一种用于抗厌氧菌药物的静态杀菌曲线的培养系统及其构建方法与流程

本发明属抗菌药物体外药效学技术领域，涉及用于抗厌氧菌药物药效研究的培养系统，具体涉及一种用于抗厌氧菌药物的静态杀菌曲线的培养系统及其构建方法。

背景技术：

现有技术公开了厌氧菌为一类在无氧或低氧环境下才能生长的细菌，其能量代谢主要依赖于无氧酵解方式；据报道，常见的引起人体感染的厌氧菌有：脆弱拟杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌等。目前临床治疗中，主要使用的抗厌氧菌药物为硝基咪唑类药物（如：甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等）。

此外，目前已知，静态杀菌曲线是以一种将特定浓度的抗菌药物加入到含一定浓度细菌的培养液中，通过在不同时间点取样并且进行菌落计数，将计数结果以10为底进行取对数，然后以该对数为纵坐标值，以时间点为横坐标值绘制曲线的研究方法；在该研究方法中通常药物浓度被设为最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）的倍比值如：1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC等；起始菌量通常被设定为1×10⁶CFU/ml左右；通过比较不同药物浓度情况下的杀菌效果以及观察每条杀菌曲线随时间的变化可分析抗菌药物杀菌过程与药物浓度、作用时间之间的关系，最终可为制定药物用药方案提供参考。

而由于厌氧的特殊生活习性使得针对厌氧菌的体外杀菌曲线研究难度较大；当前，厌氧菌杀菌曲线研究需要有厌氧箱（有内置摇床）等专用设备，其操作具有很大不便性。

本发明采用厌氧袋气体循环的方法在培养瓶中产生厌氧环境，避免了对厌氧箱及其辅助的厌氧气体钢瓶等设备的依赖，同时瓶盖上留有采样孔可供用注射器在培养瓶中取菌液进行菌落计数。

与本发明有关的参考文献：

1. Spangler SK, Jacobs MR, Appelbaum PC. Time-kill study of the activity of trovafloxacin compared with ciprofloxacin, sparfloxacin, metronidazole, cefoxitin, piperacillin and piperacillin/tazobactam agARnst six anaerobes[J]. Journal of antimicrobial chemotherapy, 1997, 39Suppl. B: 23-27.

2. White RL, Friedrich LV, Manduru M, et al. Comparative in vitro pharmacodynamics of imipenem and meropenem agARnst ATCC strARns of Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacteroides fragilis[J[. Diagnostic microbiology and infectious diseases, 2001, 39(1): 39-47.

3. Ibrahim, K.H., et al., Pharmacodynamics of pulse dosing versus standard dosing: in vitro metronidazole activity against Bacteroides fragilis and Bacteroides thetaiotaomicron. Antimicrob Agents Chemother, 2004,48(11): 4195-4199.

4. Yagi BH, Zurenko GE. An in vitro time-kill assessment of linezolid and anaerobic bacteria[J]. Anaerobe, 2003, 9(1): 1-3.。

技术实现要素：

本发明的目的是提供涉及用于抗厌氧菌药物药效研究的培养系统，具体涉及一种用于抗厌氧菌药物的静态杀菌曲线的培养系统及其构建方法。

本发明的用于抗厌氧菌药物的静态杀菌曲线的培养系统，其特征在于，主要由厌氧袋1、培养瓶2、搅拌器3、蠕动泵5和管路7组成；所述厌氧袋1与培养瓶2由管路7连接，所述管路7上设有蠕动泵5，所述培养瓶2放置在搅拌器3上面，所述培养瓶2上设有采样孔6，所述培养瓶2的内部放有一枚搅拌子4.；

本发明中，所述厌氧袋1可为1个或者多个串联形式；所述厌氧袋1在形体上为囊袋形式且有开口可用来填充厌氧剂，可通过夹闭密封，其形状可为任意形状；

本发明中，所述厌氧袋1上至少设有两个与所述管路7对接的接口（通过分路合并的形式囊袋上的接口可为任意个）；

本发明中，所述厌氧袋1通常采用软性材质制备，避免负压对培养系统造成影响；但在整个系统密闭性好的前提下所述厌氧袋1也可被其他刚性容器（如：玻璃瓶、金属瓶、硬质有机材料瓶等）所取代；

本发明中，所述培养系统运行中需要有闭合和气路循环，该气路特点在于串联了所述厌氧袋1与培养瓶2且首尾相连不与外界相通；气体循环通过所述蠕动泵5驱动实现，气体循环过程中培养体系中氧气被消耗。

本发明中，所述蠕动泵5可在整个闭合环路的任意管路段驱动，驱动方向可为正向、也可为反向；

本发明中，所述管路7可采用硅/橡胶管路；

本发明中，所述系统设有1个或多个串联的培养瓶2；

本发明中，所述培养系统可采用基本连接形式，也可采用串联连接形式：

（1）基本连接形式

基本连接形式中，所述厌氧袋1（内含厌氧剂）与培养瓶2通过硅/橡胶管路7串联形成闭合环路，将闭合环路的一段置入所述蠕动泵5泵头驱动（如图1所示）；所述培养瓶2内需设置一枚搅拌子4且放置于搅拌器3上；本发明所述的整套连接系统需安置于适合的温度环境下，或者至少培养瓶2应安置于适合的温度环境下；为避免负压形成，所述厌氧袋1需为弹性材质不宜为刚性材质；

