一种基于等离子体的交联装置、使用方法以及应用与流程

本发明涉及一种基于等离子体的交联装置，和该装置的使用方法以及其在生物
技术领域：
的应用。
背景技术：
：现代生命科学进入了分子生物学的时代，对生命现象的研究已经到达了分子的层面。许多实验表明，许多细胞的生命活动涉及到特定DNA区段与特殊蛋白质因子之间的相互作用，例如DNA的复制和修复，RNA的转录和修饰，病毒的转染和增殖等。所以，通过使DNA和蛋白质产生特异性的共价交联来研究蛋白质和DNA的相互作用具有越来越重要的意义。现有的用于研究蛋白质和核酸相互作用的方法主要有紫外交联和甲醛交联两种。紫外交联仪是目前最为主流的用于该方向的仪器，其原理是：在生物体内，蛋白质和核酸形成的是非共价结合，若是这种结合物在紫外线的照射下，DNA分子中的嘧啶碱与蛋白质分子中的多种氨基酸残基(如赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等)之间可形成共价交联。若DNA预先标记过，与DNA结合蛋白结合并经过紫外线照射产生共价交联，再用DNase将未结合蛋白质的DNA去掉，剩下的即为DNA蛋白质共价结合复合物，可用来检测DNA的结合蛋白和其分子量。但紫外线易对样品中的DNA造成损伤(如DNA断裂)，影响检测结果，而且紫外线处理产生共价交联的效率较低。甲醛产生交联的效率较高，但是易产生许多非特异性的交联，且较难准确控制反应时间，且难以进行终止反应。传统的交联方法都有其局限性，因此，研发一种高效准确的可用于研究蛋白质和核酸相互作用的装置就显得尤为重要。低温等离子体是部分电离的气体，包含多种物理和化学效应，如紫外辐射、电磁场、热效应、带电粒子和活性粒子等。目前在水、空气、食品包装材料、食品和粮食的消毒灭菌等领域低温等离子体展现出巨大的潜力。如CN102068912A公开了一种等离子体辐射引发接枝制备荷负电纳滤膜的方法、CN103835002B公开了一种红麻低温等离子与生物酶联合脱胶方法、EP1255616B1公开了通过等离子体活化接枝生产强粘附性表面涂层的方法。然而，现有技术并未公开等离子体技术，特别是大气压低温等离子体技术在核酸和/或蛋白交联领域的应用。技术实现要素：发明概述本申请发明人惊奇的发现可以利用等离子体来研究蛋白质和核酸的相互作用，具有广阔的应用前景。本发明利用等离子体中的活性粒子成分能够使蛋白质和核酸发生共价交联而制备等离子体交联装置。本发明实验结果表明，该等离子体交联装置的交联效率很高，两分钟便可产生明显的共价交联，对结合物中的DNA分子造成的损伤相对较小，非特异性的交联较少，具有高效、准确、无污染等优点。基于此，本发明公开了一种基于等离子体的交联装置，包括反应腔，反应腔内部设有等离子发生装置和待处理样品放置区，等离子发生装置产生等离子体能够使待处理样品中的蛋白质与蛋白质、核酸与核酸、和/或蛋白质与核酸发生共价交联。发明的详细说明可通过以下的编号段落对本文各个方面的实施方式进行说明。1、一种基于等离子体的交联装置，其特征在于，包括反应腔1，所述反应腔1内部设有等离子发生装置2和待处理样品放置区3，等离子发生装置2产生等离子体能够使待处理样品中的蛋白质与蛋白质、核酸与核酸、和/或蛋白质与核酸发生共价交联。2、根据段落1所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，反应腔1还包括底板和顶盖，以及垂直于底板的前盖、后盖、左侧板和右侧板，底板、顶盖、前盖、后盖、左侧板和右侧板围成一个封闭腔体；可选的，底板、顶盖、前盖、后盖、左侧板和/或右侧板设有进气口4和/或出气口5。3、根据段落1或2任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，等离子发生装置2包括板状高压电极9，绝缘介质板6和网状接地电极7，其中，板状高压电极9在最上层，绝缘介质板6在中间，网状接地电极7在底层面对反应腔1腔体内部，板状高压电极9连接高压线。4、根据段落3所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，且所述板状高压电极9的可以调节放电频率和电压；优选的，所述板状高压电极9的电压范围在1kV到20kV之间，频率范围小于等于100kHz，类型为脉冲、直流、交流和射频电源中的一种。5、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述等离子体为低温等离子体。6、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述核酸为DNA和/或RNA。7、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述蛋白质为生物样品中的任何一种或多种蛋白质。8、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，板状高压电极9的材料为导电材料。9、如段落8所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述板状高压电极9的材料为紫铜、不锈钢。