用于富集含稀有等位基因的物质的核酸分子的竞争性组合物的制作方法
本申请要求2014年4月18日提交的美国临时专利申请第61/981,588号的优先权，其通过引用全文纳入本文。
政府权利声明
本发明是在政府支持下由国立卫生研究院授予的基金号EB015331资助完成的。政府对本发明拥有某些权利。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。2015年4月15日创建的所述ASCII拷贝命名为14-21011-WO_260947_00237_SL.txt，大小为66,959字节。
背景技术：
核酸用作疾病的重要分子标记物，并且对特定DBA和RNA序列的精确检测形成许多研究和诊断产品的基础。然而，许多(如果不是大多数)现有技术平台仍在努力解决区分紧密相关的核酸序列，如相差单个核苷酸的那些。
单核苷酸差异的区分具有两个主要应用：单核苷酸多态性(SNP)基因分型；和稀有等位基因检测。在SNP基因分型中，靶标DNA样品是100％的一种等位基因，或在2种等位基因之间50％的分布，并且因此，SNP基因分型一般是用市售方案解决的问题。
在稀有等位基因检测中，靶标DNA样品可具有不到1％的特定稀有等位基因(在本文中称为“含稀有等位基因的物质”)。例如，含有癌症突变的无循环细胞核酸可以是癌症发生或复发的指示，并且对于检测这种物质存在强烈兴趣。专门的技术平台已经市场化，其能够检测低至0.1％至0.001％频率的稀有等位基因，但是这些一般需要无法市售可得的昂贵仪器。类似地，更广泛基础的仪器的生产商对于新分子技术感兴趣，该技术可增强它们的平台进行稀有等位基因和突变检测的能力。然而，迄今为止，目前还没有一种可与多种探针物质联用的精确且廉价的检测系统。
发明概述
本发明提供了用于探针系统的组合物和方法。在一个实施方式中，提供可用于检测样品中含稀有等位基因的核酸物质的核酸检测组合物，所述样品包含过量的含主要等位基因的核酸物质，其中含稀有等位基因的核酸物质和含主要等位基因的核酸物质的序列除了在共有的比对区中的一个或多个核苷酸以外是保守的。含主要等位基因的核酸中的共有比对区称为非靶核酸序列(变体)并且含稀有等位基因的核酸物质上的共有区被称为靶核酸序列(靶标)。在一种情况中，组合物包含2种探针复合物和2种分离的寡核苷酸。第一探针复合物对靶核酸序列有特异性并且在本文中被称为“靶核酸探针”或“探针”，而第二探针复合物对变体核酸序列有特异性并且在本文中被称为“变体核酸探针”或“库(Sink)”。探针包含第一靶标探针寡核苷酸和第二靶标探针寡核苷酸。第一靶标探针寡核苷酸包含与靶核酸序列互补的靶标探针互补区以及一个或多个不与靶核酸序列互补的非互补区。第二靶标探针寡核苷酸包含与靶标探针互补区的第一靶标探针互补子序列互补的靶标探针保护区和一个或多个非保护区。考虑到第一和第二靶标探针寡核苷酸具有互补序列，探针包含靶标双链探针部分和靶标单链探针部分，其中靶标双链探针部分包含第一靶标探针互补子序列和靶标探针保护区，并且靶标单链探针部分包含靶标探针互补区的第二靶标探针互补子序列。
变体核酸探针也包含第一和第二变体探针寡核苷酸。第一变体探针寡核苷酸包含与变体核酸序列互补的变体探针互补区以及一个或多个不与变体核酸序列互补的变体非互补区。第二变体探针寡核苷酸包含与变体探针互补区的第一变体探针互补子序列互补的变体探针保护区和一个或多个变体非保护区。与探针相似，变体库包含变体双链探针部分和变体单链探针部分，其中变体双链探针部分包含第一变体探针互补子序列和变体探针保护区，其中变体单链探针部分包含变体探针互补区的第二变体探针互补子序列。
靶标探针互补区和变体探针互补区共有由非保守序列分隔的至少2个保守序列。非保守序列可以是探针和库互补区之间的1个核苷酸差异，从而导致各探针分别对靶核酸序列和变体核酸序列的特异性。非保守序列可在一个共有位置上包含单个核苷酸，如在靶核酸序列中的单核苷酸多态性(SNP)的情况中。在靶核酸序列和变体核酸序列在多个共同的位置上相差单个核苷酸的情况中，靶标互补区和变体互补区可共有超过2个保守序列。还应理解靶标互补区和变体互补区不应完全针对靶核酸序列和变体核酸序列上的相同序列区或框架。例如，靶标互补区可针对靶核酸上的序列，其从变体核酸序列5′开始的几个核苷酸开始，该变体互补区是靶向性的。因此，在靶标互补区和变体互补区中可能存在其他非保守序列，其不位于保守序列之间，而位于靶标和变体互补区的3′或5′端。
在某些实施方式中，第一靶标探针寡核苷酸包含可检测标签或与之偶联的捕获部分，并且第二靶标探针寡核苷酸包含猝灭剂，其足够防止可检测标签的检测或捕获部分的捕获。
在某些其他实施方式中，组合物还可包含第三靶标探针寡核苷酸，其与第一靶标探针寡核苷酸的靶标探针非互补区杂交，其中第三靶标探针寡核苷酸包含可检测标签或与之偶联的捕获部分。另外，组合物还可包含第四靶标探针寡核苷酸，其与第二靶标探针寡核苷酸的靶标探针非保护区杂交，其中第四靶标探针寡核苷酸包含猝灭剂，其足够防止可检测标签的检测或捕获部分的捕获。
组合物还包含靶标辅助寡核苷酸和变体辅助寡核苷酸。这些寡核苷酸各自在长度和序列上分别与第二靶标探针寡核苷酸和第二变体探针寡核苷酸相同。因此，第二靶标和变体探针寡核苷酸相对于第一靶标和变体探针寡核苷酸过量存在于组合物中，从而产生与探针和库复合物分开的第二靶标和变体探针寡核苷酸的浓度，这种过量提供了靶标和变体辅助寡核苷酸。在其他实施方式中，靶标和变体辅助寡核苷酸可在长度和/或序列上与第二靶标和变体探针寡核苷酸稍有不同。
如下文中更详细所述，靶核酸探针和变体核酸探针可包含不同形态。在一种情况中，靶核酸探针可包含X-探针形态而变体核酸探针也可包含X-探针形态或超特异性的粘性末端形态，与上述实施方式中所述的相似。参考靶核酸探针描述了X-探针形态的说明，但是应理解相同的设计也可应用于变体探针。在X-探针形态中，靶标探针、变体探针、或两者还可包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中第三寡核苷酸包含第一靶标(或变体)探针寡核苷酸特异性子序列和第四寡核苷酸特异性子序列，其中第一靶标(或变体)探针寡核苷酸特异性子序列与第一靶标(或变体)探针寡核苷酸的靶标(或变体)探针非互补区互补，其中第四寡核苷酸包含第二靶标(或变体)探针寡核苷酸特异性子序列和第三寡核苷酸特异性子序列，其中第二靶标(或变体)探针寡核苷酸特异性子序列与第二靶标(或变体)探针寡核苷酸的靶标(或变体)探针非保护区互补，其中第二靶标(或变体)探针寡核苷酸的靶标(或变体)探针非保护区不与靶标(或变体)探针保护区重叠，其中第四寡核苷酸特异性子序列与第三寡核苷酸特异性子序列互补，并且其中靶标(或变体)辅助寡核苷酸还包含所述第四寡核苷酸。
在X-探针形态中，第三寡核苷酸的第四寡核苷酸特异性子序列可包含可检测标签或与之偶联的捕获部分，并且第四寡核苷酸的第三寡核苷酸特异性子序列包含猝灭剂，其足够防止可检测标签的检测或捕获部分的捕获。
在一个实施方式中，靶核酸探针具有靶标反应标准自由能(ΔG°rxn1)，其中变体核酸探针具有变体反应标准自由能(ΔG°rxn2)，并且其中ΔG°rxn1大于ΔG°rxn2+1kcal/mol之和。
在另一个实施方式中，靶核酸探针具有定义为ΔG°rxn1+Rτln([Pt]/[PtCt])的用浓度调整的靶标反应标准自由能，其中变体核酸探针具有定义为ΔG°rxn2+Rτln([Pv]/[PvCv])的变体反应标准自由能，其中R为理想气体常数，τ是开尔文温度，Pt是辅助寡核苷酸的初始浓度，PtCt是靶核酸探针的初始浓度，Pv是变体辅助寡核苷酸的初始浓度，PVCV是变体核酸探针的浓度，其中靶核酸探针的用浓度调整的反应标准自由能大于变体核酸探针的用浓度调整的反应标准自由能+1kcal/mol之和。
在另一个实施方式中，靶核酸探针具有靶标反应标准自由能(ΔG°rxn1)，其中变体核酸探针具有变体反应标准自由能(ΔG°rxn2)，并且其中ΔG°rxn1大于ΔG°rxn2，并且ΔG°rxn2大于-7kcal/mol。
在某些实施方式中，变体核酸探针的浓度相对于靶核酸探针的浓度为大于1∶1至约小于100000∶1。在其他实施方式中，变体核酸探针的浓度相对于靶核酸探针的浓度为大于10∶1至小于10000∶1。在其他实施方式中，变体核酸探针的浓度相对于靶核酸探针的浓度为大于100∶1至小于1000∶1。在另一个实施方式中，变体核酸探针的浓度相对于靶核酸探针的浓度为约900∶1。
在某些实施方式中，靶标辅助寡核苷酸的浓度相对于靶核酸探针的浓度为大于1∶1000至小于100000∶1。在其他实施方式中，靶标辅助寡核苷酸的浓度相对于靶核酸探针的浓度为大于1∶100至小于10000∶1。在其他实施方式中，靶标辅助寡核苷酸的浓度相对于靶核酸探针的浓度为大于1∶10至小于1000∶1。
在某些实施方式中，变体辅助寡核苷酸的浓度相对于变体核酸探针的浓度为大于1∶1000至小于100000∶1。在其他实施方式中，变体辅助寡核苷酸的浓度相对于变体核酸探针的浓度为大于1∶100至小于10000∶1。在其他实施方式中，变体辅助寡核苷酸的浓度相对于变体核酸探针的浓度为大于1∶10至小于1000∶1。
在上述或其他适用的实施方式中，靶核酸探针(探针)和变体核酸探针(库)包含单或双嵌段，其中嵌段是包含2个或更多通过沃森-克里克杂交反应形成的寡核苷酸的链或复合物。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，分离确定的变体核酸探针和变体核酸序列(变体)之间杂交的平衡产率大于分离确定的靶核酸探针和靶核酸序列(靶标)之间杂交的平衡产率。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，靶核酸探针是超特异性探针，微调的超特异性探针，X-探针，Yin-Yang探针，或包含双嵌段、靶标结合嵌段和辅助嵌段或保护子并在靶标杂交的同时释放辅助嵌段的任何其他核酸探针。在这种情况中，探针可包括过量的辅助嵌段物质，其与作为组合物部分的辅助嵌段物质(也称为“靶标辅助寡核苷酸”)分开或额外添加。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，靶核酸探针和靶标之间的反应标准自由能ΔG°rxn1在操作温度和缓冲条件下满足不等式ΔG°rxn1＞-6kcal/mol且ΔG°rxn1＜+6kcal/mol。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，靶标辅助寡核苷酸的初始浓度[A]和靶核酸探针的初始浓度[P]满足不等式[A]/[P]＞0.001且[A]/[P]＜1000。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，靶核酸探针和靶标之间的反应标准自由能(ΔG°rxn1)，靶标辅助寡核苷酸的初始浓度[A]，和靶核酸探针的初始浓度[探针]在操作温度和缓冲条件下满足不等式ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探针])＞-4kcal/mol且ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探针])＜+3kcal/mol，其中R是理想气体常数并且τ是开尔文温度。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，靶核酸探针是分子信标，发夹探针、三茎探针，或任何其他核酸探针分子，其包含单嵌段、靶标结合嵌段，并且不在靶标杂交的同时释放辅助核酸物质。在该实施方式中，靶核酸探针和靶标之间的反应标准自由能ΔG°rxn1以及靶核酸探针的浓度[探针]在操作温度和缓冲条件下满足不等式ΔG°rxn1-Rτln([探针])＞-4kcal/mol且ΔG°rxn1-Rτln([探针])＜+3kcal/mol，其中R是理想气体常数并且τ是开尔文温度。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，变体核酸探针(库)是超特异性探针，微调的超特异性探针，X-探针，Yin-Yang探针，或包含双嵌段、靶标结合嵌段和辅助嵌段并在变体杂交的同时释放辅助嵌段的任何其他核酸探针。在这种情况中，该组合物可包括过量的辅助嵌段物质，其与作为探针分子部分的辅助嵌段物质(也称为“变体辅助寡核苷酸”)分开或额外添加。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，变体核酸探针和变体之间的反应标准自由能ΔG°rxn2在操作温度和缓冲条件下满足不等式ΔG°rxn2＞-11kcal/mol且ΔG°rxn2＜+4kcal/mol。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，变体辅助寡核苷酸的初始浓度[B]和变体核酸探针的初始浓度[S]满足不等式[B]/[S]＞0.001且[B]/[S]＜1000。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，变体核酸探针和变体之间的反应标准自由能(ΔG°rxn2)，变体辅助寡核苷酸的初始浓度[B]，和变体核酸探针的初始浓度[库]在操作温度和缓冲条件下满足不等式ΔG°rxn2+Rτln([B]/[库])＞-7kcal/mol且ΔG°rxn2+Rτln([B]/[库])＜+1kcal/mol，其中R是理想气体常数并且τ是开尔文温度。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，变体核酸探针是分子信标，发夹探针、三茎探针，或任何其他核酸探针分子，其包含单嵌段、靶标结合嵌段，并且不在变体杂交的同时释放辅助(保护)核酸物质。在该实施方式中，变体核酸探针和变体之间的反应标准自由能ΔG°rxn2以及变体核酸探针的浓度[库]在操作温度和缓冲条件下满足不等式ΔG°rxn2-Rτln([库])＞-7kcal/mol且ΔG°rxn2-Rτln([库])＜+1kcal/mol，其中R是理想气体常数并且τ是开尔文温度。
在一个实施方式中，靶核酸探针以反应标准自由能(ΔG°rxn1)与靶标发生反应，变体核酸探针以反应标准自由能(ΔG°rxn2)与变体发生反应，靶标辅助寡核苷酸的初始浓度[A]，和变体辅助寡核苷酸的初始浓度[B]满足以下的一个或多个：(ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探针])-(ΔG°rxn2-Rτln([B]/[库])为+8kcal/mol至0kcal/mol；(ΔG°rxn1+Rτln([A]/[探针])-ΔG°rxn2+Rτln([库]))为-8kcal/mol至-1kcal/mol；(ΔG°rxn1-Rτln[探针])-(ΔG°rxn2-Rτln([B]/[库])为+8kcal/mol至0kcal/mol；或者(ΔG°rxn1-Rτln[探针])-(ΔG°rxn2+Rτln([库])为+8kcal/mol至0kcal/mol，各自在操作温度和缓冲条件下评价。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，用至少一个用于检测、定位或杂交强化的化学部分，如荧光团、半抗原、生物素、叠氮化物、琥珀酰亚胺、或小沟结合剂来官能化第一靶标探针寡核苷酸。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，通过与寡核苷酸的一种或多种杂交相互作用来接合第一靶标探针寡核苷酸，所述寡核苷酸用至少一个用于检测、定位或杂交强化的化学部分如荧光团、半抗原、生物素、叠氮化物、琥珀酰亚胺、或小沟结合剂官能化。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，用至少一个用于定位或杂交强化的化学部分如半抗原、生物素、叠氮化物、琥珀酰亚胺、小沟结合剂或插入荧光团来官能化第一变体探针寡核苷酸。
