多聚体Fc蛋白的制作方法

背景

免疫性病症广泛包括具有不同体征、症状、病因学和致病机制的各种疾病。许多这类疾病的特征在于致病性抗体和/或致病性免疫复合物的活跃参与。在一些疾病诸如ITP(可变地称为免疫性血小板减少症，免疫血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜)中，致病性抗体的靶抗原(Hoemberg,Scand HJ Immunol，第74卷(5),p489-495,2011)和疾病过程被合理地了解清楚了。此类免疫性病症通常利用各种常规药剂(作为单一疗法或组合在一起)来治疗。此类药剂的实例是皮质类固醇(其与许多副作用相关)、静脉注射免疫球蛋白(IVIG)和抗D。

抗体(通常被称为免疫球蛋白)是包含通过链间二硫键保持在一起的两条相同重(H)链和两条相同轻(L)链的Y形分子。每条链由一个可变结构域(V)组成，所述可变结构域在序列上可变并且负责抗原结合。每条链还由至少一个恒定区(C)组成。在轻链中，存在单个恒定结构域(CL)。在重链中，存在至少3个、有时4个恒定结构域，这取决于同种型(CH1、CH2、CH3、CH4)。IgG、IgA和IgD具有3个重链恒定结构域；IgM和IgE具有4个重链恒定结构域。

在人类中存在称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的五个不同种类或同种型的免疫球蛋白。所有这些种类具有基本的四链Y形结构，但它们相异在于它们的重链(分别被称为α、δ、ε、γ和μ)。IgA可被进一步细分成两个亚类，称为IgA1和IgA2。IgG有四个亚类，称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

抗体的Fc结构域通常包含每条重链的至少最后两个恒定结构域，所述恒定结构域二聚化以形成Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体的效应子功能，包括决定抗体半寿期(主要通过与FcRn的结合)、遍及身体的分布、固定补体的能力以及与细胞表面Fc受体的结合。

抗体同种型之间的差异在Fc结构域中最为明显，并且这导致在对抗原结合后不同效应子功能的触发。结构上的差异还导致抗体的聚合状态的差异。因此，IgG、IgE和IgD一般为单体，而IgM既以五聚体形式存在也以六聚体形式存在，IgA在血清中主要以单体形式存在并且在浆液粘液性分泌中主要以二聚体形式存在。

静脉注射免疫球蛋白(IVIG)是来自成千上万的健康血液供体的混合免疫球蛋白。IVIG最初被用作IgG替代疗法来预防具有低IgG水平的患者的机会性感染(综述于Baerenwaldt,Expert Rev ClinImmunol，第6卷(3),p425-434,2010)。在患有ITP的儿童中发现IVIG的抗炎性质(Imbach,Helv Paediatri Acta，第36卷(1),p81-86,1981)后，IVIG现被许可用于治疗ITP、Guillain-Barré综合征、川崎病和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(Nimmerjahn,Annu Rev Immunol，第26卷，p513-533,2008)。

已有人提出，在涉及致病性免疫复合物的疾病中，少部分成分免疫球蛋白级分不成比例地有效。据观测，微量(通常1-5％)的IgG以多聚体形式存在于IVIG内。大部分该多聚体级分被认为是二聚体以及较少量的三聚体和更高级形式。还已提出，另外的二聚体可在输注后接受者的抗独特型抗体的结合而形成。有一种理论认为，这些多聚体形式因它们增强的亲合力而与免疫复合物竞争对低亲和力Fcγ受体的结合(Augener,Blut，第50卷，p249-252,1985；Teeling,Blood第98卷(4),p1095-1099,2001；Machino,Y.,Clin ExpImmunol，第162卷(3),p415-424,2010；Machino,Y.等，BBRC，第418卷,p748-753,2012)。另一种理论是IVIG内的IgG的唾液酸糖基化形式、尤其是较高水平的α2-6唾液酸形式的存在，引起Fcγ受体活化状态的改变(Samuelsson,Science，第291卷，p484-486,2001；Kaneko,Science，第313卷，p670-673,2006；Schwab,European J Immunol第42卷，p826-830,2012；Sondermann,PNAS，第110卷(24),p9868-9872,2013)。

已有人提出，在涉及致病性抗体的疾病中，向人施用非常大剂量的IVIG(1-2g/kg)有效地越过了通过FcRn进行的正常IgG动态平衡机制。有效地，供体IVIG对接受者IgG的大量稀释导致患者致病性抗体的增强的代谢和较短的血清半寿期。其它提出的功效机制包括致病性抗体的抗独特型中和以及补体因子的瞬间减少(Mollnes,MolImmunol，第34卷，p719-729,1997；Crow,Transfusion Medicine Reviews，第22卷(2),p103-116,2008；Schwab,I.和Nimmerjahn,F.Nature Reviews Immunology，第13卷，p176-189,2013)。

IVIG的临床使用有着显著的不利方面。IVIG具有因制造方法和供体库中固有的差异而在制造商之间具有可变的产品质量(Siegel,Pharmacotherapy第25卷(11)p78S-84S,2005)。以非常大的剂量，通常以1-2g/kg的量级给予IVIG。该大剂量使得输注必需持续很长的时间(4-8小时，有时持续数天)，这对于患者来说是令人不快的，并可能导致输注相关不良事件。可发生严重的不良事件，IgA缺陷个体中的反应是众所周知的。还可在接受IVIG的患者中观测到细胞因子释放，但这通过剂量和输注速率的细心控制得以大大地减少至最少。每个患者大量使用和对人供体的依赖的结果是，IVIG的生产是昂贵的，并且全球供应受到严重限制。

