近红外CdSexTe1‑x量子点荧光动物体内标记的方法及其用途与流程

近红外CdSexTe1-x量子点荧光动物体内标记的方法及其用途技术领域本发明属生物医学领域，涉及一种近红外CdSexTe1-x量子点荧光动物体内标记的方法及其用途。

背景技术：
胶原属于天然有机大分子，也是人体骨组织的主要成分之一，凭借其良好的生物相容性，机械强度和体内代谢速率，因在此组织工程尤其骨修复中应用最广泛，也是最具临床应用前景的生物材料之一。随着各式各样胶原蛋白或者胶原蛋白复合材料作为生物材料被广泛研究和临床应用，其生物体内相容性和安全性也受到越来越多的重视。因此，胶原蛋白相应体内研究的数据和结果对客观科学评价胶原蛋白生物材料的生物相容性和安全性以及后续临床应用起着至关重要的作用。由于近红外区域(光谱波段从700nm到1400nm)能最大限度的穿透组织进行深层组织成像，而且能区别于背景自身荧光干扰，被称为“生物观测的最佳窗口”(HilderbrandandWeissleder2011"Near-infraredfluorescence:applicationtoinvivomolecularimaging."Currentopinioninchemicalbiology14(1):71-79.)。2011年，哈佛大学的Natalie等首次报道通过近红外有机荧光染料标记生物材料聚乙二醇(PEG)在大鼠模型上成功实现近红外荧光光学成像(Artzi,Olivaetal.2011."Invivoandinvitrotrackingoferosioninbiodegradablematerialsusingnon-invasivefluorescenceimaging."Naturematerials10(9).)。随后，其他的近红外有机染料如酞菁锌和五甲川菁染料等也被用于标记生物材料进行近红外荧光成像(Lv,Caoetal.2012"ZincPhthalocyanineLabelledPolyethyleneGlycol:Preparation,Characterization,InteractionwithBovineSerumAlbuminandNearInfraredFluorescenceImaginginVivo."Molecules17(6):6348-6361.；Owens,Hyunetal.2013."Highlychargedcyaninefluorophoresfortraffickingscaffolddegradation."BiomedicalMaterials8(1):014109.)。但是，由于有机染料在生物体内长时间应用过程中存在荧光信号不稳定甚至淬灭的现象，有机染料并不适合作为长时间生物体内研究的荧光探针。目前对于胶原材料体内研究的技术手段仍比较单一。现阶段主要方式是利用动物模型，通过在固定时间节点处死动物模型后，将不同时间段的动物实验结果收集后进行统计分析，但是由于相关实验数据并不是来源于同一动物模型的连续观测结果，因此最终的实验结果并不能实时精确反映生物降解材料在体内降解与代谢的具体过程。目前，CdSexTe1-x三元合金量子点与传统有机染料相比，具有独特的优势，如量子产率高，光稳定性好，在生物复杂环境中不易被光漂白，同时组织穿透深度较大，能克服可见光量子点进行深层组织成像时易受机体自身荧光背景干扰的缺陷等，因此对深层组织和器官的检测具有更高的灵敏度和对比度，因此利用CdSexTe1-x量子点作为荧光探针,在生物成像研究领域的具有极大的应用前景。但是，目前仍没有利用CdSexTe1-x量子点标记胶原蛋白的相关文献和专利报道。

技术实现要素：
本发明的目的在于针对上述现有技术中的缺陷，提供一种近红外CdSexTe1-x量子点荧光动物体内标记的方法及其用途；尤其是一种胶原蛋白的近红外CdSexTe1-x量子点荧光标记方法及其在动物模型体内对胶原蛋白长时间动态成像的光学成像方法。本发明通过CdSexTe1-x量子点作为荧光探针，通过亲和作用形成CdSexTe1-x量子点标记胶原蛋白的复合材料，实现对胶原蛋白的荧光标记，然后利用配套的近红外动物活体成像仪对胶原蛋白在相应的动物模型进行实时动态观测。本发明的目的是通过以下技术方案实现：本发明涉及一种CdSexTe1-x量子点荧光标记胶原蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：A、在氮气保护的条件下，将10～50mMCdCl2水溶液与10～50mg/ml胶原蛋白溶液混合，加入NaOH调节pH值至10～14；每1mMCdCl2对应的胶原蛋白用量为1～5mg；B、加入10～100mMNaHSe溶液,反应0.5～2h；C、逐步加入20～200mMNaHTe溶液，在25℃～37℃搅拌反应15～45min，即得所述CdSexTe1-x量子点荧光标记胶原蛋白；所述NaHTe、NaHSe和CdCl2的摩尔比为2～4:1:1～2。具体可以是：在合适的反应条件，将10ml50mMCdCl2水溶液边搅拌边加入10ml50mg/ml胶原蛋白溶液，利用胶原蛋白的氨基酸基团与半导体金属离子交联结合，然后加入NaOH,将pH值调至碱性之后，并通过以蛋白晶体蔟为骨架逐渐加入新鲜制备的NaHTe溶液,当反应30分钟后，使体系中游离的Cd和Te离子结合，再逐步加入新鲜制备的NaHSe溶液，控制反应的温度和时间，反应一段时间，在氮气保护的条件下，得到荧光CdSexTe1-x量子点标记胶原蛋白，荧光发射峰在570nm～810nm之间。更优选NaHSe溶液浓度为20～50mM；NaHTe溶液浓度为10～20mM。优选地，所述CdSexTe1-x量子点，x为0.05～0.5，最大发射波长在570～810nm。包括但不限于CdSexTe1-x量子点单独或混合使用，用以作为荧光探针。优选地，步骤A中，所述混合的温度为25℃～37℃。优选地，步骤A中，所述pH值为12。优选地，步骤A中，所述CdCl2水溶液的浓度为50mM；所述胶原蛋白溶液的浓度为50mg/ml。优选地，步骤A中，所述胶原蛋白选自Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅲ型胶原、猪源胶原、牛源胶原、马源胶原中的一种或几种。优选地，步骤C中，搅拌反应后还包括分离纯化的步骤，具体为：通过高速离心或者超滤的方法，去除反应过程中过量的反应底物，再冷冻干燥得到纯化后的CdSexTe1-x量子点荧光标记胶原蛋白。优选地，所述的高速离心是指转速在14000～16000转/分钟或者13000～14000g的条件下，离心30～45min；所述的超滤方法为使用截留分子量在10,000mw以上的超滤膜进行超滤。本发明还涉及一种在动物体内光学成像观测的方法，在室温条件下，将前述方法制得的CdSexTe1-x量子点荧光标记胶原蛋白用缓冲液搅拌溶解，注射到动物模型体内，通过配套的动物活体近红外成像仪对胶原蛋白在动物体内进行相应的光学成像观测。优选地，所述缓冲液为生理盐水、超纯水和磷酸盐缓冲液...