HPV16抗体作为浸润前和浸润性疾病的诊断和预后生物标志物的制作方法

本申请要求2014年3月27日提交的美国临时专利申请No.61/971,425的优先权。

政府权利的声明

根据国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的U01CA117374，本发明在政府支持下作出。美国政府在本发明中具有一定的权利。

技术领域

本发明涉及包括用于HPV相关疾病的诊断和预后应用的生物标志物的方法和材料。

背景技术：

体液免疫应答的检测对于感染性疾病和自身免疫的诊断和预后是必不可少的，并且还可以为癌症检测提供生物标志物。已经开发出几种蛋白质组多重免疫测定法来促进这些抗体的检测。特别是，基于载玻片的测定法是用于抗体检测的极好的发现工具，但是需要在常规免疫实验室中一般不存在的专门的高通量设备。

人乳头瘤病毒(HPV)是最常见的性获得性感染，估计多达75％的性活跃者在他们一生中被一度感染。HPV的生殖器感染通常是在初次性行为之后不久获得的，并且在青少年和年轻的成年人中患病率最高。在大多数情况下感染是短暂而无症状的，并且患病率一般随年龄降低。持续的生殖器感染很可能与肿瘤进展相关，其中浸润性癌症在感染后许多年(一般为数十年)发生。HPV16和18感染已经明确地与口咽癌(OPC)、宫颈癌、肛门癌和其他恶性肿瘤相关。确实，公认西方世界中大多数OPC病例与HPV感染有关系并且数量正在上升。

急性HPV感染诱导体液免疫应答，主要针对HPV来源的潜伏蛋白L1。针对L1衣壳蛋白的抗体在病毒感染后被诱导并持续数年。在宫颈癌患者的血清和宫颈阴道分泌物二者中以及在OPC患者的血清中已经检测到低水平的针对E6和E7二者的抗体。针对HPV16E6和HPVI6E7的抗体在ICC过程中后期出现，并且已经显示与疾病后果有关。在宫颈癌确诊之前收集的血清的研究已经表明，E6和E7特异性抗体的存在与2.7的增加的宫颈癌相对风险有关，并且在确诊前最多5年就可以检测到。尚不知道在血清和/或宫颈粘液中定量或定性的抗体水平是否能预测是清除还是持续和进展。

技术实现要素：

需要一种生物标志物，其可以充当HPV相关疾病、包括浸润性宫颈癌(ICC)和口咽癌(OPC)的诊断和预后检测器。HPV DNA试验的灵敏性显著高于当前的ICC筛查方法，并且随着HPV疫苗的到来，对于疫苗遗漏宫颈癌的成本有效并且特异性的筛查，存在着需求。

本公开的目的是确定HPV16特异性的早期基因抗体作为早期诊断ICC和OPC的生物标志物以及预后和风险评估的生物标志物的鉴别性质。本发明人已经发现，HPV16抗体的模式在ICC和OPC之间显著不同，并且在ICC中与宫颈疾病进展强烈相关，但不与HPV16感染强烈相关。该数据支持HPV抗体应答和抗体特征是HPV相关恶性肿瘤的特异性生物标志物并可应用于早期检测、预后和风险评估的假设。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。材料、方法和实施例仅仅是说明性的而不打算是限制性的。在本文中提到的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库登录、和其他参考文献都以它们的全文通过引用并入。在冲突的情况下，以本说明书、包括定义为准。

根据以下详细描述和附图并根据权利要求，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1描绘了在宫颈疾病患者中多种HPV16抗体的特异性检测。HPV16蛋白质被表达为GST融合蛋白并捕获在Luminex珠子上。显示了在血清中检测到的IgG的MFI比率(MFI(HPV)/MFI(p21-GST)。测量患有CIN 0/I、CIN II/III、和浸润性宫颈癌的患者中的血清IgG应答。检测患有浸润性宫颈癌的患者中针对E1、NE2、E4、E6和E7蛋白的HPV16特异性抗体，与患有浸润前疾病CIN II/II或CIN 0/I的女性对照相比较。CIN 0/I与CIN II/III之间的个体血清学没有显著差异。

图2显示了HPV16IgG的血清学测定法的特异性。A)在HPV16+病例的血清中选择性检测HPV16抗体。对54例HPV16肿瘤状态已知的浸润性宫颈癌(HPV16+，n＝34；HPV16-，n＝20)进行子集分析。

