一种神经干细胞的专用培养基及其培养方法与流程

文档序号:12166935阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种神经干细胞专用培养基,其特征在于,所述培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成,所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为:300-450μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、5-15μg/ml N2添加剂、15-30ng/ml干细胞生长因子、5-7mg/ml硫代甘油、50-70ng/ml神经生长因子、0.05-0.07mmol/ml乙酰胆碱、10-25mg/ml羧甲基纤维素钠、0.005-0.01mmol/ml维甲酸和0.110-0.20mmol/ml叶酸。

2.如权利要求1所述神经干细胞专用培养基,其特征在于,所述培养基由DMEM/F12培养液和溶质组成,所述溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为:350μg/ml 2′,3′-二脱氧腺苷-5-三磷酸酯、8μg/mlN2添加剂、22ng/ml干细胞生长因子、6mg/ml硫代甘油、63ng/ml神经生长因子、0.06mmol/ml乙酰胆碱、18mg/ml羧甲基纤维素钠、0.008mmol/ml维甲酸和0.15mmol/ml叶酸。

3.一种应用如权利要求1或2所述的神经干细胞专用培养基培养神经干细胞的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

1)在无菌条件取得离体脑神经组织,用含有5%双抗的PBS缓冲液进行漂洗;

2)将步骤1)所得的脑神经组织切成1-2mm3碎块,加入含由0.5mg/mlI型胶原酶、0.5mg/ml IV型胶原酶和0.1mg/ml脱氧核糖核酸I的DMEM/F12培养基,于4-8℃的CO2培养箱中消化分解20-24h,得到组织悬液;

3)将步骤2)所得的组织悬液离心,弃上层清液,加入DMEM/F12培养基清洗3次,加入细胞消化液,于35-38℃消化42-57min,轻轻吹打混匀后终止消化,于DMEM/F12中漂洗,过200-400目细胞筛,收集滤液,离心弃上清,得单细胞悬液;

4)向步骤3)所得的单细胞悬液中加入所述神经干细胞专用培养基,调整细胞浓度为1×107个/ml,接种于培养皿中,培养10-12天,得到所述P0代神经干细胞;

5)取步骤4)得到的P0代神经干细胞,加入细胞消化液于37℃消化40s-85s,吹打混匀后,离心6-10min,弃上层清液,加入所述神经干细胞专用培养基,使细胞浓度为3×105个/ml,接种培养瓶中,并向培养皿中加入1g/L的二氨基乙烷聚丙烯酰胺,缓慢送气混合均匀,每隔天换一次新鲜培养基的同时缓慢送气混合,培养3-5天,得到传代神经干细胞。

4.如权利要求3所述的神经干细胞培养方法,其特征在于,所述离心转速为1300rpm。

5.如权利要求3所述的神经干细胞培养方法,其特征在于,步骤4)P0代干细胞的培养条件为:37℃、5%CO2的潮湿空气、PH值保持7.3-7.4;第3天换半量培养基,并加入50ug/ml的血清替代物;第6天后每隔两天换新鲜培养基。

6.如权利要求3所述的神经干细胞培养方法,其特征在于,步骤5)传代神经干细胞的培养条件为:37℃、5%CO2的潮湿空气,第1-2天PH值保持7.05-7.15,第2-3天PH保持7.15-7.25,所述送气步骤送入气体为5%CO2的潮湿空气。

7.如权利要求5或6所述的神经干细胞培养方法,其特征在于,神经 干细胞培养过程中PH值由2M的NaOH调节。

8.如权利要求3所述的神经干细胞培养的方法,其特征在于,所述细胞消化液为含有1.5mg/ml胰蛋白酶和0.1mg/ml EDTA的PBS。

9.如权利要求3所述的神经干细胞的培养方法,其特征在于,步骤4)中所述的培养皿表面包被鼠尾胶。

10.如权利要求9所述的神经干细胞的培养方法,其特征在于,所述培养皿包被鼠尾胶的方法为:采用0.5mg/ml的鼠尾胶去离子水溶液,均匀涂布于培养皿表面,放入37℃、5%CO2的培养箱中包被50min,吸弃溶液后加入无菌水冲洗3遍,再加入DMEM/F12培养液冲洗一遍吹干即得。

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