总之，IVIG的不利方面意味着有必要在能够干扰致病性抗体和致病性免疫复合物的疾病生物学的分子的临床供应、管理和功效方面进行改善。

现有技术已经描述了多聚体蛋白，其中将来自IgM或IgA的羧基末端尾部添加至全IgG3分子恒定区的羧基末端以产生重组IgM样IgG3(V.等，J Immunol，第156卷，p2858-2865,1996)。通过在用半胱氨酸残基取代位置309上的亮氨酸残基(L309C)来额外地修饰所述IgG3分子。在一些实验中，尾部被省略，并且只用L309C修饰IgG3分子。所研究的IgG3分子是完整的免疫球蛋白分子。相反，本发明的多聚体蛋白不包含第一重链恒定结构域CH1。

在本发明中，我们提供了改进的多聚体蛋白，其解决了IVIG的许多不利方面。在精心控制的条件下大量产生所述蛋白，从而消除了供应有限和质量可变的问题。此外，本发明的改进的多聚体蛋白在如本文所述的其它病症中具有治疗应用。

发明描述

本发明的多聚体蛋白已被统称为“Fc多聚体”并且所述两个术语在本文中可互换使用。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属的领域内技术人员通常理解的含义相同的含义。本文中提及的所有出版物和专利通过引用并入。

应当理解的是，可组合本文所述的任何实施方案。

在本说明书中，除非另外指定，否则使用EU编号系统来提及抗体结构域中的残基。该系统最初由Edelman等，1969设计，并且在Kabat等，1987中进行了详细描述。

Edelman等，1969；“The covalent structure of an entireγG immunoglobulin molecule,”PNAS Biochemistry第63卷pp78-85。

Kabat等，1987；于Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA中。

当将位置编号和/或氨基酸残基赋予特定抗体同种型时，其旨在适用于任何其它抗体同种型的相应的位置和/或氨基酸残基，这是本领域技术人员已知的。

本发明提供了包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体蛋白；

其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域；

其中每一个重链Fc区在位置309上包含半胱氨酸残基，所述残基使单体单元组装成多聚体；

以及其中每一个多肽单体单元不包含CH1结构域或尾部。

CH1结构域是指第一抗体重链恒定结构。

本发明人已发现，可通过工程化位置309上的半胱氨酸残基的存在来使抗体Fc结构域多聚化成多价形式。他们已观察到较高等级的效价形式导致较高亲合力的对Fc受体(FcR)的结合，以及人全血中升高的细胞因子释放水平。较高的效价在某些免疫适应症诸如ITP、GBS和CIDP中是期望的，以实现FcγR与致病性抗体和免疫复合物的结合的有效阻断。升高的细胞因子释放可以是有用的或有害的，这取决于期望的临床用途和分子靶。在靶向细胞杀伤应用诸如癌症和其它增生性病症中，升高的细胞因子水平可能是有利的。抗原靶向部分诸如scFv、单结构域抗体(例如vL、vH、vHH、鲨鱼VNAR、骆驼v区)、工程化SH3结构域或DARPin在本发明的多聚体蛋白的N或C末端上的融合可将多聚体Fc蛋白靶向靶细胞，并引发通过已详尽描述的效应子功能诸如CDC、ADCC和ADCP的杀伤。这些功能可通过增加的FcγR结合的亲合力来增强。另外，高局部水平的具有细胞毒性效应的细胞因子诸如IFNγ和TNFα可增强细胞杀伤。局部细胞因子还可引发免疫细胞浸润，从而增强抗靶应答。在疫苗应用中，抗原部分诸如变应原肽、肿瘤抗原或类似物在本发明的多聚体蛋白的N或C末端上的融合可将多聚体Fc蛋白靶向参与抗原呈递的靶细胞。树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞都能够进行抗原的摄取、消化以及通过MHC-I或MHC-II呈递至T细胞。因此，通过增加的对FcγR的结合亲合力增强将抗原靶向至抗原呈递细胞是期望的。另外，增加的局部细胞因子的产生可能会因活化的免疫细胞的活化或浸润而进一步增加免疫应答。在细胞杀伤和疫苗方法中进一步提高靶向可通过影响FcγR或FcRn结合的Fc突变来进行。

因此，在一个实例中，本发明的多聚体蛋白还包含融合伴侣。术语‘融合伴侣’可指选自scFv、单结构域抗体(例如vL、vH、vHH、鲨鱼VNAR、骆驼v区)、工程化SH3结构域或DARPin的抗原靶向部分。或者，所述融合伴侣可以是抗原(例如变应原肽或肿瘤抗原)、病原体相关分子模式(PAMP)、药物、配体、受体、细胞因子或趋化因子。