使用时，所述管路7与培养瓶2需进行整体消毒，其中，培养瓶2内需提前注入一定量培养液并加一枚搅拌子4；消毒后与厌氧袋1连接，将一段管路7嵌入蠕动泵5的泵头，然后开启蠕动泵5进行厌氧平衡；厌氧环境建成后，采用注射办法加入一定量细菌到所述培养瓶2内的培养液中，使其达到预定细菌浓度，开启所述搅拌器3进行搅拌培养；细菌经过预培养后进行0点采样，采样后将预定量药物通过注射办法加入到所述培养瓶2内；在不同时间点从培养瓶2中取菌液进行菌落计数，最后绘制杀菌曲线。

（2）串联连接形式

串联连接形式为基本连接的串联化；连接中主要涉及到各个培养瓶2的串联，培养瓶2之间通过硅/橡胶管路7连接且与所述厌氧袋1进行串联，每个连接单元均有一根进气管与一根出气管，最后形成闭合环路；将上述闭合环路的一段置入所述蠕动泵5的泵头驱动（如图2所示）；每个单元培养瓶2的放置与上述基本形式中相同；为避免负压形成，所述厌氧袋1需为弹性材质不宜为刚性材质；

使用时，串联的管路7与培养瓶2需进行整体消毒，其中，每个培养瓶内需提前注入一定量培养液并加一枚搅拌子,2；消毒后，将上述串联系统与厌氧袋1连接，将一段管路7嵌入蠕动泵5的泵头，然后开启蠕动泵5进行厌氧平衡；厌氧环境建成后，采用注射办法加入一定量细菌到每一个培养瓶2内的培养液中，使其达到预定细菌浓度，开启所述搅拌器3进行搅拌培养；细菌经过预培养后进行0点采样，采样后将预定量药物通过注射办法加入到各个培养瓶2内；在不同时间点从相应培养瓶中取菌液进行菌落计数，最后绘制每个培养瓶条件下的杀菌曲线。

本发明采用厌氧袋气体循环的方法在培养瓶中产生厌氧环境，避免了对厌氧箱及其辅助的厌氧气体钢瓶等设备的依赖，同时瓶盖上留有采样孔可供用注射器在培养瓶中取菌液进行菌落计数；使用本发明所述培养系统可使厌氧菌杀菌曲线研究变得非常容易；此外，本发明所述培养系统具有简单、廉价且容易操作等优点可用于但不限于抗厌氧菌抗菌药物静态杀菌曲线研究。

附图说明

图1显示了厌氧菌杀菌曲线模型基本结构；

图2显示了厌氧菌杀菌曲线模型串联结构；

图1~2中，1为厌氧袋、2为培养瓶、3为搅拌器、4为搅拌子、5为蠕动泵、6为采样孔、7管路；

图3显示了脆弱拟杆菌标准株生长曲线。

具体实施方式

以下通过实例进一步阐述本本发明所涉及的体系及其使用方法：

实施例1

如图1所示，本用于抗厌氧菌药物的静态杀菌曲线的培养系统，主要由厌氧袋1、培养瓶2、搅拌器3、蠕动泵5和管路7组成；所述厌氧袋1与培养瓶2由管路7连接，所述管路7上设有蠕动泵5，所述培养瓶2与搅拌器3连接，所述培养瓶2上设有采样孔6，所述培养瓶2的内部放有搅拌子4；

所述厌氧袋1可为1个或者多个串联形式；所述厌氧袋1在形体上为囊袋形式且有开口可用来填充厌氧剂，可通过夹闭密封，其形状可为任意形状；所述厌氧袋1上至少设有两个与所述管路7对接的接口（通过分路合并的形式囊袋上的接口可为任意个）；所述厌氧袋1通常采用软性材质制备，避免负压对培养系统造成影响；但在整个系统密闭性好的前提下所述厌氧袋1也可被其他刚性容器（如：玻璃瓶、金属瓶、硬质有机材料瓶等）所取代；

所述培养系统运行中需要有闭合和气路循环，该气路特点在于串联了所述厌氧袋1与培养瓶2且首尾相连不与外界相通；气体循环通过所述蠕动泵5驱动实现，气体循环过程中培养体系中氧气被消耗。