还提供可一种在反应中使用任意上述组合物来分离、鉴定、定量或检测核酸异质混合物中的靶标的方法。在一个实施方式中，该方法包括提供或获得核酸(样品)异质混合物，其包含含主要等位基因的物质(变体)和含稀有等位基因的物质(靶标)，使得比对的变体和靶标的子序列相差至少1个核苷酸(多态性核苷酸)。与本文所述的任意组合物实施方式一致的靶核酸探针与样品混合，其中靶核酸与靶标的杂交比与变体的杂交更有利，并且产生反应产物，其中靶标中的多态性核苷酸是与探针上的相应核苷酸配对的沃森-克里克碱基。该方法还包括将变体核酸探针与样品混合，其与变体的杂交比与靶标的杂交更有利，并且产生产物，其中变体中的多态性核苷酸是与变体核酸探针上的相应核苷酸配对的沃森-克里克碱基。在该方法中，混合的变体核酸探针的摩尔量或浓度相对靶核酸探针的浓度过量。另外，该方法还包括以本文所述的相对浓度混合靶标辅助寡核苷酸和变体辅助寡核苷酸，如本文所述的那些。靶核酸探针和变体核酸探针，以及任意辅助寡核苷酸可以单一组合物添加到样品中。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，变体样品浓度除以靶标的样品浓度的比率为X，其中X是至少20。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，在与竞争性组合物(探针和库)反应之后，与探针结合的变体的量除以与探针结合的靶标的量不超过(X/10)、(X/30)、(X/100)、(X/300)、或(X/1000)。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，竞争性组合物(探针和库)与样品之间的反应在充分混合的溶液中等温且均匀地发生。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，竞争性组合物和样品之间的反应在充分混合的溶液中发生，其具有随时间变化的温度概况。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，随时间变化的温度概况至不低于70℃的温度的加热步骤，之后是不超过65℃的温度的冷却步骤。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，竞争性组合物和样品之间的反应在充分混合的溶液中发生，其具有随时间变化的反应缓冲概况，如通过洗涤步骤。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，竞争性组合物和样品之间的反应在表面上发生，如用于成像的载片或纳米颗粒。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，与探针分子杂交的变体和靶分子诱导局部可检测的荧光、化学发光、或适于成像的金属沉淀。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，与探针分子杂交的变体和靶分子诱导酶促反应、条件性荧光、或表面定位，以能够检测或定量靶标。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，与探针分子杂交的变体和靶分子诱导表面定位或其他分离，以能够从初始样品中的变体和其他物质中纯化或富集靶标。
在任意上述适用实施方式中的一个或多个中，出于分子诊断或疾病病原体或生物标记速的表征，例如针对感染性疾病，或针对遗传疾病的目的，使用靶标成像、检测、定量、富集或纯化。
附图的简要说明
图1：竞争性组合物发明概述。本发明的核酸探针组合物(也称为竞争性组合物)2是包含对靶物质T有特异性的靶核酸探针(探针)和对变体物质V有特异性的变体核酸探针(库)。再次，探针结合靶标比结合变体更有利，并且库结合变体比结合靶标更有利。使用本发明的核酸组合物来分离、鉴定或检测核酸样品1的异质混合物中的靶标。样品中变体与靶标的初始浓度比率为X。在反应3完成之后，与探针结合的靶标的量(T′探针)和与探针结合的变体的量(V′探针)之比Y将相对于样品中靶标与探针的初始比率富集。
图2：竞争性组合物组分的可能形态。竞争性组合物包含靶核酸探针(在下文中一般称为“探针”)和变体核酸探针(在本文中一般称为“库”)。各自可采用先前文献报道的或待报道的多种不同核酸分子形态之一。该图显示探针可采用的形态的部分列表。库可采用的形态是相似的。重要的是，探针和库的形态可以不同。探针和库都可包含单嵌段或双嵌段，其中嵌段是包含2个或更多个通过沃森-克里克杂交反应形成的寡核苷酸的链或复合物。左图显示了靶标与包含靶标结合嵌段(TB-嵌段)的单嵌段探针4之间的反应。右图显示了靶标与包含靶标结合嵌段(TB-嵌段)和辅助嵌段(A-嵌段)的双嵌段探针10之间的反应。放大图显示了单嵌段(5-9)和双嵌段探针(11-15)的示例性结构。链之间的黑点表示各嵌段内的碱基对，而垂直黑线表示嵌段之间以及靶标结合嵌段与结合靶标(T′探针)之间的碱基对。探针的加粗黑色部分表示核苷酸，取决于在靶标和变体物质之间不同的多态性核苷酸。在各链的一端处的半箭头表示3′端。
图3：样品与示例性竞争性组合物16之间的初级反应。在此，各寡核苷酸被分成由数字表示的区。各区包含连续核苷酸碱基，并且作用是杂交和解离中的功能性单元。4个初级反应是(1)靶标T结合至探针，(2)变体V结合至库，(3)变体V结合至探针，和(4)靶标T结合至库。这些反应各自具有表征其有利性的相应反应标准自由能ΔG°rxn。前两个反应是将靶标与探针以及变体与库适当配对的需要反应，而后两个反应是不需要的。
图4A：显示了在第一反应标准自由能值下探针与库的反应平衡性质。显示了对探针(假设过量探针)的平衡结合产率对于反应ΔG°rxn的分析依赖性，以及ΔG°rxn1＝-0.5kcal/mol和ΔG°rxn3＝+2.5kcal/mol的产率，对应于3.0kcal/mol的ΔΔG°1。对于这些值，在靶标与探针以及变体与探针之间的结合产率上存在几乎50倍的差异。
图4B：显示了在与图4A不同的第二反应标准自由能值下探针与库的反应平衡性质。对库的平衡结合产率对于反应ΔG°rxn的分析依赖性遵循S型曲线。因为库的目的是为了消耗变体浓度而对靶标浓度没有过多影响，对于探针需要不同组的ΔG°rxn。在此，ΔG°rxn2＝-3kcal/mol且ΔG°rxn4＝+1kcal/mol导致变体98％消耗(剩余2％)和靶标29％消耗(剩余71％)。这组值将改善富集因数超过30倍(71％/2％)。
图5：使用X-探针作为探针和粘性探针作为库的竞争性组合物16的实施方式，其中探针显示出在与靶标T或变体V杂交之后的条件荧光。实现了条件荧光，因为荧光团(显示为星)初始紧密靠近猝灭剂(显示为大点)；在反应时候，猝灭剂远离并且荧光增加。有三种原因产生观察的荧光：由于与探针结合的靶标的荧光(fA)，由于与探针结合的变体的荧光(fC)，和由于不完全猝灭的未结合探针的荧光(fB)。
图6：用于荧光检测EGFR野生型序列(V)(SEQ ID NO：44)的背景中稀有EGFR L858R(c.2573T＞G)突变(T)(SEQ ID NO：43)的示例性竞争性组合物41(以出现的顺序分别是SEQ ID NO：2、45、1、46、47和48)。多态性核苷酸加粗显示。显示了单独变体(1500nM)和含小量靶标(0.5nM)的变体(1500nM)的差异荧光响应。后面的情况对应于变体对靶标X＝3000-倍过量，并且比较fA和fC值表明结合探针的靶标与结合探针的变体相比有2781倍的结合亲和性差异(由β计量)。实验在37℃下在5x PBS缓冲液中使用给定序列的合成寡核苷酸进行。
图7：用于荧光检测TP53野生型序列(V)(SEQ ID NO：248)的背景中稀有TP53 R248Q(c.743G＞A)突变(T)(SEQ ID NO：247)的示例性竞争性组合物42(以出现的顺序分别是SEQ ID NO：2、249、1、250、251和252)。实验在37℃下在5x PBS缓冲液中使用给定序列的合成寡核苷酸进行。
图8：用于荧光检测NRAS野生型序列(V)(SEQ ID NO：146)的背景中稀有NRAS G12D(c.35G＞A)突变(T)(SEQ ID NO：145)的示例性竞争性组合物43(以出现的顺序分别是SEQ ID NO：2、147、1、148、143和144)。实验在37℃下在5x PBS缓冲液中使用给定序列的合成寡核苷酸进行。
图9A提供了用于竞争性组合物以测试44种不同的癌症相关单核苷酸多态性的探针和库的形态。使用的探针序列和靶标/变体序列示于表1-3。
图9B提供了使用图9A的竞争性组合物的44种不同癌症相关靶标/变体对的实验结果的结合亲和性倍数变化β的总结。在此，样品变体/靶标比率为1000∶1。结合亲和性倍数变化在200和2420之间变化，中值大约为1000。
图9C提供了与含有探针和库的竞争性组合物相比，仅使用没有库的竞争性组合物的探针组分对来自相同的44种靶标/变体对的实验结果的倍数变化β的比较。在此，样品变体/靶标比率为X＝100，比竞争性组合物低10倍。中值倍数变化β为大约30，这与之前报道的最好设计相一致。因此，竞争性组合物具有大约30-1000的额外因数的改善富集，使得稀有等位基因检测降低至0.1％加载。这首次报道了在该灵敏度下对稀有等位基因的可靠无酶和均匀检测。
图9D提供了在1小时反应时间时的最优ΔG°rxn组合的示例性分布。该图显示了由常微分方程给出的图9A-9C中所述的44种突变的最优ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值，在37℃下ΔΔG°值的范围是+1.8kcal/mol至+5.9kcal/mol。具有这些值的ΔG°rxn的探针和库在1小时处显示出最大特异性。如所示的那样，最优ΔG°rxn对于不同的ΔΔG°值有显著偏移。对于我们已经测试的44种SNV/WT对，最优ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值可分别在从-1.6到-0.6kcal/mol和从-6.4到-2.8kcal/mol中变化。
图10A提供了对人基因组DNA样品的PCR扩增子的竞争性组合物试验的实验工作流程图。2种从Coriell细胞库提取的在SMAD7基因座处含有单核苷酸多态性的DNA样品(NA18537和NA18546)以100∶0、99∶1、90∶10、10∶90、1∶99、和0∶100混合至2ng/μL的总浓度(50μL)，并且通过不对称非等位基因特异性PCR 49扩增以生成单链扩增子50。针对各等位基因设计的竞争性组合物51与检测52指定PCR产物混合。
图10B提供了对用于图10A所示实验的各SNP的比较性组合物的荧光响应。在各实验中，0.5nM探针和10nM库与40μL PCR产物反应。在PCR之前，基因组DNA混合物中的SMAD7-C(显示为黑色)和SMAD7-T(显示为灰色)的等位基因频率显示在括号中。
图11：由作为探针的条件性荧光X-探针和作为库的粘性探针组成的示例性竞争性组合物中存在的附带物质列表。溶液中的其他物质是由于探针46和库47的配制，故意导致某些物质过量。本文所示的所有物质被考虑并模拟建模。
图12A提供了对竞争性组合物与低比例(0.01％)靶标反应的模拟。这些模拟是基于实施例条件荧光系统内容中所述的常微分方程式模型进行的。显示了取决于ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的变化值，在1小时反应、4小时反应、和48小时反应之后由该低量的靶标引起的结合亲和性倍数变化β。更长的反应时间使产生高β的ΔG°rxn值的范围更宽。
图12B提供了图12A中所示的基于1小时反应后的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的β值的三维展示。
图12C显示了基于图12A的模拟，在不同反应时间段后可实现的最大β值。
图13：含不同探针和库组分形态的竞争性组合物53，其中生物素官能化的(Bio)发夹探针用于所述探针并且Yin-Yang探针用于库。用基于热动力学适当设计的探针，将通过链霉亲和素包被的表面54捕获的靶标T与变体V的分数将在原始样品上高度富集。由于发夹探针的单链性质，在对最优ΔG°rxn1的评价中存在额外的Rτln([探针])项。链之间的黑点表示各嵌段内的碱基对，而垂直黑线表示嵌段之间以及靶标结合嵌段与结合靶标或变体之间的碱基对。
图14：具有未官能化的探针和库组件的竞争性组合物55。相反，通过与探针的其他区(区56)互补的通用序列的官能化核酸分子57实现富集能力。探针与官能化寡核苷酸之间的间接连接不需要通过仅一个杂交相互作用：例如，探针可与未官能化的链部分杂交，其本身与第二官能化的链部分杂交。与官能化的基团共定位的产物将同时或依次被捕获58、成像59、或通过任何其他方法测试，而其余的分子通常将被洗去60。
图15：用于等位基因特异性酶促扩增富集的竞争性组合物。靶标和变体物质是基于EGFR L858R(c.2573T＞G)突变61和相应野生型序列62的反义链。显示的ΔG°rxn的值在60℃下在0.18M Na+中计算，与一般PCR退火步骤的环境相一致。探针63是没有在3′端被非延伸性基团封闭并且能够用作引物的唯一物质。因此，在结合探针中靶标对变体的富集用于增加由PCR扩增的靶标的比例。图15以出现的顺序分别公开了SEQ ID NO：277-282。
技术实现要素：
在本发明中，提供了新试剂混合物组合物(本文中称为“竞争性组合物”)。竞争性组合物与含有以下至少2种密切相关的核酸物质的异质样品混合物反应：含主要等位基因的物质(变体)和含稀有等位基因的物质(靶标)，前者一般对于后者过量(图1)。变体和靶标分子含有高度相似的子序列，长度为例如5-200个核苷酸，其相差至少1个核苷酸，称为多态性核苷酸。
竞争性组合物包含靶核酸探针(探针)和变体核酸探针(库)，后者浓度相对前者过量，库与变体的反应比与靶标的反应更有利(由于库对主要等位基因核苷酸的互补性)并且探针与靶标的反应比与变体的反应更有利(由于探针对稀有等位基因核苷酸的互补性)。
数学上，初始样品中变体对靶标的浓度比率([变体]/[靶标])在此表示为X，并且在反应后结合至探针的变体对靶标的浓度比率表示为Y。通过使用基于本文所述的指南设计的竞争性组合物，Y将远小于X；我们在44种不同癌症相关突变上的实验数据显示约1000的平均富集比率(X/Y)。
本发明的竞争性组合物的富集比率显著高于仅使用单一探针的现有技术。除了显示与现有技术相比有利的实验结果以外，本发明还包括验证的理论分析和模拟，其解释了为何本文所述的竞争性组合物在策略上提供优势。
竞争性组合物的组分
竞争性组合物的组分包含靶核酸探针(探针)、变体核酸探针(库)、和靶标辅助寡核苷酸以及靶标辅助寡核苷酸。探针和库都可包含单嵌段或双嵌段，其中嵌段是包含2个或更多个通过沃森-克里克杂交反应形成的寡核苷酸的链或复合物。单嵌段探针或库包含靶标结合嵌段，而除了靶标结合嵌段以外，双嵌段探针或库还包含辅助嵌段。在靶标或变体杂交的同时，辅助嵌段从靶标结合模块释放。这些组分各自是核酸分子并且可采用任意数量的不同形态(图2)。探针和库的示例性单嵌段实施方式包括(但不限于)分子信标、发夹探针和三茎探针。探针和库的示例性双嵌段实施方式包括(但不限于)Yin-Yang探针、粘性探针和X-探针。
