一种快速高效检测菌落总数的测试片及其制备方法与流程

本发明属于快速检测领域，涉及微生物检测技术，具体涉及一种快速高效检测菌落总数的测试片，以及该测试片制备方法。

背景技术：

细菌广泛存在于空气、水和土壤中，绝大部分对人体无害，但有些细菌对人体有害，细菌过多可引起食物质变，会刺激人体消化道、胃部等，严重的还可对肝脏造成损伤，造成食物中毒，危及生命安全。目前对细菌菌落总数测定主要采用《GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，该方法为平板计数法，是经典的菌落总数检测方法。但国标法检测在实际计数过程中，由于菌落颜色与琼脂底色相近，部分细小或生长于琼脂内部的菌落难以准确读出，此外，如果检验样品中含有残渣微粒，特别一些较难溶食品如糕点等，与细菌菌落难以区分，会严重影响细菌计数的准确性，并且国标方法检测耗时长、需要现配置培养基，操作步骤繁琐，难以满足快检的实际需求。

纸片法的出现，弥补了平板计数法的缺点，逐步成为微生物检测和鉴定的主要方法和标准，2007年，Petrifilm^TM测试片被正式列为中国出入境检验检疫行业标准，该方法正逐渐被越来越多的食品生产加工企业及各类检测机构所认可。公开日为2016年07月13日，公开号为CN105754849A，名称为一种菌落总数测试片、制备方法及其应用的发明专利，公开日为2013年03月20日，公开号为CN102985554A，名称为快速检测微生物的装置的发明专利均公开了一种测试片，将显色底物液TTC添加至细菌培养基中，由于显色底物TTC对菌落生长有一定的抑制作用，会使微生物生长缓慢或停止生长，具有影响菌落计数和导致实验结果判读困难的缺陷，对检测结果会造成一定影响。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种快速高效检测菌落总数的测试片及其制备方法，简化和加快了菌落总数的检测鉴定步骤，降低了指示剂对菌落总数的抑制作用，提高了对微生物的检测效率，获得的检测结果准确可靠。

技术方案：

一种快速高效检测菌落总数的测试片，包括上层塑料膜(1)和下层塑料底板(3)，下层塑料底板(3)中间有圆形凹槽(2)，所述上层塑料膜(1)内侧依次为TTC与胶粘剂混合物涂层(1-2)和瓜尔胶涂层(1-3)，所述混合物由浓度为0.8％的TTC溶液与胶粘剂按体积比0.1～1.0:10.0混合而成，涂布量0.1～1.0mL/片，所述瓜尔胶涂层(1-3)涂布量0.1～1.0g/片，所述圆形凹槽(2)内置细菌菌落生长培养基，每100mL细菌菌落生长培养基中含有胰蛋白胨0.5～1.0g、酵母粉0.1～0.5g、葡萄糖0.1～0.5g、磷酸二氢钾0.1～0.5g、氯化钠0.1～0.5g、丙酮酸钠0.1～0.5g、甘露醇0.1～0.5g、瓜尔胶1g。

进一步胶粘剂为压敏粘合剂。

进一步上层塑料膜1为透明膜，为聚酯、聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯材料，长×宽×厚为100×70×0.1mm。

进一步下层塑料底板3为聚丙烯塑料板或PET塑料板，长×宽×厚为95×70×0.7mm，中间的圆形凹槽2直径为70mm，厚度为0.5mm。

本发明另一个目的还提供了一种快速高效检测菌落总数的测试片的制备方法，其主要包括以下步骤：

a.测试片上层塑料膜1与下层塑料底板3在制备前需经过辐照灭菌进行处理，辐照剂量16KGy；

b.测试片上层塑料膜1的制备：将0.8％TTC与胶粘剂按体积比0.1～1.0：10的比例混合，115℃灭菌15min，冷却至室温，均匀的涂布在上层塑料膜(1-1)上，涂布量0.1～1.0mL/片，然后再涂布经剂量为8KGy辐照后的瓜尔胶0.1～1.0g/片，一端留出5mm的宽度不涂抹瓜尔胶，得到；

