本发明涉及一种玉米秸秆青（黄）贮酶菌复合发酵剂的制备方法。
背景技术：
青（黄）贮饲料因气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长期保存而成为家畜优良饲料的来源之一。青（黄）贮饲料利用自然界植物上存在的乳酸菌进行发酵，由于自然界植物上的乳酸菌含量少，仅占细菌总数的0.01～1%，所以在发酵过程中，乳酸菌很难迅速的形成优势菌群，致使霉菌和腐败菌等各种细菌生长繁殖，导致青（黄）贮饲料温度迅速上升，造成大量的营养成分和能量的损失，预备发酵期延长；同时霉菌和腐败菌的大量繁殖，可致使青（黄）贮饲料局部发霉和腐烂；当青（黄）贮饲料接触空气时还容易形成二次发酵，在取食截面上新发生霉斑或者成片发霉。因此，在生产实践中，应尽可能地增加乳酸菌数量，减少有氧变质带来的损失，提高青（黄）贮饲料的有氧稳定性，延迟二次发酵，保持青（黄）贮饲料的品质。国际上一般采用添加外源性的乳酸菌，提高青（黄）贮饲料质量。目前，许多发酵剂在工业生产中不能达到足够数量的乳酸菌，不能与自然菌体竞争而成为主要的发酵菌，要达到这一目的，每克青（黄）贮料中至少需要接种105～106个活菌细胞。而且目前工业上生产的大部分发酵剂中都是活菌，几乎没有能够提高青（黄）贮饲料的有氧稳定性的微生物。有些发酵剂虽然为活菌和酶的复合物，但酶制剂的种类和配比不完整，植物细胞壁分解作用不充分，导致青（黄）贮饲料适口性差。
技术实现要素：
为克服现有发酵剂乳酸菌数量少，减少有氧变质带来的损失、提高青（黄）贮饲料的有氧稳定性、延迟二次发酵，保证青（黄）贮饲料的品质，本发明提供了一种玉米秸秆青（黄）贮酶菌复合发酵剂的制备方法。
一种玉米秸秆青（黄）贮酶菌复合发酵剂的制备方法，该方法包括乳酸菌菌粉的制备、乳酸菌菌粉混合物的制备和发酵剂复配混合制备三个步骤。
1、乳酸菌菌粉的制备。
所述的乳酸菌菌粉的制备包括乳酸菌菌种活化、乳酸菌一级发酵、乳酸菌二级发酵、乳酸菌菌泥的制备和乳酸菌菌粉的制备。
所述的乳酸菌菌种活化是将实验室冷藏条件下的乳酸菌菌种用灭菌的乳酸细菌液体培养基进行第一次活化，经检测达标后将乳酸菌菌液转入另一乳酸细菌液体培养基进行第二次活化，经检测达标后将乳酸菌菌液转入一级发酵罐进行一级发酵，所述的乳酸菌菌种选自植物乳杆菌、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖片球菌中的三种或三种以上，所述的乳酸菌菌种第一次活化温度与第二次活化温度均为37℃，所述的第一次活化时间为16～24h，所述的第一次活化检测达标值OD500为10，所述的第二次活化时间为16～24h，所述的第二次活化检测达标值OD500为10。
所述的乳酸菌一级发酵是在一级发酵罐中加入一级发酵培养基，在无菌条件下，将所述的经二次活化的乳酸菌菌液倒入一级发酵罐接种口，进行一级发酵培养，所述的一级发酵培养基由蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵、硫酸镁、硫酸锰组成，其中蛋白胨400～800g，酵母浸出粉50～400g，葡萄糖500～2000g，醋酸钠100～400g，柠檬酸二铵10～100g，硫酸镁10～200g，硫酸锰1～50g，所述的一级发酵培养基用蒸馏水定容，调节pH值范围为6.2～7.4，所述的乳酸菌一级发酵的发酵温度为37℃，搅拌器转速为0～200r/min，溶氧量0～50%，发酵12～20小时，发酵罐内压力保持在0.05～0.1MPa。