这些设计各自一般在与其目标靶标的反应有利性上具有一定程度的可调节性(即，靶标针对探针，变体针对库)。例如，可通过针对Yin-Yang探针、粘性探针X-探针和发夹探针的单链粘性区的长度；粘性探针和X-探针的非同源区的长度调节杂交的标准自由能(ΔG°rxn)。对于单链组分(例如，分子信标、发夹探针、三茎探针)，可通过组分浓度来调节反应有利性。
出于显示本发明的一个实施方式的目的，将表述包含针对探针的X-探针和针对库的粘性探针的具体示例性竞争性组合物。应理解，该具体实施方式是为了提供竞争性组合物的示例，并且不意味着将竞争性组合物限制到该实施方式。
如图3所示，例如，在一个实施方式中，目标核酸探针(探针)是X-探针并且非靶核酸探针(库)是粘性探针。在此，X-探针(探针)包含以下的4个寡核苷酸或链：包含子序列19、18、21和27的第一靶标寡核苷酸；包含子序列17、20和25的第二靶标寡核苷酸；包含子序列23和26的第三寡核苷酸；以及包含子序列22和24的第四寡核苷酸。第三靶标寡核苷酸还可表征为包含靶序列区，其针对子序列18和19(并且在一些情况中针对20)。还应注意到，并非各寡核苷酸的所有子序列都是合适功能所需的。例如，可去除子序列20-23，或者仅去除子序列20和21，或者另外，可去除子序列22和23。由图3中的数字表示的各子序列表示功能上作为杂交或解离单元的寡核苷酸的部分。如果各子序列的核苷酸可同时互相形成几个沃森-克里克碱基对，则一个子序列被称为与另一个子序列互补。在该具体实施例中，设计第一和第二靶标寡核苷酸，使得子序列17部分或完全与子序列18互补，从而形成探针的第一双链区；任选子序列20部分或完全与区21互补，从而形成探针的第二双链区(或简单延伸第一双链区)；子序列26部分或完全与区27互补，从而形成探针的第三双链区；任选子序列22部分或完全与区23互补，从而形成探针的第四双链区；并且子序列24部分或完全与区25互补，从而形成探针的第五双链区。另外，第一靶标核苷酸包括包含子序列19的单链区，该子序列与靶核酸序列互补(如子序列18)。虽然图3中未显示，子序列22和23(或在不用子序列22和23设计的探针的情况中任选的子序列26和24)提供了用于可检测标签及其猝灭剂偶联的位点。
当如图3所示，X-探针在合适温度和缓冲条件下被导入含有靶标T的样品中时，第一靶标寡核苷酸的子序列18和19分别与靶标T的子序列33和34杂交。在这种杂交之后，含有第三寡核苷酸的子序列26将仍然与第一靶标寡核苷酸的子序列27杂交(“靶标复合物”)，而第二靶标寡核苷酸和第四寡核苷酸(“保护复合物”)将从靶标复合物上解离。在荧光团F偶联至子序列23处的第二寡核苷酸末端并且猝灭剂Q偶联至子序列22处的第四寡核苷酸的情况中，在结合至靶标之后从靶标复合物解离保护复合物将去除猝灭剂Q并且使荧光团F在第三寡核苷酸仍然与第一靶标寡核苷酸的子序列27杂交时发出荧光。
继续图3，在一个实施方式中，库包含粘性或超特异性探针。库包括包含子序列32、29和30的第一非靶标寡核苷酸和包含子序列28和31的第二非靶标寡核苷酸。如图3所理解，库形成从子序列28和29的杂交产生的第一双链区和从子序列31和32的杂交产生的第二双链区。这留下了具有子序列30的单链区的第一非靶标寡核苷酸。在接触包含靶标T和非靶标核酸变体V的样品之后，子序列29和30将分别杂交至变体V的子序列36和37，从而导致从探针复合物释放第二非靶标寡核苷酸。如上所述，库可分别在子序列32和31的末端处包含在第一非靶标寡核苷酸上的标签和在第二非靶标核苷酸上的猝灭剂。在这种情况中，标签将在第一非靶标寡核苷酸结合至变体V而含有猝灭剂的第二非靶标寡核苷酸被替换之后变得可检测到。
虽然图3中未显示，组合物可包含靶标辅助寡核苷酸和非靶标辅助寡核苷酸。在某些实施方式中，靶标辅助寡核苷酸包含与探针复合物分离且游离的与第四寡核苷酸杂交的第二靶标寡核苷酸。因此，靶标辅助寡核苷酸或复合物在第一靶标寡核苷酸和第三寡核苷酸中过量，从而产生与第三寡核苷酸复合的游离第一靶标寡核苷酸的初始浓度。类似地，在这种实施方式中，非靶标辅助寡核苷酸包含与库探针复合物分离且游离的第二非靶标寡核苷酸。换句话说，第二非靶标寡核苷酸将相对第一非靶标寡核苷酸过量。
在另一个实施方式中，竞争性组合物的靶核酸探针将包含粘性探针代替X-探针，并且非靶标核酸探针或库探针将包含粘性探针或X-探针。在另一个实施方式中，靶核酸探针可包含粘性探针或X探针并且非靶核酸探针或库探针可包含单一寡核苷酸。在另一个实施方式中，靶核酸探针可包含单一寡核苷酸并且库探针可包含粘性探针或X-探针。
如下文更详细说明，基于其序列，靶核酸探针(探针)具有定义为ΔG°rxn1的与靶核酸序列T的靶标反应标准自由能，而探针与变体或非靶核酸链V的反应将具有反应标准自由能ΔG°rxn3，其由于错配碱基而弱于ΔG°rxn1(正得更多或负得更少)。此外，库将以相反的方式作用，其中其与靶标的反应标准自由能(ΔG°rxn4)由于靶标T中的错配碱基而弱于其与变体的反应标准自由能(ΔG°rxn2)。此外，在某些实施方式中，ΔG°rxn1将弱于ΔG°rxn2(正得更多或负得更少)。更具体地，在某些实施方式中，ΔG°rxn1和ΔG°rxn2之间的关系可定义为，例如，ΔG°rxn1大于ΔG°rxn2+1kcal/mol之和，或者ΔG°rxn1大于ΔG°rxn2，其中ΔG°rxn2大于-7kcal/mol。本文所用的与探针对靶标T或库对变体V的标准反应自由能结合的术语“大于”表示正得更多或负得更少(例如，-4kcal/mol“大于”-7kcal/mol)。因此，在许多情况中，本发明的组合物包含靶核酸探针，所述靶核酸探针与靶核酸T的相互作用比非靶核酸探针(库)与非靶核酸变体V的相互作用更不利。在将使用本文所述的竞争性组合物的大多数样品中，非靶核酸物质或变体V存在于主要等位基因上并且因此将相对稀有等位基因上存在的靶核酸物质T而过量。
在任意上述实施方式中，探针的任一链还可包含合成核酸类似物，如LNA、PNA、2′O-甲基取代的RNA、L-DNA、和镜像寡核苷酸(speigelmer)。另外，探针的任一链还可包含合成或天然类似物，如次黄嘌呤、甲基化的核苷酸、异-胞嘧啶和异-鸟嘌呤、镜像寡核苷酸、和xDNA。
术语“多核苷酸”、“核酸”、“寡核苷酸”、“核酸物质”和“核酸分子”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以具有任意的三维结构，且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区域、由连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。多核苷酸可进一步被修饰，如通过与标记组分结合。
提供了用于制备X-探针的方法。在一个实施方式中，第三寡核苷酸(A)、第四寡核苷酸(B)、第二靶标(或非靶标)寡核苷酸(P)、和第一靶标(或非靶标)寡核苷酸(C)在水性溶液中混合在一起。在一个实施方式中，第一靶标(或非靶标)寡核苷酸C的浓度相对第三寡核苷酸A过量，第二靶标(或非靶标)寡核苷酸(P)的浓度相对第一靶标(或非靶标)寡核苷酸(C)过量，并且第四寡核苷酸(B)的浓度相对保护链过量，使得形成包含复合物BPCA、复合物BPC、复合物BP、和链B的探针混合物。在另一个实施方式中，P的浓度相对B过量，C的浓度相对P过量，并且A的浓度相对C过量，使得形成的探针混合物包含复合物BPCA、复合物PCA、复合物CA、和链A。
在任意上述实施方式中，探针组分在混合后热退火。在一个实施方式中，热退火包括将混合物加热至不低于65℃的温度，并且冷却至不高于45℃的温度。在另一个实施方式中，热退火包括将混合物加热至不低于80℃的温度，并且冷却至不高于60℃的温度。在另一个实施方式中，热退火包括将混合物加热至不低于95℃的温度，并且冷却至不高于75℃的温度。
在另一个实施方式中，探针组分通过添加盐或高盐溶液而等温退火。在另一个实施方式中，探针组分通过去除或稀释甲酰胺或其他变性剂而等温退火。
本发明的探针可用于多种试验，包括但不限于以下：通过荧光的特异性DNA或RNA检测或定量；通过荧光的特异性DNA或RNA成像；通过显色方法(例如，半抗原化探针，和后续基于抗体补充辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP))的特异性DNA或RNA检测、定量或成像。
竞争性组合物反应
图3显示了分解为多个区域或子序列的靶标T、变体V、探针和库，由数字表示。各区是多个用作杂交和解离单元的连续核苷酸碱基。区可部分或完全沃森-克里克互补至其他区(例如，区17到区18)，并且不同的区可具有互相相同的序列(例如，区34和37)。
本文中假定变体和靶标物质互相仅相差单个多态性核苷酸，如粗黑线段或黑色圆圈所示。在该实施例中，多态性核苷酸在33和36区中。在此，假定区18和29在序列上仅在与多态性核苷酸互补的核苷酸处不同，并且区19和30在序列上相同。实际上，并不需要这样：例如，多态性核苷酸的互补物可在探针的区2和库的区30中，即，探针结合靶标/变体的位置不需要与库结合变体/靶标的位置相同。图3中变体和靶标上的区35和38是任选的并且可能对于短变体和靶标而言不存在。然而，如果它们存在，则区35和38具体地对于探针的区21和23以及库的区32而言不是互补的。在2对物质之间出现4个不同初级反应：(1)靶标与探针，(2)变体与库，(3)变体与探针，和(4)靶标与库。从富集结合至探针的靶标的分数来看，需要前两个反应：反应(1)是靶标与探针的适当结合，并且反应(2)降低了可结合至探针的变体的量。相反，不需要另2个反应：反应(3)是变体与探针的不适当结合，并且反应(4)降低了可与探针结合的靶标的量。4个反应的标准自由能分别定义为ΔG°rxn1、ΔG°rxn2、ΔG°rxn3、ΔG°rxn4。
假设，需要ΔG°rxn1和ΔG°rxn2尽可能负(有利)，同时ΔG°rxn3和ΔG°rxn4应尽可能正(不利)。然而，这些值需要耦合：
ΔΔG°1＝ΔG°rxn3-ΔG°rxn1
ΔΔG°2＝ΔG°rxn4-ΔG°rxn2
ΔΔG°1和ΔΔG°2的值进而受到单碱基错配的相对热动力学的影响(一般，ΔΔG°1≠ΔΔG°2)。基于实验数据和分析，已经确定ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的最优值一定程度上取决于ΔΔG°值。
将不同ΔG°rxn项与其对竞争性组合物性能的影响之间的耦合概念化的一种方式是考虑探针和库与靶标和变体的各单独反应的平衡。在这种简化的标准中，可基于ΔG°rxn的值分析计算各反应产率(定义为在平衡时与探针或库杂交的靶标或变体的比例)(图4A和4B)。当变体相对靶标存在大幅过量时，从富集的角度来看需要探针具有较高的特异性而库具有较高的灵敏度。
设计原理
ΔΔG°1和ΔΔG°2的值分别受到在变体-探针复合物(V′探针)和靶标-库复合物(T′库)之间生成的单碱基错配泡的影响。这两项的较大值提供了更大的潜在富集，但是这种潜力只能通过适当设计具有优化的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值的探针和库来开发。
返回图3以及图4A和4B，需要考虑特异性和灵敏度之间的重要权衡。例如，仅富集因数(X/Y)最大化，代替特异性，源自分别为+∞和-∞的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的值；不幸的是，这种竞争性组合物设计将不会产生与探针结合的靶标或变体。这种结果明显是稀有等位基因检测、定量、成像和纯化方面的应用所不希望的，因为这种竞争性组合物对靶标的灵敏度为零。
为了探索实际设置中的这些权衡，条件性荧光X-探针被认为是用于靶标检测的模型应用。结合亲和性倍数变化β＝(fA·X)/(fB+fC)代表了由于小量靶标引起的可检测荧光差异。考虑到竞争性组合物中的大量物质和反应参数，分析解决方案和优化不可能产生有助于直观理解的简单解决方案。因此，进行对竞争性组合物的常微分方程(ODE)模拟以检验由于各种因数的结合亲和性倍数变化特征。这种模拟遵循化学反应的速率方程并且在数字上将反应过程集成在一起。
为了精确性，也考虑探针和库组分中的建模的偶见(incidental)物质(图11)。其他研究表明，这些对系统的总体性能的影响非常小。建模的化学反应是：
其中R表示靶标，D表示变体，k+和k-分别表示正向和反向速率常数。图11中显示了其他物质的名称和结构。所有正向反应速率常数k+的值假定为3x105M-1s-1；这是基于之前的研究和我们自己的校准实验估计的(数据未显示)。反向反应速率常数k-的值基于反应的ΔG°和k+计算：
对于k1-，使用ΔG°rxn1；对于k2-，使用ΔG°rxn2；对于k3-，使用ΔG°rxn3≡ΔG°rxn1+ΔΔG°1；对于k4-，使用ΔG°rxn4≡ΔG°rxn2+ΔΔG°2；对于k5-，使用ΔG°rxn5≡ΔG°rxn1+ΔG°NH；对于k6-，使用ΔG°rxn6≡ΔG°rxn1+ΔΔG°1+ΔG°NH。ΔG°NH项表示探针的不完整QPC缺失的非同源区，并且具有-8.46kcal/mol的值。对于本文的所有模拟，ΔΔG°1＝+3kcal/mol且ΔΔG°2＝+4kcal/mol。上述反应的ODE模拟有以下速率方程组成：
图12显示了竞争性组合物系统的汇总模拟结果。对于这些模拟，物质的初始浓度为[靶标]＝0.15nM，[变体]＝1500nM，[FQPC]＝2.5nM，[QPC]＝1.25nM，[QP]＝3.75nM，[PSCS]＝2250nM，并且[Ps]＝450nM。fB的背景荧光等于来自0.04nM的未猝灭荧光团标记的链的荧光，并且与实验中观察到的值相一致(图6-9)。
有产生高结合亲和性倍数变化的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的最优值范围(图12AB)。当允许较长反应时间时，所需ΔG°rxn1和ΔG°rxn2值的范围将稍变宽：例如，在1小时反应后，当ΔG°rxn1为0至-1.5kcal/mol并且ΔG°rxn2为-2.5至-4.5kcal/mol时信号增加是高的。在48小时后，对于ΔG°rxn1，范围变宽至0至-4.5kcal/mol并且对于ΔG°rxn2，范围变宽至-2.5至-7kcal/mol。
此外，图12C显示可实现的最大信号增加随反应时间而增加，虽然改善在约4小时后出现边际效应。在许多应用中，需要快速试验和反应；因此，在短和长反应时间之间存在权衡。预期一般将是30分钟至4小时。
在上述模拟中，假定ΔΔG°1和ΔΔG°2是+3和+4kcal/mol。通过我们的模拟和研究过程，已经确定最优ΔG°rxn1和ΔG°rxn2范围对参数如探针浓度[FQPC]、库浓度[PsCs]、反应时间、和背景荧光信号水平fB相对不灵敏。然而，它们对化学计量比([QP]/[FQPC])、([Ps]/[PsCs])、和ΔΔG°是灵敏的，这与双链探针的现有技术相一致。
因此，以下范围的ΔG°rxn值对于该竞争性组合物的实施方式(X-探针作为探针，超特异性探针作为库)而言是合理的：
-4kcal/mol≤ΔG°rxn1+Rτln([QP]/[FQPC]])≤+3kcal/mol (1)
-7kcal/mol≤ΔG°rxn2+Rτln([PS]/[PSCS])≤+1kcal/mol
其中R是理想气体常数并且τ是开尔文温度，并且显示的浓度是添加样品之前的初始浓度。可以看出一般在库对变体的结合比探针对靶标的结合更有利时(ΔG°rxn1＜ΔG°rxn2)观察到高性能。采用导致辅助物质释放的其他探针和库形态的竞争性组合物遵循ΔG°rxn值的相同范围指南。相反，使用不释放辅助物质(例如，分子信标、发夹探针和三茎探针)的探针形态满足下式：