c.测试片下层塑料底板3的制备：配制细菌菌落生长培养基，取100mL蒸馏水，按照以下配方加入：胰蛋白胨0.5～1.0g、酵母粉0.1～0.5g、葡萄糖0.1～0.5g、磷酸二氢钾0.1～0.5g、氯化钠0.1～0.5g、丙酮酸钠0.1～0.5g、甘露醇0.1～0.5g、瓜尔胶1g，加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后，得到细菌菌落生长培养基，将1～5mL细菌菌落生长培养基添加到下层塑料底板3中间的圆形凹槽2内，摇匀，于50～60℃烘干；

d.组装测试片：将步骤b中所制测试片上层塑料膜1，未涂抹瓜尔胶的一端与步骤c中制备的测试片下层塑料底板3一端对齐后粘贴在一起制得快速高效检测菌落总数的测试片。

有益效果：

1.降低了指示剂对菌落总数的抑制作用。由于指示剂2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)对菌落总数有一定的抑制作用，将指示剂添加到测试片的上层中，菌落总数在下层培养基中生长好后产生的代谢酶再与上层中的指示剂作用，避免了菌落总数在生长时受到指示剂的抑制作用，实现了菌落总数生长和显色的分离。

2.本发明测试片，待检的样品溶液扩散快，并且不会溢出测试片外，避免了显色菌斑易扩散影响周围菌落的计数的缺陷，能保证样品溶液中菌落总数的检出率。

3.本发明测试片，具有使用简便，可以长期存放，应用灵活的特点，省去了培养基配置、培养皿灭菌、清洗等处理的工序，降低了劳动强度，大大缩短了检测时间。同时，发明测试片制备方法简单、易行，能够实现自动化生产，成本低廉，使用方便。

附图说明

图1为本发明测试片示意图；

1，上层塑料膜；1-1，上层塑料膜外层；1-2，TTC与胶粘剂混合物涂层；1-3，瓜尔胶涂层；2，圆形凹槽；3，下层塑料底板。

图2为本发明测试片检测阳性菌落总数的圆形凹槽内的显色图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂。

实施例1快速高效检测菌落总数的测试片的组成

如图1所示，一种快速高效检测菌落总数的测试片，上层塑料膜1和下层塑料底板3，下层塑料底板3中间有圆形凹槽2，上层塑料膜1内侧依次为细菌菌落酶解底物TTC与胶粘剂组成的混合物涂层1-2和瓜尔胶涂层1-3。混合物由浓度为0.8％的TTC溶液与胶粘剂按体积比0.1～1.0:10.0混合而成，涂布量0.1～1.0mL/片。瓜尔胶涂层1-3涂布量0.1～1.0g/片。圆形凹槽2内置细菌菌落生长培养基，每100mL细菌菌落生长培养基中含有胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸二氢钾、氯化钠、丙酮酸钠、甘露醇、瓜尔胶。

细菌菌落生长培养基的成分，100mL，见表1

表1细菌菌落生长培养基的成分，100mL

胰蛋白胨、酵母粉、瓜尔胶、TTC购自Sigma公司，葡萄糖、磷酸二氢钾、氯化钠购自国药集团，丙酮酸钠、甘露醇购自阿拉丁公司，胶粘剂为压敏粘合剂，购自苏州锦峰公司。

上层塑料膜1为透明膜，可为聚酯、聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯材料，长、宽为100×70mm，厚度为0.1mm。