肿瘤抗原的实例包括：

·Mage基因产物，例如MAGE肿瘤抗原，例如MAGE 1、MAGE2、MAGE 3、MAGE 4、MAGE 5、MAGE 6、MAGE 7、MAGE 8、MAGE 9、MAGE 10、MAGE 11或MAGE 12。编码这些MAGE抗原的基因位于X染色体上，并且在它们的编码序列上彼此享有64至85％的同源性(De Plaen,1994)。这些抗原有时称为MAGE Al、MAGE A2、MAGE A3、MAGE A4、MAGE A5、MAGE A6、MAGE A7、MAGE A8、MAGE A9、MAGE A 10、MAGE Al 1和/或MAGE A12(MAGE A家族)。在一个实施方案中，所述抗原是MAGE和/或可使用来自两个其它MAGE家族：MAGE B和MAGE C组之一的抗原。MAGE B家族包括MAGE B 1(也称为MAGE Xp 1和DAM 10)、MAGE B2(也称为MAGE Xp2和DAM 6)、MAGE B3和MAGE B4-Mage C家族目前包括MAGE Cl和MAGE C2；

·睾丸癌抗原诸如PRAME、LAGE 1、LAGE 2；

·SSX-2；SSX-4；SSX-5；NA17；MELAN-A；酪氨酸酶；LAGE-I；NY-ESO-I；PRAME；P790；P510；P835；B305D；B854；C1491；C1584和C1585。在一个实施方案中，所述抗原可包含P501S(也称为prostein)或由其组成；和

·由Wilm’s肿瘤基因表达的WT-I，或其包含约或大致氨基酸1-249的N末端片段WT-IF；

·由Her-2/neu基因表达的抗原或其片段。

将所述融合伴侣(当存在时)融合于所述重链Fc区或每一个重链Fc区的N端和/或C末端。可将融合伴侣直接融合于重链Fc区的N和/或C末端。或者，可通过间插氨基酸序列间接地融合其，所述间插氨基酸序列(当存在时)可包括铰链。例如，可在融合伴侣与重链Fc区之间提供短的接头序列。

在诸如免疫性病症的治疗的某些应用中，可以不需要融合伴侣。因此，在一个实例中，本发明的蛋白质不包含融合伴侣。

本发明的多聚体蛋白的每一个多肽单体单元包含抗体Fc结构域。

本发明的抗体Fc结构域可来源于任何合适的物种。在一个实施方案中，抗体Fc结构域来源于人Fc结构域。

抗体Fc结构域可来源于任何合适种类的抗体，包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。在一个实施方案中，抗体Fc结构域来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中，抗体Fc结构域来源于IgG1。在一个实施方案中，抗体Fc结构域来源于IgG4。

抗体Fc结构域包含两条多肽链，每一条被称为重链Fc区。两个重链Fc区二聚化以产生抗体Fc结构域。虽然抗体Fc结构域内的两个重链Fc区可彼此不同，但应当理解的是，这些重链Fc区通常可彼此相同。因此当在本文下文中使用术语‘重链Fc区’时，这用于指与相同重链Fc区二聚化以产生抗体Fc结构域的单个重链Fc区。

通常，每个重链Fc区包含两个或三个重链恒定结构域或由其组成。

在天然抗体中，IgA、IgD和IgG的重链Fc区由两个重链恒定结构域(CH2和CH3)组成，IgE和IgM的重链Fc区由三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)组成。这些重链Fc区二聚化以产生Fc结构域。

在本发明中，重链Fc区可包含来自一个或多个不同种类(例如一个、两个或三个不同种类)的抗体的重链恒定结构域。

在一个实施方案中，重链Fc区包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域。

在一个实施方案中，重链Fc区包含来源于IgG2的CH2和CH3结构域。

在一个实施方案中，重链Fc区包含来源于IgG3的CH2和CH3结构域。

在一个实施方案中，重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域。

在一个实施方案中，重链Fc区包含来自IgM的CH4结构域。IgM CH4结构域通常位于CH3结构域的C末端。

在一个实施方案中，重链Fc区包含来源于IgG的CH2和CH3结构域和来源于IgM的CH4结构域。

应当理解的是，用于产生本发明的重链Fc区的重链恒定结构域可包括上述天然存在的恒定结构域的变体。此类变体相较于野生型恒定结构域可包含一个或多个氨基酸变异。在一个实例中，本发明的重链Fc区包含至少一个在序列上与野生型恒定结构域不同的恒定结构域。应理解的是，所述变体恒定结构域可比野生型恒定结构域长或短。优选地，所述变体恒定结构域与野生型恒定结构域具有至少50％同一性或与其相似。如本文中所用，术语“同一性”是指在对齐的序列中的任何特定位置上，氨基酸残基在两个序列之间是相同的。如本文中所用，术语“相似性”是指在对齐的序列中的任何特定位置上，氨基酸残基在序列之间具有相似的类型。例如，可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可彼此取代的其它氨基酸包括但不限于：

-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸)；

-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；和

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。

可容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.，编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.，编辑，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.，编辑，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.，编辑，M Stockton Press,New York,1991)。在一个实例中，变体恒定结构域与野生型恒定结构域具有至少60％同一性或相似性。在另一个实例中，所述变体恒定结构域具有70％同一性或相似性。在另一个实例中，所述变体恒定结构域具有80％同一性或相似性。在另一个实例中，所述变体恒定结构域具有90％同一性或相似性。在另一个实例中，所述变体恒定结构域具有95％同一性或相似性。

IgM和IgA以共同的H₂L₂抗体单元的共价多聚体天然存在于人中。当IgM已整合了J链时，其以五聚体形式存在，或当其缺少J链时，其以六聚体形式存在。IgA以单体和二聚体形式存在。IgM和IgA的重链具有至C末端恒定结构域的18个氨基酸延伸(称为尾部)。该尾部包括在多聚体的重链之间形成二硫键的半胱氨酸残基，并且据信在多聚化中具有重要作用。所述尾部还含有糖基化位点。本发明的多聚体蛋白不包含尾部。