-4kcal/mol≤ΔG°rxn1-Rτln([探针])≤+3kcal/mol (2)
类似地，使用不释放辅助物质的库形态满足下式：
-7kcal/mol≤ΔG°rxn2-Rτln([库])≤+1kcal/mol (3)
可基于其序列使用软件如NUPACK或mFold计算给定探针和库设计的ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的值；这种计算在描述组分探针本身的文献中有更详细说明并且被认为是热力学指导的核酸探针设计领域中普通技术人员可及的。并不推荐同时使用具有不同形态的靶向相同靶标物质的多种探针；不推荐使用具有不同形态的靶向相同变体物质的多种库。
例如，图3的靶核酸T和靶核酸探针(探针)之间相互作用的标准反应自由能可表示成：
ΔG°rxn1＝ΔG°34-19-ΔG°22-23-ΔG°20-21-ΔG°ML+(ΔG°33-18-ΔG°17-18)-ΔG°标签
其中ΔG°34-19是子序列34和子序列19之间杂交的标准自由能，ΔG°22-23是子序列22和子序列23之间杂交的标准自由能，ΔG°20-21是子序列20和子序列21之间杂交的标准自由能，ΔG°ML是在4个寡核苷酸的相交处提供的多环中的杂交标准自由能，ΔG°33-18是子序列33和子序列18之间杂交的标准自由能，ΔG°17-18是子序列17和子序列18之间杂交的标准自由能，并且ΔG°标签是第三寡核苷酸上的标签在紧密靠近第四寡核苷酸上的标签时的热动力学贡献(未显示)对比它们远离时的热动力学贡献之间的标准自由能差。
另外，图3的非靶核酸V和非靶核酸探针(库)之间相互作用的标准反应自由能可表示成：
ΔG°rxn2＝ΔG°t-TC-ΔG°nh-PC+(ΔG°v-TC-ΔG°h-PC)
其中ΔG°τ-TC是子序列37和子序列30之间杂交的标准自由能，ΔG°nh-PC是子序列31和子序列32之间杂交的标准自由能，ΔG°v-TC是子序列36和子序列29之间杂交的标准自由能，ΔG°h-PC是子序列28和子序列29之间杂交的标准自由能。
最后，虽然信号增加是用于检测靶标的条件荧光竞争性组合物的特异性量度，采用竞争性组合物的富集能力的其他应用(如基于原位杂交的成像和基于酶的扩增)可能也面临特异性和灵敏度之间的权衡，使得对ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的指南可能是一般而言合适的。
竞争性组合物的其他应用
竞争性组合我的另一个示例实施方式包括探针物质与官能化寡聚体(称为通用官能化链)通过对其他结构域的一个或多个杂交相互作用的间接连接(图14)。与探针反应的靶标和变体分子共定位与通用官能化链，其促进了靶标通过表面或纳米颗粒捕获的富集，或者能够通过直接或下游荧光，金属沉淀或化学发光进行检测/成像。在一些实施方式中，不与探针结合的靶标和变体分子是暗的或在下游反应之前被洗去。
竞争性组合我的另一个示例实施方式包括使用探针作为酶促扩增的引物(图15)。靶标可以是含有稀有突变或等位基因的生物序列，并且变体可代表野生型序列。在该实施例中，用防止酶促延伸的化学部分官能化库的3′端，如双脱氧核苷酸，3-碳间隔子基团，或小沟结合剂。
设计过程
许多潜在设计过程可用于生成在竞争性组合物中采用的序列。下面提供了一个实施例。
1)从靶核酸选择靶标和变体作为子序列。靶标和变体必需含有感兴趣的多态性核苷酸，否则是相同的。考虑，如靶标和变体二级结构，可用于提供关于靶标和变体序列选择的信息。
(2)确定操作条件，包括温度、缓冲液盐度、拥挤/变性剂、反应时间和读取机制。
(3)选择探针和库的形态。考虑，如组分的成分和复杂性，可用于指导/提供形态选择信息。
(4)基于靶标和变体序列在所需操作条件下计算或估计ΔG°rxn1和ΔG°rxn2。某些操作条件的DNA-DNA和RNA-RNA错配泡的热动力学值是文献中存在的；对以其他核酸或条件，仅可粗略估计ΔΔG°值。
(5)通过常微分方程模拟来确定ΔG°rxn1和ΔG°rxn2的最优值，如本文中所述的那样。将基于ΔΔG°值、预定背景信号、靶标和变体浓度、以及探针和库浓度来计算许多不同ΔG°rxn值的结合亲和性倍数变化(或其他相关量度)。
(6)基于选择的形态和选择的ΔG°rxn1值，根据需要用对序列的迭代精细调节来设计靶标-特异性探针。其他考虑，如寡核苷酸长度、采用的官能化等可用于进一步指导并且提供探针序列选择的信息。
(7)基于选择的形态和选择的ΔG°rxn2值，根据需要用对序列的迭代精细调节来设计变体-特异性库。其他考虑，如寡核苷酸长度、采用的官能化等可用于进一步指导并且提供库序列选择的信息。
实施例
条件性荧光竞争性组合物的实验结果
为了实验验证竞争性组合物在结合至探针中在变体上富集靶标的能力，在探针的条件荧光版本上设计并进行实验(图5)。探针天然是暗的，直至其与靶标或变体杂交。通过用小量(加载)的靶标观察对变体样品的荧光响应，并与没有靶标的情况下相同量的变体的荧光响应，可推导出由竞争性组合物提供富集。
现在参考图5，4个主要产物通过图3所述的反应形成；这些之中，2个涉及探针的参数产生高荧光。由与探针结合的靶标生成的荧光表示为fA，由与探针结合的变体生成的荧光表示为fC，并且由于不完全猝灭、光子检测器暗电流、比色皿的自荧光和水拉曼光谱的总背景荧光表示为fB。
图6-8显示了基于3种不同的癌症相关突变序列的探针、库、靶标和变体的序列设计，来自COSMIC数据库。在各自这些中，变体是野生型基因序列，并且靶标是单核苷酸变体；各种情况中，变体浓度是靶标浓度的3000倍(X＝3000)，但0.033％加载的靶标产生与变体相似的额外荧光信号。这表明与探针结合的分子，靶标富集倍数超过1000。
采用的不同量度是“结合亲和性倍数变化β”，其定义为(fA·X)/(fB+fC)-结合亲和性倍数变化很可能是最可重复且文件的计量，因为背景荧光水平fB可能由于来自不同比色皿的自荧光，或者样品架的位置差异或其他改变而变化。富集因子(X/Y)的下限可计算为结合亲和性倍数变化。
针对X＝1000的竞争性组合物，对44种不同癌症相关突变进行图6-8的类似实验，使用图9A所示的探针和库形态。下表1-3表示用于这些实验中的序列，其中：P-第一靶标探针寡核苷酸；C-第二靶标探针寡核苷酸；F-带标签的第三靶标探针寡核苷酸；Q-带猝灭剂的第四靶标探针寡核苷酸；Ps-第一变体探针寡核苷酸；Cs-第二变体探针寡核苷酸；T-靶核酸序列；V-变体核酸物质。应注意到第三和第四靶标探针寡核苷酸是各探针所共同的(各实验的探针包括P-C-F-Q复合物，仅P-C序列变化)。F和P官能化链通过IDT进行合成后HPLC纯化；虽有其他链安排标准脱盐且不纯化。在官能化序列中，3Rox N/表示由NHS酯化学官能化的3′ROX(羧基-X-若丹明)荧光团的IDT登录号，并且/5IAbRQ/表示5′Iowa黑红猝灭剂基团的IDT登录号。
表1：图9A-9D的实验中使用的探针、库、靶标和变体的序列。
表2：与表1的探针序列联用的第三寡核苷酸(F)和第四寡核苷酸(Q)所用序列。
表3：SMAD7基因座处的序列非等位基因特异性引物。
结果总结于图9B。为清楚起见，非线性显示高于400的β值。可以看到，所有实验提示超过200的富集因素，中值为1000左右。图9C显示了竞争性组合物实验与仅提供探针而没有库的相同的44种不同靶标/变体对在X＝100处的实验的比较。仅探针实验的性能是高度变化的，并且中值富集明显较低，中值为约30，与现有技术的报道相一致。因此，竞争性组合物以同源无酶的方式显著改善靶标的富集，促进了在稀有等位基因检测中的应用。
竞争性组合物相比良好的单独靶标特异性探针改善的主要原因在于竞争性组合物同时捕获ΔΔG°1和ΔΔG°2的富集能力，而单独靶标特异性探针仅捕获ΔΔG°1。
图10显示了对人基因组DNA样品的PCR扩增子进行的竞争性组合物试验。两种从Coriell细胞库提取的在SMAD7基因座处含有单核苷酸多态性的DNA样品(NA18537和NA18546)以各种比率混合至2ng/μL的总浓度(50μL)，并且通过不对称非等位基因特异性PCR扩增以生成单链扩增子。针对各等位基因而设计的竞争性组合物与指定PCR产物混合用于检测。可以看到，竞争性组合物能可靠地检测低至1％的PCR后预期靶标。
因此，本发明非常适于实现上述的以及其中所固有的目的和优点。本领域技术人员可作出许多包括在本发明的所示的精神(部分地由所附权利要求示出)内的改变。
序列表
<110> 威廉马歇莱思大学（WILLIAM MARSH RICE UNIVERSITY）
<120> 用于富集含稀有等位基因的物质的核酸分子的竞争性组合物
<130> 14-21011-WO (260947.00237)
<140>
<141>
<150> 61/981,588
<151> 2014-04-18
<160> 282
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 1
gttaaatcgt ggatagtaga cttcgcac 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 2
gtgcgaacag gtacatttgc tcgtcctt 28
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 3
ccatgctcac agcctcatc 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 4
tgtttcctga ggagtctgag g 21
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 5
aaggacgagc aaatgtacct gcactcatcc aaaagaggaa a 41
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 6
gggtcctgtt tcctcttttg gatgagtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 7
cgactctcat ccaaaagagg aa 22
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 8
gggtcctatt tcctcttttg gatgagagtc g 31
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 9
aaggacgagc aaatgtacct gcactcatcc aaaagaggaa 40
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 10
gggtcctatt tcctcttttg gatgagtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 11
acacactcat ccaaaagagg aaa 23
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 12
gggtcctgtt tcctcttttg gatgagtgtg t 31
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 13
ataggtggtt ttggtctagc tacagtgaaa 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 14
ataggtgatt ttggtctagc tacagtgaaa 30
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 15
aaggacgagc aaatgtacct gcaaggtggt tttggtctag c 41
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 16
ttcactgtag ctagaccaaa accaccttgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 17
tgttaataag gtgattttgg tctagc 26
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 18
tcactgtagc tagaccaaaa tcaccttatt aaca 34
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 19
ataggtgatt ttggtctagc tacagagaaa 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 20
ataggtgatt ttggtctagc tacagtgaaa 30
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 21
aaggacgagc aaatgtacct gcaaggtgat tttggtctag 40
<210> 22
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 22
tctctgtagc tagaccaaaa tcaccttggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 23
cgcaggtgat tttggtctag c 21
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 24
tcactgtagc tagaccaaaa tcacctgcg 29
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 25
ttcaaaaaga tcaaagtgct ggcctccggt 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 26
ttcaaaaaga tcaaagtgct gggctccggt 30
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 27
aaggacgagc aaatgtacct gcacaaaaag atcaaagtgc tgg 43
<210> 28
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 28
cggaggccag cactttgatc tttttgtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 29
aggcaaaaag atcaaagtgc tgg 23
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 30
cggagcccag cactttgatc tttttgcct 29
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 31
gcctacgtga tggccatcgt ggacaacccc 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 32