图3示出了在HR HPV+口咽癌和HPV16+宫颈癌中HPV16抗体的比较。测量浸润性宫颈癌(n＝34)和口咽癌患者(OPC，n＝5O)的血液中的HPV16抗体水平。在OPC中更强烈地检测到针对HPV16E1、NE2、CE2、E6和E7的HPV16抗体(p<0.0001)。

图4描绘了在HPV16+浸润性宫颈癌(ICC，n＝34)和口咽癌(HPVOPC，n＝50)患者血清中HPV16特异性抗体的无监督分层聚类。ICC患者或者主要具有HPV16E7抗体(组I)或者没有抗体(组II)。大部分HPVOPC患者(组III)具有多种HPV特异性抗体，包括E1、E2、E6和E7。强度以对数尺度显示。

具体实施方式

本文中描述的实施方式涉及最近采用的用于检测血清中抗体的新蛋白阵列技术。利用哺乳动物体外转录/翻译将编码HPV16抗原的全长cDNA表达为c-端GST融合蛋白，并将其捕获在Luminex珠阵列上(快速珠阵列ELISA)。利用来自OPC患者的血清，我们已经特异性检测到针对多种HPV16来源的抗原的抗体，包括E1、E2、E4、E6、和E7抗体。我们还检测了在临床上同类患者群组内的免疫应答模式的变异性，提示在OPC患者中这种病毒的免疫识别存在生物差异。

为了确定对HPV的免疫应答是否是浸润前和浸润性宫颈疾病检测和预后的潜在生物标志物，我们使用快速珠阵列ELISA来检测针对HPV16来源的抗原的血清和宫颈分泌物IgG和IgA抗体。为了评估这些抗体作为生物标志物的潜在效用，我们将这些结果与在扩大的口咽癌患者群组中检测的血清IgG抗体进行比较。在此，我们证明了针对早期基因的HPV16IgG的广度和量随着进行性宫颈疾病而增加，并且早期基因抗体是浸润性HPV16相关癌瘤的特异性生物标志物。

另外，与ICC相比，来自OPC患者的血清具有不同的HPV16特异性抗体模式，提示在这两个解剖部位之间病毒抗原表达或免疫监视的病理生理学存在差异。

在其他实施方式中，描述了诊断人乳头瘤病毒(HPV)介导的癌症的系统。例如，系统可以包括偶联有针对HPV16早期基因蛋白的多种抗体的基质(例如肽芯片)、可视化剂(例如，一种或多种标记的第二抗体)、和具有与HPV介导的癌症相关的结合模式的对照，用于将与早期基因蛋白结合的HPV16抗体的可视化模式与跟HPV介导的癌症相关的对照进行比较。

在下面的实施例中进一步描述了本发明，所述实施例不限制权利要求中描述的发明的范围。

实施例

实施例1

用于宫颈疾病分析的血清选自在Atlanta、GA、Detroit、MI或Galveston市公立医院从就诊于阴道镜检查诊室的女性收集的早期检测研究网络(Early Detection Research Network)(EDRN)和疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)生物样本库。该样本集由CIN 0lI(n：121)和CIN II/III(n：162)患者血清组成，代表就诊于阴道镜检查诊室的患者。其中，CIN 0/I(n：33)和CIN IVIII(n＝52)的子集是年龄、种族和HPV16状态匹配的。包括来自95个患有浸润性癌症的女性的存档匿名血清用于分析。从Dana Farber癌症研究所(Dana Farber Cancer Institute)、约翰霍普金斯医疗中心(Johns Hopkins Medical Center)和西奈山医学院(Mt.Sinai School of Medicine)获得OPC癌症患者血清。所有样品在癌症治疗之前获得，并且是被回顾性选择的。研究群体的人口统计学示于表1中。在所有研究中，利用标准化样品收集方案收集样品并储存在-80℃直到使用。在机构审查委员会批准下，从所有受试者获得书面知情同意书。

宫颈分泌物选自相同的EDRN生物样本库，并且对于74个捐献用于浸润前比较的血清的女性和13个患有浸润性宫颈癌的女性来说，宫颈分泌物是可用的。前面已经描述了收集和处理方法。简单来说，通过吸收到Weck-Cel海绵(Xomed外科产品，Jacksonville，FL)中来收集宫颈分泌物，所述海绵被速冻并储存在-80’C，直到用M-PER提取试剂提取。

