本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种抑制植物细胞组织在培养中褐化的方法。
背景技术：
植物细胞组织培养技术在植物快速繁殖、脱毒、加速育种进程、次生代谢产物生产以及种质资源保存等方面取得了巨大的经济效益、社会效益及生态效益。植物细胞培养技术因其优越性，其应用领域仍在不断扩展，目前应用植物细胞培养技术生产外源动物蛋白，已成为全球研究与应用的热点。但是，褐化问题仍然普遍存在于植物细胞组织培养领域，严重影响了植物细胞组织的生长，甚至导致其死亡，从而降低了目标代谢产物或其它活性物质的积累，严重制约了植物细胞组织培养的产业化应用。植物细胞组织培养过程褐化发生是由于酚类物质被多酚氧化酶(PPO)氧化为毒性的醌类物质。
目前，植物细胞组织培养过程中的褐化主要依靠传统的添加吸附剂、抗氧化剂、更换培养基等方法来进行控制。例如，李春斌等通过向培养基中添加活性炭吸附褐色物质，从而使得东北红豆杉已褐化的愈伤组织去褐化(CN103563750A)；而苗辰飞等制备特定形状的硅胶吸附材料吸附醌类物质，从而降低植物细胞褐化风险(CN103923873A)；黄文敏等通过向培养基中添加PVP的方法抑制烟草愈伤组织继代培养中的褐化(CN102577953B)。卞莉娉等通过向培养基中添加VC作为还原剂，从而抑制蝴蝶兰组织的褐化(CN103125380A)；项艳等通过向培养基中添加植物提取液的方式防止蝴蝶兰组培的褐化(CN103749297A)；刘福平等通过发明一种抗褐化消毒剂2- 苄基-4-氯苯酚，从而防止植物组培外植体的褐化(CN103891713A)，此种消毒剂的作用原理本质还是抗氧化剂的作用。李雅丽等通过更换新鲜培养基洗涤甘草细胞的方式防止悬浮培养初期的褐化现象发生(CN103589679A)，闫志刚等通过黄藤愈伤组织固--液转换培养的方法防止褐化现象产生(CN102805032B)。此外，邱德有等通过利用一种微小RNA抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法(CN101781650B)。该方法虽然能够在一定程度上起到防止褐化的作用，但是尚不能全面阻止褐化，且操作方法繁琐。
综上所述，以上专利所公开的防止植物细胞组织培养褐化的方法，对褐化进行了一定程度的控制，但尚不能彻底解决植物细胞组织培养过程中的褐化问题，且这些方法只能在实验室小规模使用，大规模实施比较困难，而且还存在其他不足，如添加抗氧化剂和吸附剂等对植物细胞组织会产生毒副作用，需要在培养后期从培养基中去除，而更换培养基的方法操作繁琐，会提高生产成本。因而亟需建立有效、便于大规模实施的植物细胞组织培养中褐化控制的新方法。
技术实现要素：
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种抑制植物细胞组织在培养中褐化的方法，通过抑制植物细胞在培养过程中黄酮的合成，从根本上抑制褐化，由此解决目前抑制褐化不彻底、不能大规模使用、有毒副作用且操作繁的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种抑制植物细胞组织在培养中褐化的方法，所述方法包括将植物细胞组织置于如下条件下培养，所述条件使得所述植物细胞组织在培养过程中黄酮类物质的合成量下降30％以上。
优选地，所述条件包括在培养过程中分阶段加入蔗糖，根据查阅相关文献，植物细胞组织培养所用蔗糖浓度一般为20g/L-40g/L，但是在植物细胞培养初期蔗糖过高会导致褐化程度升高，因此在培养初期应降低蔗糖浓 度，即在细胞培养的前3-6天内保证蔗糖浓度为10g/L-20g/L，随后逐渐增大蔗糖浓度至30g/L-40g/L。
优选地，在细胞培养的前5天内保证蔗糖浓度为10g/L,随后逐渐增大蔗糖浓度至30g/L。
优选地，所述条件包括在培养基中添加10mg/L-100mg/L赤霉素。
优选地，在培养基中添加30mg/L-75mg/L赤霉素。
优选地，所述条件包括在建立细胞系后，筛选小细胞聚集体培养；即筛选直径100-800μm的细胞团块进行培养。
优选地，细胞团块的直径为500μm。