10、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，绝缘介质板6的材料为耐高压绝缘有机材料或无机材料。11、如段落10所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述绝缘介质板6的材料为聚四氟乙烯、陶瓷、橡胶、玻璃钢、塑胶、塑料、交联聚苯乙烯、有机玻璃、环氧树脂、聚乙烯、聚碳酸酯、石英玻璃、云母板、电镀板或聚酰亚胺。12、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，网状接地电极7的材料为导电材料。13、如段落12所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述网状接地电极7的材料为合金钢、电镀钢。14、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，待处理样品放置区3包括升降台10，通过改变升降台10的高度，调节待处理样品与等离子发生装置2之间的距离。15、根据段落14所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，改变所述升降台10的高度，使待处理样品与等离子发生装置2之间的距离为0.5-2cm；优选为1cm。16、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述待处理样品为生物样品或是用于生物样品的溶液。17、根据段落16所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述生物样品为微生物菌液、细胞培养物、动植物组织、核酸提取物、蛋白提取物、体外蛋白质与核酸混合物中的一种或多种；所述用于生物样品的溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液等。18、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述交联装置还包括与所述反应腔1连接的气体流量控制器模块11，所述气体流量控制器模块11为等离子发生装置2提供反应气体。19、根据段落18所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述气体流量控制器模块11包括控制器12、气体入口13和气体出口14，其中控制器12通过计算机控制，调整所需的工作气体种类，气体流量和所占配比，其中，气体出口14与等离子体的交联装置相连接。20、根据段落18或19所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述气体流量控制器模块11提供的反应气体为空气、氦气、氩气、氮气、氧气及其混合物中的一种或多种。21、根据段落20所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于，所述气体流量控制器模块11提供的反应气体为氦气。22、根据上述段落任一项所述的基于等离子体的交联装置，其特征在于：所述装置还包括定时功能模块和/或电压选择功能模块，所述定时功能模块可以设定处理的时间，所述电压选择功能模块可以设置不同电压，调节放电功率的大小。23、一种段落1-22任一项所述的交联装置的使用方法。24、如段落23所述的方法，其特征在于包括如下步骤：第一步：对材料进行处理，获得待处理样品；第二步：将待处理样品放置于所述交联装置反应腔1的待处理样品放置区3；第三步：等离子发生装置2产生等离子体；第四步：待处理样品中的蛋白质与蛋白质、核酸与核酸、和/或蛋白质与核酸发生共价交联。25、如段落23所述的方法，其特征在于，所述第一步：1所述材料为微生物菌液和悬浮细胞培养物，处理步骤包括将微生物或悬浮细胞培养物收集后悬浮于生理盐水中，倒入平皿中形成1-2mm厚的薄层，获得待处理样品；或2所述材料为贴壁细胞培养物，处理步骤包括将贴壁细胞培养物中的培养液倒出，用生理盐水洗1-2次，之后覆盖1-2mm的生理盐水，获得待处理样品；或3所述材料为动植物组织，处理步骤包括将动植物组织切成1-2mm厚的薄层，放入平皿中，获得待处理样品；或4所述材料为细胞外样品，处理步骤包括将细胞外的蛋白、核酸或者蛋白和核酸混合后的样品，加入平皿中形成1-2mm厚的薄层，获得待处理样品。26、如段落24-25所述的方法，其特征在于，共价交联所用时间为1-5min，优选为2min。27、一种蛋白交联产物，由段落23-26所述的方法获得。28、一种核酸交联产物，由段落23-26所述的方法获得。29、一种蛋白核酸交联产物，由段落23-26所述的方法获得。30、一种段落1-22所述的交联装置在生物领域的应用。31、如段落30所述的应用，所述生物领域为生物化工领域或生物医学领域。技术术语：本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。