通过巢式PCR利用基因特异性引物从HPV16质粒DNA(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)按所描述的获得HPV16基因。按照制造商的说明书将PCR产物插入pDONR22l载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并转化到pANTT_GST载体(http：//dnasu.asu.edu/DNASU/Homejsp)以获得最高蛋白质表达(24)。SeroMAP羧化微球(Luminex Corporation，Austin，TX)以5mg抗GST抗血清(GE Healthcare，Piscat away,NJ)比1百万珠子的比率偶联。利用T7网织红细胞裂解物(Promega Corporation，Madison，WI)按照制造商的推荐用500ng DNA将每个HPV基因表达为GST融合蛋白。p21-GST被表达作为阴性对照蛋白。HPVI6E2被表达为N-端NE2(bp#2755-3303)和C端CE2(bp#3304-3852)蛋白，其显著改善蛋白表达和抗体检测二者。珠阵列ELISA基本按所描述的进行。

将体外转录或/翻译(IVTT)产物各自捕获在微球上，合并，并用含各10％的来自小鼠、兔子、山羊和大鼠的正常血清、0.5％聚乙烯醇(PVA，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、0.8％聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和2.5％Superchemiblock(Millipore，Billerica，MA)的PBS-I％BSA封闭。将血清在封闭缓冲液中以1：80稀释，宫颈粘液以1：5稀释，并与珠子一起温育过夜。生物素偶联的山羊抗人IgG或IgA抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)和链霉亲和素-R-PE(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)用于检测IgG。为了建立ELISA截止值，MFI比率>(50个健康对照样品的(平均值+3倍标准偏差)被定为阳性。这些水平是E1：5.4，NE2：8.5，CE2：6.8，E4：2.3，E.5：4.2，E6：9.0，E7：6.6，L1：9.5，和L2：8.0。

在PreservCyt介质中收集的脱落宫颈细胞提取物中如前面所述检测HPV DNA。简单地说，利用MasterPure完整DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre，Madison，WI)提取16ml的PreservCyt收集介质。利用检测22种高风险和15种低风险类型的Roche线性测定法进行HPV检测和分型。

在改良的直接ELISA中使用从杆状病毒在昆虫细胞中表达而制备的HPV16VLP来检测IgG。在每个板上测定用HPV16国际标准血清(IS-16，NIBSC，UK)校准的参比血清样品的抗体(IU/ml)。受试样品以1:10、1:31.6和1:100稀释3.16倍用于试验，抗体滴度利用平行线性测定法来测定。通过机构内部封闭测定法或cLIA测定的对HPV16具有低和负反应性的混合成人血清被用作阳性和阴性对照。所述混合阴性血清对于针对HPV16、18、6和11的抗体来说是阴性的，并用于根据IS-16产生截止值。根据HPV16国际标准血清(NIBSC，UK)计算每个样品的抗体滴度。来自浸润前宫颈疾病的总共77个血清通过HPV16VLP-IgG ELISA进行测试，以与珠阵列ELISA进行比较。

分泌型碱性磷酸酶(SEAP)HPV16假病毒粒子中和(PsVN)测定法测量功能性L1IL2特异性抗体，并按所描述的在少许修改下进行。将血清样品在中和缓冲液[不含酚红，含有1％非必需氨基酸、1％Glutamax、10％胎牛血清、1％抗生素-抗霉菌素、和1％Hepes(pH 7.5)的DMEM]中稀释2倍。对于血清来说，最终的样品稀释度在1:20至1:10240的范围内，并在HPV16和BPV1这两种假病毒粒子上进行测试。阳性滴度被计算为与单独的在中和缓冲液中的HPV16假病毒相比SEAP活性显示出50％中和时的最高稀释度的倒数。如果滴度是40或更高并与相同样品的BPV1中和滴定的滴度具有四倍差异，则血清样品被认为是阳性的。测试了来自浸润前宫颈疾病的总共66个血清，以与珠阵列ELISA进行比较。