本发明的每一个重链Fc区可任选地在其N末端具有天然或经修饰的铰链区。

天然铰链区是通常发现于天然存在的抗体中Fab与Fc结构域之间的铰链区。经修饰的铰链区是在长度和/或组成上与天然铰链区相异的任何铰链。此类铰链可以包括来自其它物种的铰链区，诸如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊的铰链区。其它经修饰的绞链区可包含来源于与所述重链Fc区的抗体种类或亚类不同的种类或亚类的抗体的铰链区。或者，所述经修饰的铰链区可包含天然铰链的部分或重复单元(其中所述重复中的每一个单元来源于天然铰链区)。在其它替代方案中，可通过将一个或多个半胱氨酸或其它残基转换成中性残基诸如丝氨酸或丙氨酸，或通过将适当地放置的残基转换成半胱氨酸残基来改变天然铰链区。通过此类方法，可增加或减少该铰链区中的半胱氨酸残基的数目。其它经修饰的铰链区可以是完全合成的，并且可被设计来具有所需的性质，诸如长度、半胱氨酸组成和柔性。

许多经修饰的铰链区早已在例如US5677425、WO9915549、WO2005003170、WO2005003169、WO2005003170、WO9825971和WO2005003171中进行了描述，并且这些通过引用并入本文。

合适的铰链序列的实例示于表1中。

在一个实施方案中，重链Fc区在其N末端具有完整的铰链区。

在一个实施方案中，重链Fc区和铰链区来源于IgG4并且铰链区包含突变的序列CPPC(SEQ ID NO:9)。相较于含有序列CPPC的IgG1，人IgG4的核心铰链区含有序列CPSC(SEQ ID NO:10)。存在于IgG4序列中的丝氨酸残基导致该区域中柔性增加，因此一定比例的分子在同一蛋白质链内形成二硫键(链内二硫键)，而非桥接IgG分子中的另一重链以形成链间二硫键。(Angal S.等，Mol Immunol，第30卷(1),p105-108,1993)。将丝氨酸残基改变成脯氨酸以提供与IgG1相同的核心序列允许完全形成IgG4铰链区中的链间二硫键，从而减少纯化产物的异质性。该改变的同种型称为IgG4P。

表1.铰链序列

本发明的多聚体蛋白可以包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个或更多个多肽单体单元。此类蛋白质可选择地分别被称为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚、十聚体、十一聚体、十二聚体等。

在一个实施方案中，多聚体蛋白包含具有一系列数目的多肽单体单元的具有不同大小的多聚体蛋白的混合物。

本发明的每一个多肽单体单元包括两条单独的多肽链。特定多肽单体单元内的两条多肽链可以彼此相同，或它们可彼此不同。在一个实施方案中，两条多肽链彼此相同。

类似地，特定多聚体融合蛋白内的多肽单体单元可彼此相同，或它们可彼此不同。在一个实施方案中，多肽单体单元彼此相同。

在一个实施方案中，多肽单体单元的多肽链包含如图1中提供的任选地具有可选择的铰链序列的氨基酸序列。

因此，在一个实例中，本发明还提供了包含两个或更多个多肽单体单元或由其组成的多聚体蛋白；

其中每一个多肽单体单元包含两条相同的多肽链，每条多肽链包含SEQ ID No 24至30的任一个中给出的序列或由其组成，以及

其中多肽单体单元不包含抗体CH1结构域。

在其中铰链可根据在SEQ ID NO 24至30中给出的序列发生变化的一个实例中，本发明提供了包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体蛋白；

其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域；

其中每一个重链Fc区包含SEQ ID NO 24至27和30的任一个的氨基酸6至222中给定的序列或SEQ ID NO 28或29的氨基酸6至333中给出的序列或由所述序列组成，以及

其中多肽单体单元不包含抗体CH1结构域。

通常，每一个重链Fc区在N末端包含铰链序列。

如本文下面所述的，本发明的多聚体蛋白可包含一个或多个突变，所述突变改变蛋白质的功能性质，例如，对Fc受体诸如FcRn或白细胞受体的结合、对补体的结合的突变、经修饰的二硫键结构或改变的糖基化模式。应当理解的是，可以以任何合适的方式组合任何这些突变以获得所需的功能性质，和/或将所述突变与其它突变组合，以改变蛋白质的功能性质。

本发明的多聚体蛋白可显示相较于对应的多肽单体单元和/或天然免疫球蛋白改变的对一种或多种Fc受体(FcR)的结合。可增加或减少对任何特定Fc受体的结合。在一个实施方案中，本发明的多聚体融合蛋白包含改变其Fc受体结合特征谱的一个或多个突变。