所述蠕动泵5可在整个闭合环路的任意管路段驱动，驱动方向可为正向、也可为反向；

所述管路7可采用硅/橡胶管路；

所述培养系统采用基本连接形式，设有1个培养瓶2；

基本连接形式中，所述厌氧袋1（内含厌氧剂）与培养瓶2通过硅/橡胶管路7串联形成闭合环路，将闭合环路的一段置入所述蠕动泵5泵头驱动（如图1所示）；所述培养瓶2内需设置一枚搅拌子4且放置于搅拌器3上；本发明所述的整套连接系统需安置于适合的温度环境下，或者至少培养瓶2应安置于适合的温度环境下；为避免负压形成，所述厌氧袋1需为弹性材质不宜为刚性材质；

使用时，所述管路7与培养瓶2需进行整体消毒，其中，培养瓶2内需提前注入一定量培养液并加一枚搅拌子4；消毒后与厌氧袋1连接，将一段管路7嵌入蠕动泵5的泵头，然后开启蠕动泵5进行厌氧平衡；厌氧环境建成后，采用注射办法加入一定量细菌到所述培养瓶2内的培养液中，使其达到预定细菌浓度，开启所述搅拌器3进行搅拌培养；细菌经过预培养后进行0点采样，采样后将预定量药物通过注射办法加入到所述培养瓶2内；在不同时间点从培养瓶2中取菌液进行菌落计数，最后绘制杀菌曲线。

实施例2

如图2所示，本发明的用于抗厌氧菌药物的静态杀菌曲线的培养系统，主要由厌氧袋1、培养瓶2、搅拌器3、蠕动泵5和管路7组成；所述厌氧袋1与培养瓶2由管路7连接，所述管路7上设有蠕动泵5，所述培养瓶2与搅拌器3连接，所述培养瓶2上设有采样孔6，所述培养瓶2内部放有一枚搅拌子4；

所述厌氧袋1可为1个或者多个串联形式；所述厌氧袋1在形体上为囊袋形式且有开口可用来填充厌氧剂，可通过夹闭密封，其形状可为任意形状；所述厌氧袋1上至少设有两个与所述管路7对接的接口（通过分路合并的形式囊袋上的接口可为任意个）；所述厌氧袋1通常采用软性材质制备，避免负压对培养系统造成影响；但在整个系统密闭性好的前提下所述厌氧袋1也可被其他刚性容器（如：玻璃瓶、金属瓶、硬质有机材料瓶等）所取代；

所述培养系统运行中需要有闭合和气路循环，该气路特点在于串联了所述厌氧袋1与培养瓶2且首尾相连不与外界相通；气体循环通过所述蠕动泵5驱动实现，气体循环过程中培养体系中氧气被消耗。

所述蠕动泵5可在整个闭合环路的任意管路段驱动，驱动方向可为正向、也可为反向；所述管路7采用硅/橡胶管路；

所述培养系统采用串联连接形式，设有多个串联的培养瓶2；

串联连接形式为基本连接的串联化；连接中主要涉及到各个培养瓶2的串联，培养瓶2之间通过硅/橡胶管路7连接且与所述厌氧袋1进行串联，每个连接单元均有一根进气管与一根出气管，最后形成闭合环路；将上述闭合环路的一段置入所述蠕动泵5的泵头驱动（如图2所示）；每个单元培养瓶2的放置与上述基本形式中相同；为避免负压形成，所述厌氧袋1需为弹性材质不宜为刚性材质；

使用时，串联的管路7与培养瓶2需进行整体消毒，其中，每个培养瓶内需提前注入一定量培养液并加一枚搅拌子,2；消毒后，将上述串联系统与厌氧袋1连接，将一段管路7嵌入蠕动泵5的泵头，然后开启蠕动泵5进行厌氧平衡；厌氧环境建成后，采用注射办法加入一定量细菌到每一个培养瓶2内的培养液中，使其达到预定细菌浓度，开启所述搅拌器3进行搅拌培养；细菌经过预培养后进行0点采样，采样后将预定量药物通过注射办法加入到各个培养瓶2内；在不同时间点从相应培养瓶中取菌液进行菌落计数，最后绘制每个培养瓶条件下的杀菌曲线。

实施例3

研究左奥硝唑对脆弱拟杆菌的杀菌作用需建立脆弱拟杆菌的生长模型，采用本发明中所述的培养系统与方法建立该生长模型；所选细菌为脆弱拟杆菌标准菌株（ATCC 25285），起始细菌浓度设为1×10⁶ CFU/ml。

在培养瓶中配置30ml布氏杆菌肉汤，内各加一枚搅拌子，将培养瓶与管路连接组装，进行整体消毒；消毒后将厌氧袋接入形成闭合环路，将其中一段管路嵌入蠕动泵，并开启蠕动泵进行气体循环，蠕动泵速度设为5ml/min；系统的培养瓶部分放置在37℃环境预热；蠕动循环2小时后，用注射器加300μL浊度为0.5McFarland的悬浊菌液到培养瓶中，开启搅拌器搅拌培养；预培养30分钟后开始计时；在计时0、2、4、8、10、12、24h取样，作合适的稀释度后，均匀涂布于布氏琼脂平板上，35℃孵育48h后，计算活菌菌落数；最后绘制细菌生长曲线（细菌生长曲线结果如图3所示）。