利用Luminex200IS 2.3软件，HPV16抗体被测量为中位荧光强度(MFI)。每个珠区域计数五十个事件。利用Mann-Whitney非参数分析(GraphPad Prism version 5.0c，San Diego，CA)进行比较。Cohen’s Kappa统计评估HPV16PsVN测定法、VLP-IgG ELISA和珠阵列ELISA之间的一致性。还进行了McNemar’s检验以评估一种试验比另一种试验更可能阳性的似然性。还利用逻辑回归模型评估了预测具有抗体阳性应答的似然性的比值比(OR)。计算每次评估的95％置信区间(CI)。在p<0.05水平下获得这些检验的统计显著性。在17.0版SPSS statistics(SPSS Inc.)中，利用VassarStats统计计算网站或2.9.2版R进行数据分析。

我们的主要目标是确定HPV16特异性抗体在CIN 0/I的健康对照女性(n＝121)和CIN II/III的女性(n＝162)之间是否有定量和定性的差异，以用作HR HPV DNA以外的生物标志物来改善CIN II/III的检测和风险评估的特异性。我们的次要目标是确定HPV16抗体生物标志物频率对不同的HPV相关恶性肿瘤的特异性。从疾病控制和预防中心的NCI EDRN生物样本库回顾性选择来自CIN 0/I、CIN II/III、和ICC患者的血清和宫颈分泌物。所有样品是从经历阴道镜检查的女性回顾性获得的，所述阴道镜检查被定为代表筛查性阴道镜检查临床学。

CIN 0/1和II/III样品是年龄均匀匹配的(表1)，并且是HR HPV部分匹配的。CIN II/III病例的HR HPV+比例高于CIN 0/1的HR HPV+比例(95.7％对59.5％，特别是HPV16+)，并且这两个组中都存在数量可观的患者具有至少2种类型的宫颈感染(表1)。

在宫颈Pap筛查普及的美国，浸润性宫颈(ICC)癌和浸润性OPC二者都是比较不常见的恶性肿瘤。我们从ICC患者回顾性选择了储存的血浆或血清；在血浆和血清之间没有注意到始终一致的差异，并将结果合并以供分析。这些样品是在过去的10年间获得的。正如所预料的，这些患者比CIN II/III女性老(平均50.1岁对29.3岁，表1)，反映了宫颈致癌的时滞性。ICC病例中超过50％的病例是HPV16+。显著百分比(19.4％)的浸润性宫颈病例被报道是HPV阴性的。HR HPV+OPC病例，以及混合的血清和血浆，是在临床诊断之后、治疗开始之前获得的。正如所预料的，这些病例中的大部分病例是男性(93.9％)。

在CIN 0/1、CIN II/III、和浸润性宫颈癌患者血液中通过珠阵列ELISA测量针对HPV16抗原的血清IgG抗体(图1)。为了控制非特异性和GST特异性的自身抗体背景，显示了个体HPV特异性抗体的MFI与对照p21-GST抗原的MFI的比率(表2a)。与0/26(0％)HPV+CIN 0/I对照和3/95(3％)HPV+CIN II/III相比，在9/34(26％)HPV16+ICC病例的血清中检测到至少一种HPV16E1、E2、E6或E7抗体。在CIN 0/I女性和CIN II/III女性中，个体HPV16血清学的MFI比率相似。

在HPV16L1珠阵列信号强度、cLIA VLP滴度和假病毒粒子测定法之间没有观察到显著的相关性，可能表示在这两种测定法中检测不同的抗原结构展示(数据未显示)。总共66个患者样品通过cLIA和PsVN测定法测定，31个是CIN 0/I并且35个是CIN II/III。16个CIN 0/I患者是cLIA+，其中13个还是PsVN+。所有的cLIA+是HR HPV+，但只有13个cLIA+是HPV16+。通过所述珠ELISA测定的，30个CIN0/I是L1-。在CIN II/III组中，20个患者是cLIA+，其中19个还是PsVN+和HR HPV+。通过所述珠ELISA测定的，该19个患者中的5个患者还是L1+。我们的L1测定法与PsV+CIN II/III的小子集(5/35)有相关性，其中只有1个不一致(L1Ab+/PsV-)的病例，并且与Merck cLIA L1测定法不相关。