gcctacgtga tggccagcgt ggacaacccc 30
<210> 33
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 33
aaggacgagc aaatgtacct gcactacgtg atggccatcg t 41
<210> 34
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 34
ggttgtccac gatggccatc acgtagtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 35
agttctacgt gatggccagc gtg 23
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 36
ggttgtccac gctggccatc acgtagaact 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 37
gtgcagctca tcatgcagct catgcccttc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 38
gtgcagctca tcacgcagct catgcccttc 30
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 39
aaggacgagc aaatgtacct gcagcagctc atcatgcagc tc 42
<210> 40
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 40
agggcatgag ctgcatgatg agctgctggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 41
tgttaatagc agctcatcac gcagctc 27
<210> 42
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 42
agggcatgag ctgcgtgatg agctgctatt aaca 34
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 43
atgtcaagat cacagatttt gggcgggcca 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 44
atgtcaagat cacagatttt gggctggcca 30
<210> 45
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 45
aaggacgagc aaatgtacct gcagtcaaga tcacagattt tgg 43
<210> 46
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 46
gcccgcccaa aatctgtgat cttgactggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 47
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 47
tgttaatagt caagatcaca gattttgg 28
<210> 48
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 48
gccagcccaa aatctgtgat cttgactatt aaca 34
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 49
tggccaaaca gctgggtgcg gaagagaaag 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 50
tggccaaact gctgggtgcg gaagagaaag 30
<210> 51
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 51
aaggacgagc aaatgtacct gcagccaaac agctgggtgc g 41
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 52
tttctcttcc gcacccagct gtttggctgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 53
tagttgccaa actgctgggt gcg 23
<210> 54
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 54
ttctcttccg cacccagcag tttggcaact a 31
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 55
actacctttc tacggacgtg ggattctgca 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 56
actacctttc tacggacgtg ggatcctgca 30
<210> 57
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 57
aaggacgagc aaatgtacct gcataccttt ctacggacgt g 41
<210> 58
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 58
cagaatccca cgtccgtaga aaggtatggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 59
tgttaatata cctttctacg gacgtg 26
<210> 60
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 60
caggatccca cgtccgtaga aaggtatatt aaca 34
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 61
ttccagtggc catcaaagtg tcgagggaaa 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 62
ttccagtggc catcaaagtg ttgagggaaa 30
<210> 63
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 63
aaggacgagc aaatgtacct gcaccagtgg ccatcaaagt g 41
<210> 64
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 64
tccctcgaca ctttgatggc cactggtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 65
gttaatacca gtggccatca aagtg 25
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 66
tccctcaaca ctttgatggc cactggtatt aac 33
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 67
ggatgtgcgg ctcatacaca gggacttggc 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 68
ggatgtgcgg ctcgtacaca gggacttggc 30
<210> 69
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 69
aaggacgagc aaatgtacct gcaatgtgcg gctcatacac a 41
<210> 70
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 70
caagtccctg tgtatgagcc gcacattggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 71
gttaataatg tgcggctcgt acaca 25
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 72
caagtccctg tgtacgagcc gcacattatt aac 33
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 73
cttgtggtag ttggagctgc tggc 24
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 74
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 75
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 75
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
<210> 76
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 76
gccagcagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 77
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 77
ccgctgtggt agttgga 17
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 78
caccagctcc aactaccaca gcgc 24
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 79
cttgtggtag ttggagcttg tggc 24
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 80
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 81
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 81
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag c 41
<210> 82
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 82
gccacaagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 83
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 83
ccgctgtggt agttgga 17
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 84
caccagctcc aactaccaca gcgc 24
<210> 85
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 85
cttgtggtag ttggagctga tggc 24
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 86
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 87
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 87
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
<210> 88
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 88
gccatcagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 89
gcatctgtgg tagttgga 18
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 90
caccagctcc aactaccaca gatgc 25
<210> 91
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 91
cttgtggtag ttggagctcg tggc 24
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 92
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 93
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 93
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag c 41
<210> 94
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 94
gccacgagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 95
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 95
ccgctgtggt agttgga 17
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 96
caccagctcc aactaccaca gcgc 24
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 97
cttgtggtag ttggagctag tggc 24
<210> 98
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 98
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 99
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 99
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
<210> 100