所述的乳酸菌二级发酵是在二级发酵罐中加入二级发酵培养基，将所述的经过一级发酵培养的乳酸菌菌种培养液移到二级发酵罐中进行流加发酵，发酵过程中按体积比进行补料，所述的二级发酵培养基由大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖、醋酸钠、柠檬酸二铵组成，其中大豆蛋白胨 1～4kg、蛋白胨1～4kg、酵母浸出粉1～4kg、葡萄糖4～12kg、醋酸钠1～4kg、柠檬酸二铵0～2kg，所述的一级发酵培养基用蒸馏水定容，调节pH值范围为6.2～7.4，所述的乳酸菌的二级发酵的发酵温度为37℃，搅拌器转速为0～200r/min，溶氧量0～50%，保持罐压0.05～0.1MPa，所述的乳酸菌的二级发酵从发酵8小时后开始按体积比进行补料，8～11h每小时补料0.5%，12～20h每小时补料1%，补料由碳源及其它营养补料组成，用氨水中控调节5.0～7.0之间。
所述的乳酸菌菌泥的制备是将所述的经过二级发酵培养的乳酸菌菌液移入管式离心机进行离心操作，待管式离心机转鼓达到15000 r/min后，停机取出乳酸菌菌泥。
所述的乳酸菌菌粉的制备是将菌泥与保护剂混合后搅拌均匀，装盘冻干，用粉碎机粉碎成菌粉，所述的菌泥与保护剂按重量比1：1～5进行混合并进行冻干处理，冻干温度为-15～-20℃，在采用粉碎机对冻干的菌泥进行粉碎过程中保证菌泥的温度不高于50℃。
2、乳酸菌菌粉混合物的制备。
乳酸菌菌粉混合物是由植物乳杆菌、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖片球菌中的三种或三种以上以测定的每克所含有的活菌数计算，并按1～10: 1～10: 1～10配比进行混合制成。
3、发酵剂复配混合。
发酵剂复配混合由乳酸菌菌粉混合物和复配酶制剂按1:0.1～10配比混合制成，其中乳酸菌菌粉混合物按测定的每克所含有的活菌数，复配酶制剂按测定的每克所含有的酶活力计算，所述的复配酶制剂由木聚糖酶、半纤维素酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶中的两种或两种以上混合而成，酶菌复合发酵剂中总活菌数应达到1011个/g以上，酶菌复合发酵剂总活力应达到4000U/g以上，混合后，混合均匀度CV值应小于5%，该酶菌复合发酵剂的制备方法仅应用玉米秸秆的青贮或黄贮，添加量为每吨玉米秸秆5克。
具体实施方式
1、乳酸菌菌粉的制备。
（1）乳酸菌菌种活化。
将实验室冷藏条件下的乳酸菌菌种（植物乳杆菌、产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、戊糖片球菌中的任意一种）用100ml灭菌的乳酸细菌液体培养基进行第一次活化，活化温度37 ℃，24h后平板检测乳酸菌纯度和活菌数，检测达标后(OD500为10)再将上述100ml乳酸菌菌液全部转入至2500ml灭菌的乳酸细菌液体培养基进行第二次活化，18～24h后显微镜检测纯度，检测达标后转至(OD500为10)50L一级发酵罐。
（2）一级发酵。