为了比较来自CIN II/III和ICC患者的血清中HPV16抗体的频率，检查来自95个浸润性宫颈癌患者的血液中的HPV16抗体(图1)。随着浸润性宫颈瘤形成，E1、NE2、E4、E5、E6、E7、和L1抗体水平增加(p<0.0001)。为了确定HPV16抗体的检测对于HPV16+ICC来说是否是特异性的，我们进行了来自已知是HPV16+ICC病例的宫颈肿瘤女性(n＝34，其中4个具有包括HPV16在内的多种感染)和已知是HPV16阴性对照的患有肿瘤的女性(n＝20)的样品的子集分析(图2a)。41例ICC肿瘤具有未知的HPV感染状态，将这些血清从分析中排除。我们证实了在HPV16+ICC患者的血液中特异性检测HPV16E6抗体。在HPV16+ICC病例中选择性地检测到针对E1、NE2、E4、E6、E7、L1和L2的抗体(13/34(39％)病例具有至少一种早期基因抗体)。

为了确定HPV16特异性抗体是否在宫颈中分泌，利用宫颈拭子收集宫颈分泌物。我们直接比较了在来自87个CIN 0/1、CIN II/III和ICC患者的血清中和宫颈分泌物中检测的HPV16特异性抗体(数据未显示)。对于ICC来说，在宫颈分泌物和血清中检测到的IgG之间具有强相关性(R²＝0.73-0.99)，但平均来看，宫颈IgG弱于血清IgG。因为IgA在分泌物中的浓度可能高于IgG，我们直接比较了在来自ICC患者的血清(未显示)和宫颈分泌物中检测的HPV16特异性IgG和IgA抗体(图2b)。对于E6(p＝0.0004)、E7(p＝0.02)和L1(p＝0.007)来说，IgG检测强于IgA。没有特异性检测到针对其他HPV16抗原的IgA应答、或者在CIN II/III中的IgA应答(数据未显示)。这些结果提示，虽然粘膜IgG可能具有作为非浸入性测定法的临床效用，但粘膜IgG或IgA的测量并不存在超过血清IgG的益处。

关于HPV抗体血清测定法的一个顾虑是新兴流行的额外的宫颈HPV相关恶性肿瘤，例如HPV+OPC。我们最近在新诊断的OPC患者的血清中鉴定到了强HPV16E1、E2、E4、E6和E7抗体。在患者血清中检测出E1和E2抗体是令人惊讶的，因为在ICC中没有鉴定到。在此，我们直接比较了浸润性宫颈癌(n＝95，其中34(36％)已知是HPV16+)和OPC(n＝50已知是HR HPV+，在这50中，28(56％)已知是HPV16+并且剩余的>90％据估计是HPV16+)患者的HPV16抗体水平。

正如所预料的，OPC病例比宫颈癌患者老(平均54.7岁)并且主要是男性，这与临床发生率一致。我们已经鉴定到，在男性和女性OPC患者之间HPV16抗体水平没有差异(数据未显示)。这些是回顾性样品，并且ICC和OPC血清是从本国的不同地区收集的。浸润性OPC血清中通过珠阵列检测到的抗体显著高于浸润性宫颈血清中的抗体(图3)。

特别是，几种抗体在ICC和OPC血清之间有别：E1、NE2、CE2、E6和E7(p<0.00l)，提示E1和E2抗体可能是OPC的特异性生物标志物。如图3所看出的，在6/34(18％)HPV16+ICC病例中检测到强E7特异性抗体应答，提示这些患者能够对早期基因抗体发动IgG应答。那些病例都没有可检测的E1或E2抗体。相反，92％的具有E7抗体的HR HPV+OPC病例具有E1和/或E2抗体。正如所预料的，L1/L2血清学(其代表对生产性感染的应答)在OPC和ICC病例之间没有显著差异。

为了评估在阴道镜检查诊室环境中HPV16抗体检测加上HR HPV分型来鉴定CIN II/III病例的附加益处，我们进行了多变量分析来确定HPV16抗体是否增加了CIN II/III检测的特异性。利用来自未知HPV或暴露状态的50个健康供体的血清，建立每种HPV16抗原的阳性血清学的截止值(表2b)。在该测定中，来自CIN 0/I和CIN II/III受试者的血清对任何HPV16抗原都具有低抗体检出频率(0-4％)。6/121(5％)的CIN 0/I对照和13/162(8％)的CIN II/III病例是至少一种抗体阳性的。利用没有HR HPV状态的所有抗体，我们开发了灵敏度为95.7％的逻辑回归分类器，但特异性只有20.7％；在留一交叉验证研究中，所述分类器产生92.0％灵敏度和17.4％特异性。总之，对HR HPV DNA分型加上抗体水平导致CIN II/III检测在降低的灵敏度下特异性的适度改善。