用端点值表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点值。当描述一个可测量的值，例如参数、量、时间期限等时，本文中所使用的术语“约”意欲涵盖与指定值相差±20％或更少、优选±10％或更少、更优选±5％或更少、更优选±1％或更少，更优选±0.1％或更少的变化，此类变化适宜在所披露的发明中使用。有益效果：(1)本发明无需其他添加剂，不会对生物样品造成污染；(2)本发明具有定时功能和电压选择功能；(3)本发明采用沿面放电的方式，可以与被处理生物样品大面积接触，提高处理效率；(4)通过调节板状高压电极的频率或电压，使得气体进入的速度和等离子体产生的速度可以同步调节，这样会使得活性成分密度很高，处理效率更高；(5)本发明减少对交联复合物中的DNA分子造成严重的断裂损伤，且交联效率较高，两分钟即可形成共价交联；(6)等离子体发生装置在大气压下进行操作，无需真空腔，设备简单、操作方便、成本较低，而且等离子体处理过后不会产生毒性残留；以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。附图说明附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制，在附图中：图1：等离子体交联装置的结构图；图2：等离子体发生装置的结构图；图3：带有升降台和气体流量控制器模块的等离子体交联装置的结构图；图4：气体流量控制器模块的结构图；图5：采用等离子体交联装置体外处理蛋白质和DNA混合物的琼脂糖凝胶电泳图。附图标记说明1反应腔2等离子发生装置3待处理样品放置区4进气口5出气口6绝缘介质板7网状接地电极8高压电9板状高压电极10升降台11气体流量控制器模块12控制器13气体入口14气体出口具体实施方式下面结合图1-5具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1等离子体的交联装置等离子体的交联装置主要包括反应腔1，反应腔1可以为长方体、立方体或其他形状，在反应腔1内部设有等离子发生装置2和待处理样品放置区3，其中，等离子发生装置2产生等离子体能够使待处理样品中的蛋白质与蛋白质、核酸与核酸、和/或蛋白质与核酸发生共价交联。待处理样品放置区3用于放置待处理样品。反应腔1包括底板和顶盖，以及垂直于底板的前盖、后盖、左侧板和右侧板，该底板、顶盖、前盖、后盖、左侧板和右侧板可以围成一个封闭腔体。进气口4和出气口5分别设置在反应腔1的一端和另一端，等离子体发生装置2固定在反应腔1的上部。等离子体发生装置2，即板状高压电极9，绝缘介质板6和网状接地电极7三层贴合在一起作为反应腔的顶盖，板状高压电极9在最上层，绝缘介质板6在中间，网状接地电极7在底层面对着反应腔1腔体内部，高压电极连接着高压线。当工作时，从进气口4加入空气、氦气、氩气、氮气和/或氧气等多种气体以及这些气体在不同配比下的混合气体。通入的气体在离子体发生装置2处被电离产生等离子体，等离子体中的活性粒子再扩散到反应腔1腔体中，对待处理样品放置区3的生物样品进行处理。等离子体发生装置2包括板状高压电极9，绝缘介质板6和网状接地电极7。其中，板状高压电极9用于调节放电频率和电压。板状高压电极9和高压电相连，在高压电的激励下，等离子体发生装置2在工作气体中进行放电产生等离子体。根据实验需要，板状高压电极9的电压范围在1kV到20kV之间，频率范围小于等于100kHz。绝缘介质板6可以使用聚四氟乙烯、陶瓷、橡胶、塑胶、塑料、玻璃和/或电镀板等绝缘介质材料制作而成。网状接地电极7根据实验需要，可以通过增大等离子体发生装置2中板状高压电极9，绝缘介质板6和网状接地电极7的体积、电极的面积、数量，提高一次性处理生物样品的量从而提高处理效率。高压电电源也可以是脉冲高压电源，其脉冲频率不高于100kHz。脉冲高压电源的频率越高，等离子体的处理速度越快，而且放电电压越低，但等离子体温度会随频率升高。就本技术方案而言，在脉冲高压电源激励下，活性粒子的生成效率更高，同时由于降低了总的放电功率，使得等离子体温度进一步降低。实施例2内置升降台和/或外接气体流量控制器模块的等离子体交联装置待处理样品放置区3可以放置升降台10，升降台10可以调节待处理样品与等离子体发生装置2之间的距离，一般所用距离为1cm。使用时先将需要产生交联的目标生物样品(主要包括微生物菌液、细胞培养物、动物组织、体外蛋白质和DNA或者其混合物等)加入所配套的皿上，然后将皿放入腔体内的升降台10，调整好高度，然后产生等离子体进行处理。等离子体交联装置还可以外接气体流量控制器模块11，该气体流量控制器模块11的作用在于为等离子发生装置2提供反应气体。气体流量控制器模块11包括控制器12、气体入口13和气体出口14，其中控制器12通过计算机控制，其中，气体出口14与等离子体交联装置的进气口4相连接。气体流量控制器模块11可以通过计算机和控制器12控制产生等离子体的工作气体的种类，且调节每种气体的流量流速和所占配比。