在一级发酵罐中加入一级发酵培养基，培养基配方：蛋白胨800g、酵母浸出粉200g、葡萄糖800g、醋酸钠200g、柠檬酸二铵80g、硫酸镁48g、硫酸锰8g、用蒸馏水定容到40L，pH6.2～6.4。点燃酒精火圈，关小无菌空气进气阀门，降低罐压至0.01MPa以下，迅速打开接种口旋塞。当旋塞快打开时，关闭空气。一人迅速打开接种旋塞，悬至于火圈上，另一人在火圈上方用镊子打开接种瓶棉塞，迅速将2.5L菌液全部倒入接种口内后，前者迅速旋紧接种旋塞，同时打开进空气阀门，升起罐压，移走火圈，打开搅拌。接种结束后，不开排气，通气保压，保持罐压0.05MPa。
发酵：在温度37℃，搅拌机转速100r/min条件下，溶氧量0～20%，发酵12～14小时。发酵过程中注意控制罐内压力保持在0.05MPa。
（3）二级发酵。
在二级发酵罐中加入二级发酵培养基，培养基配方：大豆蛋白胨4kg、蛋白胨4kg、酵母浸出粉2kg、葡萄糖8kg、醋酸钠2kg、柠檬酸二铵0.8kg、蒸馏水定容到700L，pH6.2～6.4。降低二级发酵罐罐压至0.05MPa，同时停止一级发酵罐搅拌电机，升高一级发酵罐罐压至0.15MPa，打开一级发酵罐底部出料阀门，开始移种。确认一级发酵罐内种子移完后（管道压力突然下降），先关闭二级发酵罐接种阀门，然后关闭一级发酵罐进空气阀门，再关闭一级发酵罐底部出料阀门，打开二级罐搅拌。不开排气，通气保压，保持罐压0.05MPa。
发酵：在温度37℃，搅拌机转速100r/min条件下，溶氧量0～20%，保持罐压0.05MPa。发酵8小时后开始补料。补料：用氨水中控调节5.6～6.0之间。碳源及其它营养补料： 8～11h每小时补料0.5%（体积）；12～20h每小时补料1%（体积）。
（4）管式离心机离心。
打开电源开关，启动离心机，电机起动后，待转鼓达到15000 r/min后,打开进入阀离心。离心结束后，停机关闭电源，用专用工具挖出菌泥,备用。
（5）冻干。
用菌泥与保护剂重量比1：2混合，搅拌均匀，装盘，-15～-20℃冻干即可。
（6）粉碎。
冻干后的菌泥用粉碎机粉碎，加工过程中物料温度不能高于50度。
2、发酵剂复配混合。
（1）乳酸菌菌粉混合物。
选取步骤1制取的乳酸菌菌粉按活菌数进行混合，主要组成为植物乳杆菌：布氏乳杆菌：戊糖片球菌 = 4：3：3。
（2）复配酶制剂混合。
将木聚糖酶1000U/g、纤维素酶2000U/g、β-葡聚糖酶1000U/g进行混合，混合后，混合均匀度CV值小于5%。
（3）酶菌复合发酵剂制取。
将上述乳酸菌菌粉混合物与复配酶制剂按1:0.1～10配比混合制成，其中乳酸菌菌粉混合物按测定的每克所含有的活菌数，复配酶制剂按测定的每克所含有的酶活力计算，得到酶菌复合发酵剂。
该酶菌复合发酵剂的制备方法仅应用玉米秸秆的青贮或黄贮，添加量为每吨玉米秸秆5克。
该玉米秸秆青（黄）贮酶菌复合发酵剂的制备方法制取的酶菌复合发酵剂通过益生菌和酶制剂的共同作用使玉米秸秆青(黄)贮饲料丁酸质量分数降低 82% ,同时使中性膳食纤维、粗纤维质量分数分别降低10 %和7% ,玉米秸秆青（黄）贮饲料的品质明显提高。玉米秸秆经酶菌复合发酵剂发酵后，粗蛋白增加21．4％；粗纤维降低4．4％；产生有机酸1.6％，pH值降到3.6。乳酸含量达有机酸总量的60％以上。经奶牛饲喂试验，证明该发酵剂制作的秸秆发酵饲料较对照组每头牛的日产奶量提高了约1．39～1．43公斤，乳脂率提高了0．6％～0．7％，饲喂效果良好。