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 100
gccactagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 101
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 101
ccgctgtggt agttgga 17
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 102
caccagctcc aactaccaca gcgc 24
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 103
cttgtggtag ttggagctgt tggc 24
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 104
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 105
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 105
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
<210> 106
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 106
gccaacagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 107
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 107
ccgctgtggt agttgga 17
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 108
caccagctcc aactaccaca gcgc 24
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 109
cttgtggtag ttggagctgg ttgc 24
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 110
cttgtggtag ttggagctgg tggc 24
<210> 111
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 111
aaggacgagc aaatgtacct gcaacttgtg gtagttggag 40
<210> 112
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 112
gcaaccagct ccaactacca caagttggtc tactatccac gatttaac 48
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 113
caggctgtgg tagttgga 18
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 114
caccagctcc aactaccaca gcctg 25
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 115
cttgtggtag ttggagctgg tgacgtaggc 30
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 116
cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc 30
<210> 117
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 117
aaggacgagc aaatgtacct gcatgtggta gttggagctg g 41
<210> 118
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 118
ctacgtcacc agctccaact accacatggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 119
ttaatatgtg gtagttggag ctggt 25
<210> 120
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 120
ctacgccacc agctccaact accacatatt aa 32
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 121
cttgtggtag ttggagctgg tgtcgtaggc 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 122
cttgtggtag ttggagctgg tggcgtaggc 30
<210> 123
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 123
aaggacgagc aaatgtacct gcatgtggta gttggagctg g 41
<210> 124
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 124
ctacgacacc agctccaact accacatggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 125
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 125
aggtgtggta gttggagctg gt 22
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 126
ctacgccacc agctccaact accacacct 29
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 127
gcaggtcacg aggagtacag tgcaatgagg 30
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 128
gcaggtcaag aggagtacag tgcaatgagg 30
<210> 129
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 129
aaggacgagc aaatgtacct gcaaggtcac gaggagtaca g 41
<210> 130
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 130
tcattgcact gtactcctcg tgaccttggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 131
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 131
tgttaataag gtcaagagga gtacag 26
<210> 132
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 132
tcattgcact gtactcctct tgaccttatt aaca 34
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 133
acccagaatc agaaggtggg agaactgaag 30
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 134
acccagaagc agaaggtggg agaactgaag 30
<210> 135
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 135
aaggacgagc aaatgtacct gcaccagaat cagaaggtgg g 41
<210> 136
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 136
ttcagttctc ccaccttctg attctggtgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 137
aggccagaag cagaaggtgg g 21
<210> 138
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 138
tcagttctcc caccttctgc ttctggcct 29
<210> 139
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 139
gtggttggag catgtggtgt tgggaaaagc 30
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 140
gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30
<210> 141
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 141
aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcatgtggtg tt 42
<210> 142
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 142
cttttcccaa caccacatgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 143
aggggttgga gcaggtggtg t 21
<210> 144
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 144
ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 145
gtggttggag cagatggtgt tgggaaaagc 30
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 146
gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30
<210> 147
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 147
aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcagatggtg tt 42
<210> 148
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 148
cttttcccaa caccatctgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 149
aggggttgga gcaggtggtg t 21
<210> 150
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 150
ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29
<210> 151
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 151
tacaaactgg tggtggttgg agcaagtggt 30
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 152
tacaaactgg tggtggttgg agcaggtggt 30
<210> 153
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 153
aaggacgagc aaatgtacct gctcaaactg gtggtggttg ga 42
<210> 154
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 154
cacttgctcc aaccaccacc agtttgaggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 155
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 155
cgatcaaact ggtggtggtt gga 23
<210> 156
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 156
cacctgctcc aaccaccacc agtttgatcg 30
<210> 157
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 157
gtggttggag caggtgatgt tgggaaaagc 30
<210> 158
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 158
gtggttggag caggtggtgt tgggaaaagc 30
<210> 159
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 159
aaggacgagc aaatgtacct gcaggttgga gcaggtgatg tt 42
<210> 160
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 160
cttttcccaa catcacctgc tccaacctgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 161
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 161
aggggttgga gcaggtggtg t 21
<210> 162
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 162
ttttcccaac accacctgct ccaacccct 29
<210> 163
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 163
atactggata cagctggaca tgaagagtac 30
<210> 164
