚而得到，其中式(2)所示化合物、式
(3)所示化合物、式(4)所示化合物和式(5)所示化合物的投料摩尔比为58:24:19:6，所述亲和配基为式(I)所示化合物并通过式(8)所示化合物连接所述pH敏感溶解可逆聚合物Pma而成所述PH响应再生型亲和沉淀剂，
权利要求
1.一种pH响应再生型亲和沉淀剂，其特征在于，包括pH敏感溶解可逆聚合物Pmbn和亲和配基，所述PH敏感溶解可逆聚合物Pmbn的粘均分子量为7.25X 104g/mol，等电点为4.5，由式(2)所示化合物、式(3)所示化合物、式(4)所示化合物和式(5)所示化合物经无规共聚而得到，其中式(2)所示化合物、式(3)所示化合物、式(4)所示化合物和式(5)所示化合物的投料摩尔比为58:24:19:6，所述亲和配基为式(I)所示化合物并通过式(8)所示化合物连接所述pH敏感溶解可逆聚合物Pmmdn而成所述pH响应再生型亲和沉淀剂，
2.一种制备根据权利要求1所述的PH响应再生型亲和沉淀剂的方法，其特征在于，将所述式(2)所示化合物、所述式(3)所示化合物、所述式(4)所示化合物和所述式(5)所示化合物按投料摩尔比为58:24:19:6加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到所述pH敏感溶解可逆聚合物Pmmdn,接着所述pH敏感溶解可逆聚合物Pmmdn结合所述式(8)所示化合物,然后所述式(8)所示化合物连接所述式(I)所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，合成pH敏感溶解可逆聚合物P_N所述溶剂为去无水乙醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在60°C的温度、转速为200rpm的条件下振荡反应24小时进行；所述结合在lmol/L氢氧化钠中，在反应温度为40°C、转速为200rpm条件下振荡反应2小时进行；所述连接在反应温度为.60°C、转速为200rpm条件下振荡反应24小时进行。
4.一种PH敏感溶解可逆聚合物P_N，其特征在于，所述pH敏感溶解可逆聚合物Pmbn的粘均分子量为7.25X 104g/mol,等电点为4.5,由式(2)所示化合物、式(3)所示化合物、式(4)所示化合物和式(5)所示化合物经无规共聚而得到，其中式(2)所示化合物、式(3)所示化合物、式(4)所示化合物和式(5)所示化合物的投料摩尔比为58:24:19:6,
5.一种温度响应再生型亲和沉淀剂，其特征在于，包括温度敏感溶解可逆聚合物Pnbn和亲和配基，所述温度敏感溶解可逆聚合物Pnbn的粘均分子量为2.9X 104g/mol，最低临界温度为31.1°C，由式(5)所示化合物、式(6)所示化合物和式(7)所示化合物经无规共聚而得到，其中式(5)所示化合物、式(6)所示化合物和式(7)所示化合物的投料摩尔比为5:4:.70，所述亲和配基为式(I)所示化合物并通过式(8)所示化合物连接所述温度敏感溶解可逆聚合物Pnbn而成所述温度响应再生型亲和沉淀剂，
6.一种制备根据权利要求5所述的温度响应再生型亲和沉淀剂的方法，其特征在于，将所述式(5 )所示化合物、所述式(6 )所示化合物和所述式(7 )所示化合物按投料摩尔比为5:4:70加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到所述温度敏感溶解可逆聚合物PNBN，接着所述式(8 )所示化合物连接所述式(I)所示化合物，然后所述式(8 )所示化合物结合所述温度敏感溶解可逆聚合物P 。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，合成温度敏感溶解可逆聚合物Pnbn所述溶剂为去无水乙醇，所述引发剂为偶氮二异丁腈，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在60°C的温度、转速为200rpm的条件下振荡反应24小时进行；所述连接在lmol/L氢氧化钠中，在反应温度为60°C、转速为200rpm条件下振荡反应24小时进行；所述结合在反应温度为40°C、转速为200rpm条件下振荡反应2小时进行。
8.一种温度敏感溶解可逆聚合物PNBN，其特征在于，所述温度敏感溶解可逆聚合物Pnbn的粘均分子量为2.9X104g/mol，最低临界温度为31.1°C，由式(5)所示化合物、式(6)所示化合物和式(7)所示化合物经无规共聚而得到，其中式(5)所示化合物、式(6)所示化合物和式(7)所示化合物的投料摩尔比为5:4:70,
9.式(I)所示化合物在亲和沉淀中作为亲和配基的应用，
10.根据权利要求1所述的pH响应再生型亲和沉淀剂或根据权利要求5所述的温度响应再生型亲和沉淀剂在纯化血清白蛋白、谷氨酰胺转氨酶及溶菌酶中的应用。
全文摘要
本发明涉及pH响应再生型亲和沉淀剂，包括pH敏感溶解可逆聚合物PMMDN和亲和配基，PMMDN的粘均分子量为7.25×104g/mol，等电点为4.5，由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸甲酯和羟甲基丙烯酰胺经无规共聚而得到；亲和配基L-甲状腺素通过环氧氯丙烷连接PMMDN，还涉及温度响应再生型亲和沉淀剂，其中载体为温度敏感溶解可逆聚合物PNDN，粘均分子量为2.9×104g/mol，最低临界温度为31.1℃，由异丙基丙烯酰胺、丙烯酸丁酯和羟甲基丙烯酰胺经无规共聚而得到。本发明的以L-甲状腺素为亲和配基的再生型亲和沉淀剂纯化效率高，回收率高，大大降低工业成本，利于亲和沉淀技术的推广，适于大规模推广应用。用于纯化人血清白蛋白，溶菌酶及谷氨酰胺转氨酶，产品纯度可达到电泳纯。
文档编号C08F220/58GK103113509SQ201310037649
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者曹学君, 丁兆阳 申请人:华东理工大学