优选地，所述的方法应用于植物愈伤组织培养、植物细胞固体培养、植物细胞液体培养以及植物细胞反应器液体培养。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)本发明基于黄酮类物质是引起植物细胞组织在培养中褐化的主要机理的基础上建立了更具有针对性的褐化控制方法，从根本上防止植物细胞组织在培养过程中褐化的发生，避免褐化物质对植物细胞组织的伤害。
(2)本发明的方法对植物细胞组织没有副作用，适用于不同培养状态下的植物细胞组织，不需要去除添加物的步骤，操作简单，适用于植物细胞组织的大规模培养和产业化应用。
(3)本发明的方法操作简单，适用范围广，能够有效的防止褐化的发生；通过优化各方法中的参数，使得植物细胞组织在培养过程中黄酮类物质的含量得到更有效的控制，从而能更好的防止植物细胞组织在培养中褐化的发生。本发明对植物细胞组织培养的科学研究和产业化应用都具有实践指导意义和商业价值。
附图说明
图1是实施例1中继代时间分别为6个月(A)和10年(B)的细胞系 生长状态。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明目的在于提供有效且适合大规模产业化应用的植物细胞组织培养中褐化的控制方法，从根本上防止植物细胞组织培养过程褐化的发生，避免褐化物质对植物细胞组织的伤害。
研究中发现，褐化细胞中总黄酮含量是未褐化细胞的20多倍，导致褐化细胞中褐化现象非常严重，而未褐化细胞由于黄酮含量低基本没有褐化发生，并且可以通过添加赤霉素的方法特异性降低总黄酮含量，从而避免褐化现象的发生。该结果说明细胞中黄酮类物质的合成是导致植物细胞培养物发生褐化的主要原因。
本发明提供的是针对不同植物细胞组织培养物采用的有效控制黄酮类物质的合成，进行控制褐化的方法。本发明的植物细胞组织培养如愈伤组织培养物、植物细胞固体培养物、植物细胞液体培养物、植物细胞反应器培养物、组培苗的培养及快繁、毛状根培养等其它易发生褐化现象的植物细胞组织培养。在植物细胞组织培养过程中只要能抑制黄酮类物质合成的方法均能有效的控制植物细胞组织的褐化。
本发明优选以下三种简单易行的褐化控制方法：蔗糖流加培养，即蔗糖分阶段加入培养基中；小细胞聚集体培养；赤霉素应用培养，在不同组织培养物的单独或联合使用。
本发明解决植物细胞组织培养的褐化问题优选采用以下方案：
(1)在培养过程中分阶段加入蔗糖，即在细胞培养的前3-6天内保证蔗糖浓度为10g/L-20g/L，随后逐渐增大蔗糖浓度至30g/L-40g/L。优选地，在细胞培养的前5天内保证蔗糖浓度为10g/L，随后逐渐增大蔗糖浓度 至30g/L。
(2)在培养基中添加10mg/L-100mg/L赤霉素。优选地，在培养基中添加30mg/L-75mg/L赤霉素。进一步优选地，赤霉素的添加量为50mg/L。其中，赤霉素添加操作最为简单，适用于整个植物细胞培养放大过程，也适用于植物组织以及组培苗培养大规模生产。
(3)在建立细胞系后，筛选小细胞聚集体培养；即筛选直径100-800μm的细胞团块进行培养。优选地，细胞团块的直径为500μm。小细胞聚集体培养可以抑制黄酮类物质的合成，可以大幅度降低渗透压和流体剪切对细胞的伤害，避免褐化现象的发生。
本发明所述的方法应用于植物愈伤组织培养、植物细胞固体培养、植物细胞液体培养以及植物细胞反应器液体培养。
(1)植物愈伤组织培养物的褐化控制。新诱导长出的愈伤组织极容易褐化，导致愈伤组织死亡。采用本发明的蔗糖流加培养(即蔗糖分阶段加入培养基中)，小细胞聚集体培养，赤霉素应用培养，或以上两种方法相结合的方法，可有效抑制其褐化。更优选使用蔗糖流加培养和赤霉素应用培养，根据植物种类不同，初期添加蔗糖浓度范围为10-20g/L，添加赤霉素浓度范围为10-100mg/L，可降低细胞中总黄酮的积累，从而避免愈伤组织培养物褐化的发生。
(2)植物细胞固体培养物的褐化控制。植物细胞固体培养物包括植物愈伤组织在固体培养基中驯化培养得到细胞系，以及细胞系长期继代和保藏过程中的培养物，褐化现象较为严重。植物细胞固体培养物的褐化控制更优选采用降低培养基中初期蔗糖含量和添加赤霉素相结合的方法。根据植物细胞种类不同，植物细胞固体培养物中在初期添加蔗糖浓度范围为10-20g/L，添加赤霉素浓度范围为10-100mg/L，可降低细胞中总黄酮的合成，从而得到无褐化的植物细胞。