在证实HPV16+的ICC病例的子集中，6/34例(18％)是E7抗体阳性的，6/34(18％)是E4抗体阳性的，并且11/34(32％)是E4或E7抗体阳性的(表2b)。至于HR HPV+OPC病例(估计>90％HPV16+)，36/50(72％)对E1、NE2、CE2和E7中的每一种都是阳性的，而检测出E4抗体或E6抗体的频率较低(40％)。多重评估所有早期基因抗体改善了检测灵敏度，21/95(22％)的ICC病例、13/34(38％)的ICC HPV16+病例、和47/50(94％)的HR HPV+OPC病例是至少一种抗体阳性的。

基于所有早期基因抗体的逻辑回归分类器还改善了与宫颈疾病相比OPC的检测特异性，与4/121(3％)的CIN 0/I对照和11/162(7％)的CIN II/III病例相比，在1/95(1％)的ICC病例、1/34(2.9％)的ICC HPV16+病例、和46/50(92％)的HR HPV+OPC病例中产生阳性。在交叉验证研究中，所述分类器在2/95(2％)的ICC病例，2/34(5.9％)的ICC HPV16+病例、44/50(88％)的HR HPV+OPC病例、4/121(3％)的CIN 0/1对照和11/162(7％)的CIN II/III病例中产生阳性。

当前宫颈疾病的筛查指南主要依靠细胞学筛查，例如用于年龄超过21岁的女性的常规筛查的Papanicolaou(Pap)试验。Pap试验的灵敏度有限(估计为51-61％)，用基于液体的细胞学测试时可能较高，后者在美国更普遍使用。在筛查策略中并入分子测定法例如HPV DNA测试来检测浸润前宫颈疾病是最近几项大规模临床试验的目标。这些结果证明HPV DNA测试对于高等级CIN的灵敏度显著高于细胞学筛查，但具有较低的特异性。在随机化的加拿大宫颈癌筛查试验中，对于年龄超过30岁的女性，与HPV DNA测试(94.6％)相比，Pap试验筛查具有55.4％的灵敏度。类似地，在瑞典的随机化对照试验中，HPV DNA和Pap试验筛查的组合导致CIN II/III发生率减少，但进行双重筛查导致成本增加以及转给结肠镜检查的女性的阳性预测值降低。基于液体的细胞学筛查和HPV DNA的依次共同测试没有引起CIN II/III检测的显著变化，但现在在美国临床用于超过30岁的女性。开发改善HPV DNA测试对于CIN II/III的诊断的特异性的生物标志物可以显著影响HPV DNA测试作为主要筛查工具的效用。

靶向HPV16和HPV18的有效HPV疫苗的开发预计将改变HPV靶向筛查分析的验前概率。因为感染和肿瘤形成之间的自然史很长，因此在获得高覆盖度后大于15年期间不会出现疫苗对癌症发生率的影响。筛查疫苗遗漏的宫颈癌将需要更加有效率的成本有效性和特异性的筛查工具，因为与大多产生要随访的转诊的低等级病变相比，疫苗对需要治疗的高等级病变具有更大的影响。

在此，利用用于检测人类血清中HPV16特异性IgG抗体的新测定法，我们在转给阴道镜检查的女性群组的血清中测量了HPV16特异性早期基因抗体的频率。我们的结果证明，与CIN 011对照相比，在未治疗的CIN II/III患者的血清中没有特异性地检测到针对多种HPV16来源的早期蛋白的抗体，并对没有浸润性癌症的感染不灵敏。虽然HPV DNA可以检测瞬时以及持续的HPV感染，但有可能HPV特异性早期基因抗体只在持续感染或癌症发展后才出现。我们集中在检测HPV16特异性抗体上，所述抗体在高达55％的宫颈癌中检测到。在浸润性宫颈疾病中检测到针对E1、E2、E4、E6和E7的HPV16特异性抗体，流行率为38％的HPV16+病例(总体的22％)是至少一种抗体阳性。

对于浸润性疾病，HPV16特异性抗体的检测对于具有HPV16或根据PCR具有HR HPV DNA的病例来说是特异性的。虽然将血清学测定法扩展到其他致瘤HPV类型可改善所述抗体测定法对于浸润性癌症的灵敏度和效用，但它不太可能对选择高风险患者进行阴道镜检查有用处，但可能对于早期检测浸润性宫颈癌有效用。