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 164
atactggata cagctggaca agaagagtac 30
<210> 165
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 165
aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggac 40
<210> 166
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 166
actcttcatg tccagctgta tccagttggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 167
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 167
tgttaataac tggatacagc tggac 25
<210> 168
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 168
actcttcttg tccagctgta tccagttatt aaca 34
<210> 169
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 169
atactggata cagctggaaa agaagagtac 30
<210> 170
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 170
atactggata cagctggaca agaagagtac 30
<210> 171
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 171
aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggaa 40
<210> 172
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 172
actcttcttt tccagctgta tccagttggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 173
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 173
tgttaataac tggatacagc tggac 25
<210> 174
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 174
actcttcttg tccagctgta tccagttatt aaca 34
<210> 175
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 175
ggacatactg gatacagctg gactagaaga 30
<210> 176
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 176
ggacatactg gatacagctg gacaagaaga 30
<210> 177
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 177
aaggacgagc aaatgtacct gcaacatact ggatacagct 40
<210> 178
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 178
ttctagtcca gctgtatcca gtatgttggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 179
gttaataaca tactggatac agctg 25
<210> 180
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 180
ttcttgtcca gctgtatcca gtatgttatt aac 33
<210> 181
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 181
atactggata cagctggacg agaagagtac 30
<210> 182
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 182
atactggata cagctggaca agaagagtac 30
<210> 183
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 183
aaggacgagc aaatgtacct gcaactggat acagctggac g 41
<210> 184
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 184
tactcttctc gtccagctgt atccagttgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 185
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 185
gtgttaataa ctggatacag ctggac 26
<210> 186
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 186
actcttcttg tccagctgta tccagttatt aacac 35
<210> 187
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 187
ctctctaaaa tcactgagca ggagaaagat 30
<210> 188
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 188
ctctctgaaa tcactgagca ggagaaagat 30
<210> 189
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 189
aaggacgagc aaatgtacct gcactctaaa atcactgagc a 41
<210> 190
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 190
tctttctcct gctcagtgat tttagagtgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 191
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 191
aggctctgaa atcactgagc a 21
<210> 192
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 192
ctttctcctg ctcagtgatt tcagagcct 29
<210> 193
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 193
agatcctctc tctgaaatca ctaagcagga 30
<210> 194
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 194
agatcctctc tctgaaatca ctgagcagga 30
<210> 195
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 195
aaggacgagc aaatgtacct gcaatcctct ctctgaaatc ac 42
<210> 196
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 196
cctgcttagt gatttcagag agaggattgg tctactatcc acgatttaac 50
<210> 197
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 197
ttaataatcc tctctctgaa atcac 25
<210> 198
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 198
ctgctcagtg atttcagaga gaggattatt aa 32
<210> 199
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 199
tgatgcactt catggtggct ggacaacaaa 30
<210> 200
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 200
tgatgcacat catggtggct ggacaacaaa 30
<210> 201
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 201
aaggacgagc aaatgtacct gcaatgcact tcatggtggc t 41
<210> 202
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 202
tgttgtccag ccaccatgaa gtgcattggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 203
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 203
tgttaataat gcacatcatg gtggct 26
<210> 204
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 204
tgttgtccag ccaccatgat gtgcattatt aaca 34
<210> 205
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 205
tgatgcacgt catggtggct ggacaacaaa 30
<210> 206
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 206
tgatgcacat catggtggct ggacaacaaa 30
<210> 207
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 207
aaggacgagc aaatgtacct gcaatgcacg tcatggtggc t 41
<210> 208
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 208
tgttgtccag ccaccatgac gtgcattggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 209
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 209
gtgttaataa tgcacatcat ggtggct 27
<210> 210
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 210
tgttgtccag ccaccatgat gtgcattatt aacac 35
<210> 211
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 211
atcgactcca ccgaggtcat ctactagccg 30
<210> 212
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 212
atcgactcca ccgaggtcat ctaccagccg 30
<210> 213
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 213
aaggacgagc aaatgtacct gcacgactcc accgaggtca t 41
<210> 214
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 214
gctggtagat gacctcggtg gagtcgtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 215
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 215
caccacgact ccaccgaggt cat 23
<210> 216
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 216
gctggtagat gacctcggtg gagtcgtggt g 31
<210> 217
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 217
atcccgggcg actgtggccc cctgctctct 30
<210> 218
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 218
atcccgggcg actgtggccc cccgctctct 30
<210> 219
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 219
aaggacgagc aaatgtacct gcacccgggc gactgtggcc cc 42
<210> 220
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 220
agagcagggg gccacagtcg cccgggtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 221
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 221
tgttaatacc cgggcgactg tggcccc 27
<210> 222
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 222
agagcggggg gccacagtcg cccgggtatt aaca 34
<210> 223
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 223
aggacctctt ggacatcgag gatgacatca 30