如本文中所用，术语“突变”可包括一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失。

人细胞可表达选自FcαR、FcεR、FcγR、FcRn和聚糖受体的许多膜结合的FcR。一些细胞还能表达可溶性(胞外域)FcR(综述见Fridman等，(1993)J Leukocyte Biology 54:504-512)。可根据IgG结合的亲和力(高/低)和生物效应(激活/抑制)进一步划分FcγR。人FcγRI被广泛地认为是唯一的‘高亲和力’受体，而所有其它FcγRI被认为是中至低亲和力受体。FcγRIIb凭借其胞内ITIM基序而为具有‘抑制’功能性的唯一受体，而其它所有的则凭借其ITAM基序或与共同的FcγR-γ链配对而被认为是‘激活性的’。FcγRIIIb也是独特的，因为虽然是活化的，但其通过GPI锚与细胞缔合。总之，人表达六个‘标准’FcγR：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb。除了这些序列以外，还有大量跨这些家族的序列或同种异型变体。已发现这些序列中的一些具有重要的功能性后果，因此有时被认为是它们自己的受体亚型。实例包括FcγRIIa^H134R、FcγRIIb^I190T、FcγRIIIa^F158V和FcγRIIIb^NA1、FcγRIIIb^NA2、FcγRIIIb^SH。已显示每一个受体序列对于IgG的4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有不同的亲和力(Bruhns Blood(1993)第113卷，p3716-3725)。其它物种具有稍微不同的FcγR的数目和功能性，小鼠系统是迄今研究得最充分的，并且由4种FcγR：FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV组成(Bruhns,Blood(2012)第119卷,p5640-5649)。细胞上的人FcγRI因其对于IgG1/IgG3/IgG4的亲和力(～10^-8M)和这些IgG在血清中的浓度(～10mg/ml)而通常被认为在正常血清条件下被单体IgG‘占据’。因此，在其表面上具有FcγRI的细胞被认为能够通过结合的多特异性IgG来替代地进行它们的抗原性环境的‘筛选’或‘取样’。其他具有较低的对于IgG亚类的亲和力(在～10^-5–10^-7M的范围内)的受体通常被认为是‘未被占据的’。低亲和力受体因而固有地对牵涉免疫复合物的抗体的检测以及通过所述复合物的活化敏感。抗体免疫复合物中的增加的Fc密度导致对低亲和力FcγR的结合‘亲合力’的功能性亲和力增加。这已使用许多方法在体外获得了证明(Shields R.L.等，J Biol Chem,第276卷(9),p6591-6604,2001；Lux等，J Immunol(2013)第190卷，p4315-4323)。其还已被显示为是使用抗-RhD治疗人的ITP中的主要作用模式(Crow Transfusion Medicine Reviews(2008)第22卷，p103-116)。

许多细胞类型表达多种类型的FcγR，因此IgG或抗体免疫复合物对具有FcγR的细胞的结合可取决于生物背景而具有多个复杂结果。最简单地，细胞可接收活化、抑制或混合信号。这可导致事件诸如吞噬作用(例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)、抗原加工(例如树突状细胞)、减少的IgG产生(例如B-细胞)或脱粒(例如嗜中性粒细胞、肥大细胞)。有数据支持来自FcγRIIb的抑制信号可主导活化信号的抑制(Proulx Clinical Immunology(2010)135:422-429。

FcRn在维持IgG在成人和儿童的血清中的长半寿期中具有至关重要的作用。该受体在酸化囊泡(pH<6.5)中结合IgG，从而保护IgG分子免受降解，随后在血液中在较高的pH 7.4下释放IgG。

FcRn是不同的白细胞Fc受体，并且相反，具有与MHC I类分子的结构相似性。它是由非共价附接于膜结合的链的β₂-微球蛋白链组成的异二聚体，所述膜结合的链包括3个胞外域。这些结构域之一(包括碳水化合物链)与β₂-微球蛋白一起与Fc的CH2与CH3结构域之间的位点相互作用。该相互作用包括对IgG上的组氨酸残基(其在pH<6.5下带正电荷)产生的盐桥。在较高的pH下，His残基失去它们的正电荷，FcRn-IgG相互作用被减弱并且IgG解离。

在一个实施方案中，本发明的多聚体蛋白结合人FcRn。

在一个实施方案中，所述多聚体蛋白在位置310上，优选也在位置435上具有组氨酸残。这些组氨酸残基对于人FcRn结合是重要的。在一个实施方案中，位置310和435上的组氨酸残基是天然残基，即，位置310和435未被突变。或者，这些组氨酸残基的一个或两个可作为突变的结果存在。

在一个实施方案中，本发明的提供了包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体蛋白；

其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域；

其中每一个重链Fc区在位置309上包含半胱氨酸残基(其使单体单元组装成多聚体)和在位置310上包含组氨酸残基，并且

其中每一个多肽单体单元不包含CH1结构域或尾部。

本发明的多聚体蛋白可包含改变其对FcRn的结合的一个或多个突变。所述改变的结合可以是增强的结合或减弱的结合。

在一个实施方案中，所述多聚体蛋白包含一个或多个突变，以使得其以比对应的天然免疫球蛋白更大的亲和力和亲合力结合FcRn。

在一个实施方案中，通过用谷氨酰胺残基取代位置250上的苏氨酸残基(T250Q)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用脯氨酸残基取代位置252上的甲硫氨酸残基(M252Y)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用苏氨酸残基取代位置254上的丝氨酸残基(S254T)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用谷氨酸残基取代位置256上的苏氨酸残基(T256E)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置307上的苏氨酸残基(T307A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用脯氨酸残基取代位置307上的苏氨酸残基(T307P)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用半胱氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308C)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用苯丙氨酸残基取代位置308上(V308F)的缬氨酸残基来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用脯氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308P)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置311上的谷氨酰胺残基(Q311A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用精氨酸残基取代位置311上的谷氨酰胺残基(Q311R)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用亮氨酸残基取代位置428上的甲硫氨酸残基(M428L)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用赖氨酸残基取代位置433上的组氨酸残基(H433K)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用苯丙氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(N434F)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用酪氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(N434Y)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用酪氨酸残基取代位置252上的甲硫氨酸残基、用苏氨酸残基取代位置254上的丝氨酸残基和用谷氨酸残基取代位置256上的苏氨酸残基(M252Y/S254T/T256E)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用脯氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基和用酪氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(V308P/N434Y)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用酪氨酸残基取代位置252上的甲硫氨酸残基，用苏氨酸残基取代位置254上的丝氨酸残基，用谷氨酸残基取代位置256上的苏氨酸残基，用赖氨酸残基取代位置433上的组氨酸残基以及用苯丙氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)来突变Fc结构域。