(3)植物细胞液体培养物的褐化控制。植物细胞从固体培养基转移到液体培养基进行悬浮培养，渗透压和流体剪切对细胞造成损伤，会诱发酶促褐化发生，造成植物细胞液体培养褐化现象尤为严重。植物细胞液体培养物的褐化控制使用本发明的三种方法，更优选三种方法的组合使用：培养基中添加赤霉素浓度范围为10-100mg/L，可阻止酶促褐化的发生；小细胞聚集体培养，筛选直径小于500μm的细胞团块进行培养，可以大幅度降低渗透压和流体剪切对细胞的伤害，避免酶促褐化现象的发生。蔗糖流加培养，悬浮培养初期蔗糖浓度不高于10g/L,可控制褐化发生，随后逐渐增加蔗糖浓度至30g/L。
(4)植物细胞反应器液体培养物的褐化控制。植物细胞反应器培养物包括植物细胞从摇瓶悬浮培养放大到反应器培养，再从小规模反应器放大到大规模反应器的培养物，由于培养环境的剧烈变化，流体剪切的影响，褐化现象容易发生。在植物细胞反应器培养物的褐化控制中，本发明所列出的方法均有很好的效果。
植物细胞组织培养领域常用的培养基类型有MS、B5、N6培养基，三种培养基组成成分一致，只是某种或几种物质含量的高低存在一定差异。其中最为常用的是MS培养基。
本发明以具有很高药用价和应用前景的木本植物红豆杉以及草本植物甘草、棉花、香焦为例，从愈伤组织的诱导和继代培养，到植物细胞的液体悬浮培养，再到反应器悬浮培养的不同培养物状态下，进行褐化控制。
以下为实施例
实施例1
中国红豆杉褐化细胞系与非褐化细胞系酶促褐化相关特征比较分析
(1)实验室保存有两种细胞系，一种是继代半年的细胞系(NA)，该细胞系无论是固体还是液体悬浮培养都表现出非常严重的褐化现象，另一 种是继代10年的细胞系(CA)，该细胞系在固体继代培养过程中基本没有褐化现象的发生。将两种细胞系接种在MS固体培养基上,蔗糖30g/L,控制温度为25℃，黑暗培养。NA细胞表现出黑褐色，且细胞生长状态欠佳，CA细胞表现出米黄色，且生长旺盛(图1)。
(2)为了探究两种细胞系褐化程度差异的原因，比较分析这两种细胞系的黄酮类物质含量和PPO活性。研究发现，两种细胞系中细胞内黄酮类物质含量在第5d出现最大差异值为17倍，细胞外黄酮类物质含量差异在第5d为5倍。而两种细胞系的PPO活性却差异很小，在第3d，6个月细胞内PPO活性仅为10年细胞的1.4倍，细胞外PPO活性最大差异2倍左右。两种细胞系的黄酮类物质含量和PPO活性比较说明，正是黄酮类物质含量的巨大差异造成完全不同的细胞褐化程度，也进一步说明了与PPO活性相比，黄酮类物质含量的高低更能够反应褐化程度的高低。
实施例2中国红豆杉褐化细胞系的褐化控制
将实施例1中继代半年的细胞系(NA)接种于相应的含有赤霉素为10mg/L，50mg/L和100mg/L的MS固体继代培养基中，蔗糖30g/L,控制温度为25℃，黑暗培养，每25天为1个继代周期，更换新鲜的上述继代培养基。经过两个周期的培养，细胞中的总黄酮含量分别下降了41％，77％和86％，从而在添加50mg/L和100mg/L赤霉素的培养基上均得到了无褐化发生的固体红豆杉愈伤组织和红豆杉细胞固体培养物。
实施例3
棉花愈伤组织诱导褐化控制
棉花愈伤组织诱导采用MS培养基，添加赤霉素浓度为50mg/L。选取生长状况良好的棉花无菌苗下胚轴剪成1cm左右小段、子叶剪成1cm×1cm左右小块，置于含有50mg/L赤霉素浓度的MS固体培养基表面。培养温度为28℃，每天光照12小时，培养30天。MS培养基中添加50mg/L赤霉素 最终使下胚轴和子叶总黄酮含量分别下降了58％和67％，从而得到无褐化发生的棉花愈伤组织。
实施例4
香蕉愈伤组织诱导褐化控制
香蕉愈伤组织诱导采用MS培养基，添加赤霉素浓度为75mg/L。选取生长状况良好的香蕉茎尖分生组织剪成1cm左右小段，置于含有75mg/L赤霉素浓度的MS固体培养基表面。培养温度为25℃，黑暗培养30天。MS培养基中添加75mg/L赤霉素最终使愈伤组织总黄酮含量分别下降63％，从而得到无褐化发生的香蕉愈伤组织。
实施例5
中国红豆杉愈伤组织培养物和细胞系固体培养物的褐化控制
(1)外植体消毒：取当年生中国红豆杉嫩茎，洗衣粉水浸泡30分钟，流水冲4小时，75％乙醇浸泡10秒钟，0.1％HgCl2浸泡10分钟，并用大量无菌水冲洗6次，切成1厘米左右的小段，从而获得无菌外植体备用。
(2)愈伤组织诱导培养：将步骤(1)所得到的无菌外植体接种于分别含有赤霉素浓度分别为10mg/L，50mg/L和100mg/L的MS固体诱导培养基,蔗糖20g/L,控制温度为25℃，黑暗培养，待愈伤组织诱导率达到90％左右时,将无褐化的愈伤组织剥离备用。