HPV16作为口咽癌的主要和优势风险因数的出现产生了以下顾虑：检测HPV特异性早期基因血清抗体不能区分出宫颈疾病和口咽疾病，导致向结肠镜检查和耳鼻喉科诊室的双重转诊。尚不知道预防性疫苗是否会预防HPV相关的口咽肿瘤，并且在临床试验中直接证明是困难的，因为缺乏能用作替代终点的公认的癌症前体。比较在宫颈中与口咽中有HPV阳性肿瘤的人员中对HPV蛋白的免疫应答，可以提供在这两个不同的解剖部位中宿主/病毒相互作用和癌症发病的机制方面的相似性或差异的直接证据。这也可以鉴定处于OPC高风险下的患者，以便早期干预。

在此，我们直接比较了浸润性宫颈癌和浸润性口咽癌患者之间HPV16抗体检测。我们检测到了在OPC患者的血清中检测的强E1和E2特异性抗体之间的醒目差异，这在浸润性宫颈疾病患者中没有检测到。这可以解释为什么在宫颈癌中即使通过病毒-蛋白质组筛查也没有描述这些抗体，虽然抗原结构的蛋白质展示上的差异可能是较不重要的贡献因素。虽然在此测试的浸润性宫颈患者和OPC患者之间的年龄和性别有差异，但针对E1/E2的抗体的检测在OPC中与年龄或性别无关。

还没有进行OPC和宫颈癌之间的HPV病毒传播、自然史和发病的直接比较。在OPC肿瘤中明确证明了病毒DNA和病毒癌蛋白提示可能存在相同的发病机制。因为通过所述病毒的整合破坏了E1/E2基因，并且抗体检测通常取决于抗原表达，我们的数据提示在OPC和宫颈癌之间在E1/E2的表达率以及可能的病毒整合和游离形式上有差异，提示这两种实体在临床上和生物学上可能不同并且这可能影响HPV靶向治疗。

表1.研究样品的特征

*N每类因为缺失信息而变化。

用于匿名存档样品的HPV测试方法与在生物样本库中使用的方法不同，因此结果不可直接比较。

下列HPV类型被认为是这种分析的高风险类型-HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68

表2a.通过诊断分层的HPV16抗体的MFI比率

*HPV-GST抗原/p21-GST的MFI比率

与CIN 0/I比较，利用未配对Wilcoxon p<0.005，粗体

仅为高风险HPV病例

§与ICC比较，利用未配对Wilcoxon p<0.005，粗体

表2b.通过诊断分层的对每种HPV16蛋白质的阳性抗体应答发生率*

*截止值定义为健康对照血清中每种抗原的平均MFI比率+3倍标准偏差

仅为HR HPV病例

对E1、NE2、CE2、E6和E7中的至少一种阳性

实施例2

利用定制的珠阵列ELISA，在来自没有宫颈疾病(CIN 0，n＝33)、高等级宫颈非典型增生(CINIII/III，n＝52)、浸润性宫颈癌(ICC，n＝13)和口咽癌(OPC；n＝15)的患者的血清中测量针对HPV16蛋白质组的抗体。测定每种HPV-GST抗原与对照p21-GST抗原的特异性IgG的中位荧光强度(MFI)比率。所有宫颈病例和对照通过罗氏线性阵列进行HPV DNA分型。

与CIN0相比，CINII/III血清中针对HPV16E2、E6和E7的抗体的MFI比率增加(p<0.05)。在CINII/III的针对E1、E4和E5的抗体中没有可检测的差异。在CINII/III中有检测出L1和L2特异性抗体的趋势(p＝0.1)。比较起来，来自4/13个ICC患者的血清具有可检测的抗体E4、E6和/或E7。OPC血清的针对E1、E2、E6和E7抗原的抗体的MFI比率显著高于ICC患者(pS0.05)。

结论：在高等级宫颈非典型增生中检测到针对HPV16E2、E6和E7蛋白的血清Ig G抗体。所述应答在ICC中加宽；与ICC相反，OPC血清含有强E1和E2抗体，提示在这两种HPV相关恶性肿瘤之间抗体应答中反映出的生物学差异。

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