除此之外，等离子体交联装置还可以包括定时功能模块和电压选择功能模块，其中，定时功能模块可以设定处理的时间，电压选择功能模块可以设置不同电压，调节放电功率的大小。实施例3等离子体的交联装置对蛋白质进行交联试验1、材料：小分子蛋白(由25个氨基酸组成，由宁波康贝生化有限公司合成)。2、方法：小分子蛋白(0.1mg/ml)，选用聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和空气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体：样品1：对混合物样品处理分别1min后获得；样品2：对混合物样品处理分别2min后获得；将50微升样品加入96孔板中，96孔板放置于腔体内的待处理样品放置区上，电源加电压激励电极放电产生等离子体进行处理。将处理后样品采用MALDI-TOF质谱检测分子量。3、结果表1等离子体的交联装置对蛋白质交联试验结果样品1样品2处理前分子量约2947Da分子量约2947Da处理后分子量约5862Da分子量约5862Da实施例4等离子体的交联装置对蛋白质-DNA进行交联试验1、材料处理样品3：微生物菌液和悬浮细胞培养物，处理步骤包括将微生物或悬浮细胞培养物收集后悬浮于生理盐水中，倒入平皿中形成1-2mm厚的薄层，获得待处理样品；样品4：贴壁细胞培养物，处理步骤包括将贴壁细胞培养物中的培养液倒出，用生理盐水洗1-2次，之后覆盖1-2mm的生理盐水，获得待处理样品；样品5：动植物组织，处理步骤包括将动植物组织切成1-2mm厚的薄层，放入平皿中，获得待处理样品；样品6：细胞外样品，处理步骤包括将细胞外的蛋白、核酸或者蛋白和核酸混合后的样品，加入平皿中形成1-2mm厚的薄层，获得待处理样品。2、使用等离子体的交联装置进行交联反应聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和空气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体，处理样品与等离子发生装置之间的距离为1cm，对样品处理4min。采用酚-氯仿抽提的方法，提取样品3-5的基因组DNA。离心收集处理后的培养物或者组织，用生理盐水悬浮后加入等体积的酚-氯仿，充分混匀，离心，吸取上清，将上清与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS的琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析。样品6直接与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS的琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析。3、结果未处理的样品3-6中，蛋白质DNA迁移较快，位于比较前面的位置；处理后的样品3-6中，蛋白DNA与蛋白共价交联结合，形成分子量较大的复合物，位于进样孔处，不能进入凝胶。表2等离子体的交联装置对蛋白质-DNA交联试验结果样品3样品4样品5样品6处理前可进入凝胶可进入凝胶可进入凝胶可进入凝胶处理后进样孔处进样孔处进样孔处进样孔处实施例5等离子体的交联装置对蛋白质与DNA进行交联试验1、材料：组蛋白histone(公司Worthington，批号34E7307N)与pUC18质粒DNA(公司Thermofisherscentific，批号Lot00134262)。2、方法：将组蛋白histone(0.1mg/ml)与pUC18质粒DNA(0.1mg/ml)混合后，选用聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和空气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体：样品7：对混合物样品处理分别1min后获得；样品8：对混合物样品处理分别2min后获得；样品9：对混合物样品处理分别3min后获得；样品10：对混合物样品处理分别4min后获得；将样品加入96孔板中，96孔板放置于腔体内的待处理样品放置区上，电源加电压激励电极放电产生等离子体进行处理。将处理后样品与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS(公司Bio-rad，批号L1610302)的琼脂糖凝胶(公司HyAgarose，批号14150906029)中进行电泳分析。3、结果：未处理的样品中，pUC18质粒DNA迁移较快，位于比较前面的位置；处理1min时，蛋白与DNA共价交联结合，pUC18质粒DNA迁移率变慢，因为DNA上共价结合的蛋白数量不同造成迁移率不同，形成弥散状的条带。随着处理时间的延长，处理2min时，pUC18质粒DNA结合的蛋白越来越多，形成的复合物越来越大，迁移率也变得更慢，开始形成不能进入凝胶的复合物。处理3或4分钟时，pUC18质粒DNA全部与蛋白结合形成大复合物，不能电泳进入琼脂糖凝胶。