<210> 224
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 224
aggacctctt cgacatcgag gatgacatca 30
<210> 225
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 225
aaggacgagc aaatgtacct gcagacctct tggacatcga g 41
<210> 226
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 226
atgtcatcct cgatgtccaa gaggtctggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 227
gttaatagac ctcttcgaca tcgag 25
<210> 228
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 228
atgtcatcct cgatgtcgaa gaggtctatt aac 33
<210> 229
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 229
gttgtgaggc actgccccca ccatgagcgc 30
<210> 230
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 230
gttgtgaggc gctgccccca ccatgagcgc 30
<210> 231
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 231
aaggacgagc aaatgtacct gcatgtgagg cactgccccc ac 42
<210> 232
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 232
gctcatggtg ggggcagtgc ctcacatggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 233
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 233
gtcgaggcgc tgcccccacc atg 23
<210> 234
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 234
agcgctcatg gtgggggcag cgcctcgac 29
<210> 235
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 235
actttttgac atagtgtggt ggtgccctat 30
<210> 236
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 236
acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 30
<210> 237
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 237
aaggacgagc aaatgtacct gcatttttga catagtgtgg tg 42
<210> 238
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 238
agggcaccac cacactatgt caaaaatggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 239
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 239
aagacaattt tcgacatagt gtggtg 26
<210> 240
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 240
agggcaccac cacactatgt cgaaaattgt ctt 33
<210> 241
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 241
cgacatagtg tggtggtgcc ctgtgagccg 30
<210> 242
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 242
cgacatagtg tggtggtgcc ctatgagccg 30
<210> 243
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 243
aaggacgagc aaatgtacct gcaacatagt gtggtggtgc cc 42
<210> 244
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 244
gctcacaggg caccaccaca ctatgttggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 245
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 245
tgttaataac atagtgtggt ggtgcc 26
<210> 246
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 246
gctcataggg caccaccaca ctatgttatt aaca 34
<210> 247
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 247
ttcctgcatg ggcggcatga accagaggcc 30
<210> 248
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 248
ttcctgcatg ggcggcatga accggaggcc 30
<210> 249
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 249
aaggacgagc aaatgtacct gcacctgcat gggcggcatg a 41
<210> 250
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 250
cctctggttc atgccgccca tgcaggtggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 251
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 251
gccctgcatg ggcggcatga ac 22
<210> 252
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 252
cctccggttc atgccgccca tgcagggc 28
<210> 253
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 253
atgaactgga ggcccatcct caccatcatc 30
<210> 254
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 254
atgaaccgga ggcccatcct caccatcatc 30
<210> 255
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 255
aaggacgagc aaatgtacct gcagaactgg aggcccatcc t 41
<210> 256
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 256
tgatggtgag gatgggcctc cagttctggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 257
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 257
tgttaataga accggaggcc catcct 26
<210> 258
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 258
tgatggtgag gatgggcctc cggttctatt aaca 34
<210> 259
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 259
acggaacagc tttgaggtgt gtgtttgtgc 30
<210> 260
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 260
acggaacagc tttgaggtgc gtgtttgtgc 30
<210> 261
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 261
aaggacgagc aaatgtacct gcaggaacag ctttgaggtg t 41
<210> 262
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 262
acaaacacac acctcaaagc tgttcctggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 263
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 263
tgttaatagg aacagctttg aggtgc 26
<210> 264
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 264
acaaacacgc acctcaaagc tgttcctatt aaca 34
<210> 265
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 265
aggtgcatgt ttgtgcctgt cctgggagag 30
<210> 266
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 266
aggtgcgtgt ttgtgcctgt cctgggagag 30
<210> 267
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 267
aaggacgagc aaatgtacct gcagtgcatg tttgtgcctg t 41
<210> 268
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 268
ctcccaggac aggcacaaac atgcactggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 269
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 269
agttgtgcgt gtttgtgcct gtc 23
<210> 270
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 270
ctcccaggac aggcacaaac acgcacaact 30
<210> 271
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 271
gggagagact ggcgcacaga ggaagagaat 30
<210> 272
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 272
gggagagacc ggcgcacaga ggaagagaat 30
<210> 273
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 273
aaggacgagc aaatgtacct gcagagagac tggcgcacag a 41
<210> 274
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 274
tctcttcctc tgtgcgccag tctctctggt ctactatcca cgatttaac 49
<210> 275
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 275
gttaatagag agaccggcgc acaga 25
<210> 276
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 276
tctcttcctc tgtgcgccgg tctctctatt aac 33
<210> 277
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 277
gcagtttggc ccgcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cg 42
<210> 278
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 278
cggtgtcagg catgtcaaga tcacagattt tgggcggg 38
<210> 279
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 279
aatctgtgat cttgacatgc ctgacaccg 29
<210> 280
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 280
aagatcacag attttgggct ggccaaactg catctt 36
<210> 281
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 281
aagatgcagt ttggccagcc c 21
<210> 282
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：合成寡核苷酸
<400> 282
gcagtttggc cagcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cg 42
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！