(3)愈伤组织继代培养：将步骤(2)所剥离的愈伤组织，接种于相应的含有赤霉素为10mg/L，50mg/L和100mg/L的MS固体继代培养基中，蔗糖30g/L,控制温度为25℃，黑暗培养，每25天为1个继代周期，更换新鲜的上述继代培养基。MS培养基中添加不同浓度赤霉素最终使总黄酮含量下降了36％，71％和89％，从而在添加50mg/L和100mg/L赤霉素的培养基上均得到了无褐化发生的固体红豆杉愈伤组织和红豆杉细胞细胞固体培养物。
实施例6
中国红豆杉细胞液体培养物的褐化控制
3种褐化控制方法可供选择，最终控制中国红豆杉细胞液体培养物褐化现象的发生：
(1)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系按10％的接种量(m/V)接种于分别含有赤霉素10mg/L，50mg/L和100mg/L的MS液体培养基中，蔗糖30g/L,控制温度为25℃，将摇瓶至于摇床上黑暗培养，控制摇床转速为110-130RPM。添加赤霉素10mg/L使细胞中总黄酮含量下降32％,细胞褐化有所降低；添加赤霉素50mg/L和100mg/L使得红豆杉细胞总黄酮含量下降了78％和92％，从而得到无褐化发生的红豆杉细胞液体培养物。
(2)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系MS液体培养基中，置于摇床上摇散，使细胞团块分开。在无菌状态下，使用钢筛收集直径小于500μm，直径500-800μm和直径大于800μm的细胞团块(作为对照)。将细胞团块按5％的接种量(m/V)分别重新接种于MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L,控制温度为25℃，将摇瓶至于摇床上黑暗培养，控制摇床转速为110-130RPM。直径小于500μm的红豆杉细胞总黄酮含量较对照下降了57％，从而得到无褐化发生的红豆杉细胞液体培养物，直径500-800μm的培养物中总黄酮含量较对照下降了46％，细胞褐化程度有所降低。
(3)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系按10％的接种量(m/V)接种于MS液体培养基中，前5天培养初期设置蔗糖浓度为10g/L和20g/L,细胞中总黄酮的含量分别下降71％和52％，第5天加入分别相对应加入20g/L和10g/L蔗糖。控制温度为25℃，将摇瓶至于摇床上黑暗培养，控制摇床转速为110-130RPM,从而得到无褐化发生的红豆杉细胞液体培养物。
实施例7
中国红豆杉细胞反应器液体培养物的褐化控制
3种褐化控制方法可供选择，最终控制中国红豆杉细胞反应器培养物褐化现象的发生：
(1)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系按10％的接种量(m/V)接种于分别含有赤霉素10mg/L，50mg/L和100mg/L的MS液体培养基中，蔗糖30g/L。采用7.5L生物反应器(NBS，BioFlo 115),工作体积为5L,螺旋式搅拌桨转速为60RPM,通气量为0.2VVM，温度为25℃，黑暗培养。添加不同浓度赤霉素使得红豆杉细胞总黄酮含量分别下降了35％，75％和87％，在添加50mg/L和100mg/L赤霉素的培养基上均得到无褐化发生的红豆杉细胞反应器液体培养物。
(2)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系MS液体培养基中，置于摇床上摇散，使细胞团块分开。在无菌状态下，使用钢筛筛选直径小于500μm，直径500-800μm和直径大于800μm的细胞团块(作为对照)。将细胞团块分别按5％的接种量(m/V)重新接种于反应器MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L。采用7.5L生物反应器(NBS，BioFlo 115),工作体积为5L,螺旋式搅拌桨转速为60RPM,通气量为0.2VVM，温度为25℃，黑暗培养。直径小于500μm的红豆杉细胞中总黄酮含量下降了63％，从而得到无褐化发生的红豆杉细胞反应器液体培养物，直径500-800μm的红豆杉细胞中总黄酮含量下降了48％，褐化程度有所降低。