应当理解的是，可组合上文所列的任何突变来改变FcRn结合。

在一个实施方案中，多聚体蛋白包含一个或多个突变，以使得其以比对应的天然免疫球蛋白低的亲和力和亲合力结合FcRn。

在一个实施方案中，Fc结构域在位置310和/或位置435上包含除组氨酸外的任意氨基酸残基。

本发明的多聚体蛋白可包含增强其对FcγRIIb的结合的一个或多个突变。FcγRIIb是人中的唯一抑制性受体和在B细胞上发现的唯一Fc受体。B细胞及其致病性抗体是许多免疫性疾病的核心，因此，多聚体蛋白可为这些疾病提供改进的疗法。

在一个实施方案中，通过用天冬氨酸残基取代位置238上的脯氨酸残基(P238D)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置258上的谷氨酸残基(E258A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基(S267A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用Fc结构域谷氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基(S267E)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用苯丙氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(L328F)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置258上的谷氨酸残基和用丙氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基(E258A/S267A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用谷氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基和用苯丙氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(S267E/L328F)来突变Fc结构域。

应当理解的是，可组合上文所列的任何突变来增强FcγRIIb结合。

在本发明的一个实施方案中，我们提供了展示减弱的对FcγR的结合的多聚体蛋白。减弱的对FcγR的结合可提供改进的疗法来用于治疗涉及致病性抗体的免疫性疾病。

在一个实施方案中，本发明的多聚体蛋白包含减弱其对FcγR的结合的一个或多个突变。

在一个实施方案中，将减弱对FcγR的结合的突变用包含来源于的IgG1的Fc结构域的本发明的多聚体蛋白。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置234上的亮氨酸残基(L234A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L235A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用精氨酸残基取代位置236上的甘氨酸残基(G236R)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297上的天冬酰胺残基来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置298上的丝氨酸残基(S298A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用精氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(L328R)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置234上的亮氨酸残基和用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L234A/L235A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置234上的苯丙氨酸残基和用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(F234A/L235A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用精氨酸残基取代位置236上的甘氨酸残基和用精氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(G236R/L328R)来突变Fc结构域。

应当理解的是，可组合上文所列的任何突变以减弱FcγR结合。

在一个实施方案中，本发明的多聚体蛋白包含减弱其对FcγRIIIa的结合而不影响其对FcγRII的结合的一个或多个突变。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置239上的丝氨酸残基(S239A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置269上的谷氨酸残基(E269A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置293上的谷氨酸残基(E293A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用苯丙氨酸残基取代位置296上的酪氨酸残基(Y296F)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置303上的缬氨酸残基(V303A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用甘氨酸残基取代位置327上的丙氨酸残基(A327G)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置338上的赖氨酸残基(K338A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置376上的天冬氨酸残基(D376A)来突变Fc结构域。

应当理解的是，可组合上文所列的任何突变以减弱FcγRIIIa结合。

本发明的多聚体蛋白可包含改变其对补体的结合的一个或多个突变。改变的补体结合可以是增强的结合或减弱的结合。

在一个实施方案中，所述蛋白包含减弱其对C1q的结合的一个或多个突变。经典补体途径的引发始于六聚体C1q蛋白对抗原结合的IgG和IgM的CH2结构域的结合。本发明的多聚体蛋白不具有抗原结合位点，从而预期不显示显著的对C1q的结合。然而，减弱C1q结合的一个或多个突变的存在将确保它们在抗原啮合不存在的情况下不激活补体，从而提供具有更高安全性的改进的疗法。

因此，在一个实施方案中，本发明的多聚体蛋白包含减弱其对C1q结合的一个或多个突变。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置234上的亮氨酸残基(L234A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L235A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用谷氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L235E)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置237上的甘氨酸残基(G237A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置322上的赖氨酸残基(K322A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基取代位置331上的脯氨酸残基(P331A)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过用丝氨酸残基取代位置331上的脯氨酸残基(P331S)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，多聚体蛋白包含来源于IgG4的Fc结构域。IgG4具有比IgG1天然更低的补体活化特征谱，而且还具有更弱的FcγR的结合。因此，在一个实施方案中，包含IgG4的多聚体蛋白还包含增强FcγR结合的一个或多个突变。

应当理解的是，可组合上文所列的任何突变以减少C1q结合。

本发明的抗体Fc结构域包含一个或多个突变来产生和/或去除半胱氨酸残基。半胱氨酸残基通过在单个多肽单体单元对之间形成二硫桥而在多聚体蛋白的自发组装中具有重要作用。因此，通过改变半胱氨酸残基的数目和/或位置，有可能修饰多聚体蛋白的结构以产生具有改进的治疗性性质的蛋白质。