所述下层塑料底板3为硬度较好的聚丙烯塑料板或PET塑料板，长、宽为95×70mm，厚度为0.7mm，中间的圆形凹槽2直径为70mm，厚度为0.5mm。

每份快速高效检测菌落总数的测试片检测一个样品。

实施例2快速高效检测菌落总数的测试片的制备

2.1测试片上层塑料膜与下层塑料底板在制备前需经过辐照灭菌进行处理，剂量16KGy；

2.2测试片上层塑料膜的制备：将浓度为浓度为0.8％的TTC溶液与胶粘剂按体积比0.8：10的比例混合，115℃灭菌15min，冷却至室温，均匀的涂布在上层塑料膜上，涂布量1.0mL/片，然后再涂布经剂量为8KGy辐照后的瓜尔胶1.0g/片，一端留出5mm的宽度不涂抹瓜尔胶，得到测试片上层。

2.3测试片下层PET塑料底板的制备：配制细菌菌落生长培养基，取100mL蒸馏水，按照以下配方加入：胰蛋白胨0.5g、酵母粉0.2g、葡萄糖0.1g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.5g、丙酮酸钠0.5g、甘露醇0.2g、瓜尔胶1.0g，加热溶解后，采用高压灭菌锅在121℃灭菌15min，冷却至室温后，得到细菌菌落生长培养基，将1～5mL细菌菌落生长培养基添加到下层PET塑料板中间的圆形凹槽内，摇匀，于50～60℃烘干。

2.4组装测试片：将步骤2.2中所制测试片上层，未涂抹瓜尔胶的一端与步骤2.3中制备的测试片下层一端对齐后粘贴在一起制得快速高效检测菌落总数的测试片。将所得测试片分装于自封袋，置于铝箔袋中，抽真空包装，置于2～8℃环境下，保存期限1年。

实施例3待检样品中菌落总数的检测

使用本发明实施例2制备的测试片检测样品中菌落总数，主要有以下几个步骤：

首先样品处理：取样品25g放入225mL灭菌稀释液(磷酸盐缓冲液或生理盐水)的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL灭菌稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，依次往下稀释，制备10倍递增系列的样品稀释匀液。一般样品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品(如饮用纯水和矿泉水等)可直接吸取原液进行检测。样品匀液pH值应在6.5～7.5之间，必要时用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。

其次接菌培养：将测试片置于平坦台面，打开测试片上层，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片中间圆形凹槽位置，缓慢盖上上层，避免有气泡产生，调整测试片角度，使样品匀液浸润整个培养基区域，即可培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL无菌生理盐水接种另一测试片作空白对照。将接种好的测试片放置于36±1℃培养箱中培养18～24h。一次堆叠不超过12片。

上述磷酸盐缓冲液的配制：称取34.0g的分析纯磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用175mL的1mol/L NaOH调节pH至6.0，用蒸馏水稀释至1000mL后，取1.25mL,用蒸馏水继续稀释至1000mL，分装于干净的适量容器中，121℃高压灭菌15min。

上述生理盐水的配制：取8.5g分析纯氯化钠溶解到1000mL蒸馏水中，充分混匀溶解，分装到适量容器后，121℃高压灭菌15min。

最后分析检测结果：

测试片上红色菌落为菌落总数阳性，选择菌落数30～300CFU之间的纸片进行计数。

计数原则：若两个稀释度的菌落数均在在30～300CFU之间，则取其平均菌落数乘以稀释倍数报告之；若所有测试片上菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度测试片均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数；若所有测试片上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。报告单位CFU/mL或CFU/g表示。

为了更好的体现本发明的有益效果，发明人用本发明测试片法、国家标准检测法对样品中的菌落总数进行检测，对比结果如下：

将处理好的冷冻水饺、鸡腿样品，用灭菌生理盐水将其稀释。用灭菌枪头或滴管吸取1mL待测样品稀释液均匀涂布在国标法推荐的平板上和本发明测试片上，以1mL灭菌生理盐水作为空白对照，在36±1℃条件下，培养24h后，记录观察结果如下表2和表3：

表2不同的检测方法检测结果比对表(培养时间24h，培养温度36±1℃)

表3不同的检测方法检测结果比对表(培养时间24h，培养温度36±1℃)

上述实验结果表明，本发明测试片检测结果与国标法检测结果的符合度达90％以上。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。