5-羟甲基和5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸四钠盐的合成方法技术领域本发明涉及一种5-羟甲基及5-醛基-2′-脱氧胞苷三磷酸四钠盐的新型高效合成方法。技术背景在真核生物基因组中，2′-脱氧胞苷可以通过甲基转移酶进行甲基化。这种甲基化过程是转录基因沉默中最重要的表观遗传标记之一。在特定环境下，DNA甲基化有助于脱氧胞苷碱基修复，同时也增进了细胞发育过程中基因表达的动态灵活性。研究表明5-甲基-2′-脱氧胞苷可以在TET氧化酶的作用下生成5-羟甲基、5-醛基和5-羧基-2’-脱氧胞苷系列氧化衍生物。这三种核苷氧化物被认为参与了细胞表观基因程序调控中去甲基化过程。近年来，寡聚核酸被广泛用于研究这种表观基因程序调控。然而，传统固相方法在合成含有5位修饰2’-脱氧胞苷的寡聚核酸中步骤繁琐，产率极低。而基于聚合酶链反应（PCR）的新方法在合成包含5-羟甲基、5-醛基和5-羧基-2’-脱氧胞苷的长链寡聚核酸片段时弥补了传统方法的不足。但是，在PCR技术中使用的5-羟甲基和5-醛基-2’-脱氧胞苷等三磷酸酶底物的化学合成仍是一个未解决的难题。目前，5-羟甲基-2’-脱氧胞苷三磷酸化学合成尚未见报道。5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸的化学合成有两种方法。第一种是以价格昂贵的5-醛基-2’-脱氧胞苷为原料，经单磷酸化得到5-醛基-2’-脱氧胞苷单磷酸，进而在磺酰甲基咪唑盐缩合试剂作用下与焦磷酸盐缩合得到三磷酸盐产物，总产率仅为20%，而且产物含有大量多聚磷酸盐杂质。第二种是利用5-甲基-2’-脱氧胞苷三磷酸在紫外照射条件下由甲萘醌氧化得到5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸盐，产率为77%。但是该方法中5-甲基-2’-脱氧胞苷三磷酸原料不易得，且光反应需要特殊的设备，条件不易控制。因此，建立通用、简单和高效的5-羟甲基和5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸盐合成方法具有重要的实际应用价值和意义。
技术实现要素：
本发明的目的是为5-羟甲基和5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸四钠盐的化学合成提供一种实用和高效的方法。本发明涉及的5-羟甲基和5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸四钠盐的合成包括以下五个步骤：步骤一）3’-叔丁基二甲基硅基（TBS）-5-乙酰氧基甲基-2’-脱氧胸苷（3）与三氯氧磷反应，随后三氟乙酸/水脱除TBS保护基，碳酸钾/甲醇/水脱除乙酰基得到5-羟甲基-2’-脱氧胞苷单磷酸三乙胺盐，连续三步总产率64%；步骤二）以2,2’-二巯基二苯胺/三苯基膦将5-羟甲基-2′-脱氧胞苷单磷酸与哌啶缩合得到5-羟甲基-2’-脱氧胞苷磷酰哌啶三乙胺盐（5），产率94%；步骤三）磷酰哌啶（5）与焦磷酸三（四丁基）铵盐在4,5-二氰基咪唑活化下得到5-羟甲基脱氧胞苷三磷酸四钠盐（1），产率72%；步骤四）用活化的二氧化锰对5-羟甲基-2’-脱氧胞苷磷酰哌啶（5）氧化得到5-醛基-2’-脱氧胞苷磷酰哌啶三乙胺盐（6），产率84%；步骤五）磷酰哌啶（6）与焦磷酸三（四丁基）铵盐在4,5-二氰基咪唑活化下得到5-醛基脱氧胞苷三磷酸四钠盐（2），产率76%。本发明专利与以往报道的方法相比，原料和试剂简单易得，方法易于操作，产物收率高。该方法对保护的5-羟甲基-2’-脱氧胞苷进行单磷酸化与缩合高效地得到5-羟甲基-2’-脱氧胞苷磷酰哌啶前体，经二氧化锰氧化进一步可得到5-醛基-2’-脱氧胞苷磷酰哌啶前体。在4,5-二氰基咪唑活化试剂的作用下，磷酰哌啶与焦磷酸高效偶联，三磷酸盐分离产率可达72–76%。反相HPLC分析表明由本方法合成得到的目标三磷酸盐纯度可达97%以上。因此，该新方法在5-羟甲基和5-醛基-2’-脱氧胞苷三磷酸的化学合成中具有很高的实际应用价值。...