本发明的多聚体蛋白在位置309上包含半胱氨酸残基。在一个实施方案中，位置309上的半胱氨酸残基通过突变产生，例如对于来源于IgG1的Fc结构域，用半胱氨酸残基取代位置309上的亮氨酸残基(L309C)；对于来源于IgG2的Fc结构域，用半胱氨酸残基取代位置309上的缬氨酸残基(V309C)。

在一个实施方案中，通过用半胱氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308C)来突变Fc结构域。

在一个实施方案中，通过将核心铰链序列CPPC突变成SPPS来去除铰链区中的两个二硫键。

在本发明的一个实施方案中，我们提供了包含较少糖基化位点的具有改进的可制造性的多聚体蛋白。这些蛋白具有不太复杂的翻译后糖基化模式，因此对于制造来说较简单并且不太昂贵。

在一个实施方案中，通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297上的天冬酰胺残基来去除CH2结构域中的糖基化位点。除了改进的可制造性以外，这些无糖基突变体还减少如上文中所描述的FcγR结合。

应当理解的是，可组合上文所列的任何突变。

本发明还提供了编码本发明的多肽单体单元的多肽链或其组成部分的分离的DNA序列。DNA序列可包含合成DNA(例如通过化学加工产生的)、cDNA、基因组DNA或其任意组合。

编码本发明的多肽单体单元的多肽链的DNA序列可通过本领域技术人员众所周知的方法获得。例如，可按需要从确定的DNA序列或基于对应的氨基酸序列合成编码多肽单体单元的多肽链的部分或全部的DNA序列。

可将分子生物学的标准技术用于制备编码本发明的多肽单体单元的多肽链的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成所需DNA序列。可适当地使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。

本发明还涉及包含本发明的一个或多个DNA序列的克隆性或表达载体。因此，提供了包含一个或多个编码本发明的多肽单体单元的多肽链或其组成部分的DNA序列的克隆性或表达载体。

籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。在这方面，参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York和由Cold Spring Harbor Publishing出版的Maniatis Manual。

还提供了包含一种或多种克隆性或表达载体的宿主细胞，所述载体包含一个或多个编码本发明的多聚体蛋白的DNA序列。任何合适的宿主细胞/载体系统可用于表达编码本发明的多聚体蛋白的DNA序列。可使用细菌，例如大肠杆菌(E.coli)和其它微生物系统诸如酵母菌属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)，或还可使用真核生物例如哺乳动物宿主细胞表达系统。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞。用于本发明的合适类型的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)包括CHO和CHO-K1细胞，包括dhfr-CHO细胞，诸如CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞(可将其与DHFR选择标记一起使用)或CHOK1-SV细胞(可将其与谷氨酰胺合成酶选择标记一起使用)。其它合适的宿主细胞包括NSO细胞和HEK细胞。

本发明还提供了用于产生根据本发明的多聚体蛋白的方法，其包括在适合于所述蛋白表达并组装成多聚体的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞，以及分离和任选地纯化所述多聚体蛋白。

以良好的水平从宿主细胞表达本发明的多聚体蛋白。因此多聚体蛋白的性质有益于商业加工。

本发明的多聚体蛋白可使用任何适当的方法来制备。在一个实施方案中，可在使聚集降至最低的条件下产生本发明的多聚体融合蛋白。在一个实例中，可通过向培养基、培养上清液或纯化介质中添加防腐剂来使聚集降至最低。合适的防腐剂的实例包括硫醇封端剂，诸如N-乙基马来酰亚胺、碘乙酸、β-巯基乙醇、β-巯基乙胺、谷胱甘肽或半胱氨酸。其它实例包括二硫化物抑制剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)或低于pH6.0的酸化。

在一个实施方案中，提供了用于纯化本发明的多聚体蛋白的方法，所述方法包括步骤：以非结合模式进行阴离子交换层析，以使得杂质保留在柱子上，并且多聚体蛋白被洗脱。

在一个实施方案中，纯化采用在FcRn、FcγR或C反应蛋白柱上的亲和捕获。

在一个实施方案中，纯化采用蛋白A。

用于所述方法的合适的离子交换树脂包括Q.FF树脂(由GE-Healthcare提供)。可以例如在约8的pH下进行所述步骤。

所述方法还可包括例如在约4至5(诸如4.5)的pH下进行的应用阳离子交换层析的初始捕获步骤。所述阳离子交换层析可以例如应用树脂诸如CaptoS树脂或SP sepharose FF(由GE-Healthcare提供)。随后可应用离子盐溶液诸如氯化钠(例如以200mM的浓度)从树脂洗脱多聚体蛋白。

适当时，层析步骤可包括一个或多个洗涤步骤。

纯化方法还可包括一个或多个过滤步骤，诸如渗滤步骤。

可按照分子大小，例如通过大小排阻层析分离具有所需数目的多肽单体单元的多聚体。

因此，在一个实施方案中，以基本上纯化的形式(特别地不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白质或DNA)提供纯化的根据本发明的多聚体蛋白。

如上文中所用的纯化的形式旨在指至少90％的纯度，诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％w/w或更纯。