从图5可以看出，本发明具有明显的处理效果和较高的处理效率，效果与处理时间呈正相关。实施例6等离子体的交联装置对DNA进行交联试验1、材料：pUC18质粒DNA(公司Thermofisherscentific，批号Lot00134262)。2、方法：pUC18质粒DNA(0.5mg/ml)，选用聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和空气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体：样品11：对混合物样品处理分别1min后获得；样品12：对混合物样品处理分别2min后获得；样品13：对混合物样品处理分别4min后获得；将处理后样品与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS(公司Bio-rad，批号L1610302)的琼脂糖凝胶(公司HyAgarose，批号14150906029)中进行电泳分析。3、结果：参见表2，未处理的样品中，DNA迁移较快，位于比较前面的位置；处理后的样品11-13中，DNA与DNA共价交联结合，形成复合物。表3等离子体的交联装置对DNA交联试验结果样品11样品12样品13处理前2kb处2kb处2kb处处理后大于2kb弥散条带进样孔处进样孔处实施例7等离子体的交联装置处理溶液用于样品交联1、材料处理：样品14：微生物菌液和悬浮细胞培养物，处理步骤包括将微生物或悬浮细胞培养物收集后悬浮于生理盐水中，再次离心收集；样品15：贴壁细胞培养物，处理步骤包括将贴壁细胞培养物中的培养液倒出，用生理盐水洗1-2次；样品16：动植物组织，处理步骤包括将动植物组织切成1-2mm厚的薄层，放入平皿中待处理；样品17：细胞外样品，处理步骤包括将细胞外的蛋白、核酸或者蛋白和核酸混合。2、方法：选用生理盐水作为处理溶液，选用聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和氧气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体：对生理盐水溶液放置于腔体内的待处理样品放置区上，电源加电压激励电极放电产生等离子体进行处理，将处理后的生理盐水加在样品中。采用酚-氯仿抽提的方法，提取样品14-16的基因组DNA。离心收集处理后的培养物或者组织，用生理盐水悬浮后加入等体积的酚-氯仿，充分混匀，离心，吸取上清，将上清与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS的琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析。样品17直接与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS的琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析。4、结果参见表3，未处理的样品14-17中，蛋白质DNA迁移较快，位于比较前面的位置；处理后的样品14-17中，蛋白DNA与蛋白共价交联结合，形成分子量较大的复合物，位于进样孔处，不能进入凝胶。表4等离子体的交联装置处理溶液用于样品交联实验结果样品14样品15样品16样品17处理前可进入凝胶可进入凝胶可进入凝胶可进入凝胶处理后进样孔处进样孔处进样孔处进样孔处实施例8与紫外交联效果的比较1、材料：组蛋白histone(公司Worthington，批号34E7307N)与pUC18质粒DNA(公司Thermofisherscentific，批号Lot00134262)。2、方法：样品18：pUC18质粒DNA(0.1mg/ml)，选用聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和空气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体，对混合物样品处理2min后获得；样品19：将组蛋白histone(0.1mg/ml)与pUC18质粒DNA(0.1mg/ml)混合后，选用聚四氟乙烯为绝缘介质材料，采用氦气和空气的混合气体作为工作气体放电产生低温等离子体，对混合物样品处理2min后获得；对照1：pUC18质粒DNA(0.1mg/ml)，选用254nm紫外灯，功率约为200mW/cm2，对混合物样品处理10min后获得；对照2：将组蛋白histone(0.1mg/ml)与pUC18质粒DNA(0.1mg/ml)混合后，选用254nm紫外灯，功率约为200mW/cm2，对混合物样品处理10min后获得；将处理后样品与上样缓冲液混合后在含有0.5％SDS(公司Bio-rad，批号L1610302)的琼脂糖凝胶(公司HyAgarose，批号14150906029)中进行电泳分析。3、结果：表5等离子体交联与紫外交联比较分析实验结果以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页1 2 3