(3)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系按10％的接种量(m/V)接种于反应器MS液体培养基中，前5天培养初期设置蔗糖浓度为10g/L和20g/L,可有效降低总黄酮的积累，红豆杉细胞总黄酮含量下降71％和58％，第5天加入分别加入相应的20g/L和10g/L蔗糖。采用7.5L生物反应器(NBS，BioFlo 115),工作体积为5L,螺旋式搅拌桨转速为60RPM,通气量为0.2VVM，温度为25℃，黑暗培养。上述培养均得到无褐化发生的红豆杉细胞反应器液体培养物。
实施例8
甘草细胞液体培养物的褐化控制
3种褐化控制方法可供选择，最终控制甘草细胞液体培养物褐化现象的发生：
(1)将长期继代培养无褐化的固体培养甘草细胞系按6％的接种量(m/V)接种于分别含有赤霉素30mg/L的摇瓶MS液体培养基中，蔗糖30g/L,将摇瓶至于摇床上，控制摇床转速为110-130RPM，温度为25℃，12小时黑暗和12小时光照交替培养。添加赤霉素50mg/L使甘草细胞总黄酮含量下降了69％，从而得到无褐化发生的甘草细胞液体培养物。
(2)将长期继代培养无褐化的甘草细胞接种MS液体培养基中，置于摇床上摇散，使细胞团块分开。在无菌状态下，使用钢筛筛选直径小于500μm的细胞团块。将该直径细胞团块按4％的接种量(m/V)重新接种于MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L，将摇瓶至于摇床上，控制摇床转速为110-130RPM，温度为25℃，12小时黑暗和12小时光照交替培养。直径小于500μm的甘草细胞总黄酮含量下降了59％，从而得到无褐化发生的甘草细胞液体培养物。
(3)将长期继代培养无褐化的固体培养细胞系按10％的接种量(m/V)接种于MS液体培养基中，前5天培养初期设置蔗糖浓度为10g/L,可有效降低总黄酮的积累，第5天加入另外20g/L蔗糖。控制摇床转速为110-130RPM，温度为25℃，12小时黑暗和12小时光照交替培养。直径小于500μm的甘草细胞总黄酮含量下降了59％，从而得到无褐化发生的甘草细胞液体培养物。
实施例9
甘草细胞反应器液体培养物的褐化控制
3种褐化控制方法可供选择，最终控制甘草细胞反应器培养物褐化现象 的发生：
(1)将长期继代培养无褐化的固体培养甘草细胞系按6％的接种量(m/V)接种于分别含有赤霉素50mg/L的MS液体培养基中，蔗糖30g/L。采用7.5L生物反应器(NBS，BioFlo 115),工作体积为5L,搅拌桨转速为60RPM,通气量为0.2VVM，温度为25℃，12小时黑暗和12小时光照交替培养。添加赤霉素50mg/L使得甘草细胞总黄酮含量下降了72％，从而得到无褐化发生的甘草细胞反应器液体培养物。
(2)将长期继代培养无褐化的固体培养甘草细胞系MS液体培养基中，置于摇床上摇散，使细胞团块分开。在无菌状态下，使用钢筛筛选直径小于500μm的细胞团块。将该直径细胞团块按4％的接种量(m/V)重新接种于反应器MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L。采用7.5L生物反应器(NBS，BioFlo 115),工作体积为5L,搅拌桨转速为60RPM,通气量为0.2VVM，温度为25℃，12小时黑暗和12小时光照交替培养。直径小于500μm的甘草细胞总黄酮含量下降了61％，从而得到无褐化发生的甘草细胞反应器液体培养物。
(3)将长期继代培养无褐化的固体培养甘草细胞系按6％的接种量(m/V)接种于反应器MS液体培养基中，前5天培养初期设置蔗糖浓度为10g/L,可有效降低总黄酮的积累，第5天加入另外20g/L蔗糖。采用7.5L生物反应器(NBS，BioFlo 115),工作体积为5L,搅拌桨转速为60RPM,通气量为0.2VVM，温度为25℃，12小时黑暗和12小时光照交替培养。直径小于500μm的甘草细胞总黄酮含量下降了64％，从而得到无褐化发生的甘草细胞反应器液体培养物。
本发明的褐化控制方法，基于植物细胞培养褐化机理，通过抑制培养过程中黄酮类物质的合成来抑制褐化，针对性强，可从根本上防止褐化的发生。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。