基本上不含内毒素通常旨在指1EU/mg抗体产物或更少诸如0.5或0.1EU/mg产物的内毒素含量。

基本上不含宿主细胞蛋白或DNA通常旨在指适当时400μg/mg蛋白质产物或更少诸如100μg/mg或更少，具体地20μg/mg的宿主细胞蛋白质和/或DNA含量。

由于本发明的多聚体蛋白在治疗和/或预防病理病况中是有用的，因此本发明还提供了包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或多种组合的本发明的多聚体蛋白的药物或诊断组合物。因此，提供了本发明的蛋白用于制造药剂的用途。通常将组合物作为通常包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分来提供。本发明的药物组合物可额外地包含药学上可接受的赋形剂。

本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法，所述方法包括添加本发明的多聚体蛋白和将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或多种混合在一起。

所述多聚体蛋白可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分，或可伴有其它活性成分，包括其它抗体成分或非抗体成分诸如甾类或其它药物分子。

药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的多聚体蛋白。如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗、缓解或预防被靶向的疾病或病况，或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何药剂，最初可在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)评估治疗有效量。还可将动物模型用于确定施用的适当的浓度范围和途径。随后将此信息用于确定用于在人中施用的有用剂量和途径。

用于人受试者的精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重度、受试者的一般健康状况、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、对疗法的反应敏感性和耐受性/应答。可通过常规实验来测定该量，并且该量在临床医生的判断之内。一般地，治疗有效量为0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，诸如100mg/kg。可以方便地以每剂量含有预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式提供药物组合物。

根据本公开的多聚体蛋白的治疗剂量在体内未显示明显的毒理学效应。

在根据本发明的多聚体蛋白的一个实施方案中，单个剂量可提供高达90％的循环IgG水平的降低。

可单独地向患者施用组合物，或可将所述组合物与其它试剂、药物或激素组合(例如同时地、相继地或分开地)施用。

在一个实施方案中，将根据本公开的多聚体蛋白与免疫抑制剂疗法诸如甾类(具体地泼尼松)一起使用。

在一个实施方案中，将根据本公开的多聚体蛋白与利妥昔单抗或其它B细胞疗法一起使用。

在一个实施方案中，将根据本公开的多聚体蛋白与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起使用。实例包括氨甲蝶呤、霉酚酸酯和硫唑嘌呤。

施用本发明的多聚体蛋白的剂量取决于待治疗的病况的性质、现有疾病的程度以及取决于多聚体蛋白是被预防性使用还是用于治疗现有病况。

剂量的频率将取决于多聚体蛋白的半寿期和其效应的持续时间。如果多聚体蛋白具有短的半寿期(例如2至10小时)，则可能必需提供每日一个或多个剂量。或者，如果多聚体蛋白长的半寿期(例如2至15天)和/或长效药效学效应，则可只需提供每日一次、每周一次或甚至每1或2个月一次的剂量。

在一个实施方案中，每两周一次即每月2次递送剂量。

如本文使用的半寿期指分子在循环中例如血清/血浆中的持续时间。

如本文所用的药效学是指根据本公开的多聚体蛋白的生物学作用的特征谱和具体地持续时间。

药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生并且应当是无毒的。合适的载体可以是大的缓慢代谢的大分子诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。可使用药学上可接受的盐，例如无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐，或有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。

治疗组合物中的药学上可接受的载体可额外地含有液体，诸如水、盐水、甘油和乙醇。此外，辅助性物质，诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质，可以存在于此类组合物中。此类载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以用于被患者摄取。

用于施用的合适形式包括适于肠胃外(例如通过注射或输注,例如通过快速团注或连续输注)施用的形式。当该产品用于注射或输注时，其可采用油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且其可含有配制剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。蛋白可以以纳米颗粒的形式存在。或者，抗体分子可以干燥形式存在，用于在使用前利用适当的无菌液体重构。

一旦配制，就可向受试者直接施用本发明的组合物。待治疗的受试者可以是动物。然而，在一个或多个实施方案中，所述组合物适用于向人受试者施用。

适当地在根据本公开的制剂中，最终制剂的pH与多聚体蛋白的等电点的值不相似，例如，如果该蛋白的pI在8-9的范围内或高于该范围，则pH值为7的制剂可以是合适的。尽管不希望受理论束缚，但据认为这可最终提供具有改善的稳定性的最终制剂，例如多聚体蛋白质保持在溶液中。

在一个实例中，在4.0至7.0的范围内的pH下的药物制剂包含：1至200mg/mL的根据本公开的蛋白质分子、1至100mM的缓冲液、0.001至1％的表面活性剂、a)10至500mM的稳定剂，b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张度剂或c)5至500mM的张度剂。

本发明的药物组合物可以通过许多途径施用，包括、但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如，参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、阴道内或经直肠途径。还可将喷射注射器用于施用本发明的药物组合物。通常，可将药物组合物制备为可注射剂，制备为液体溶液或悬浮液。也可制备适合用于液体介质中的溶液或悬浮液的固体形式(在注射之前)。

所述组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来实现，或其被递送至组织的间隙空间。还可将组合物施用至病灶中。剂量治疗可以是单次剂量方案或多次剂量方案。

应当理解的是，所述组合物中的活性成分将是蛋白质分子。这样，其在胃肠道中会易于降解。因此，如果将通过使用胃肠道的途径施用所述组合物，则所述组合物将需要含有保护蛋白质免受降解但在其已被从胃肠道吸收后释放所述蛋白质的药剂。

药学上可接受的载体的详尽论述可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。在一个实施方案中，可将制剂提供为用于局部施用(包括吸入)的制剂。

合适的可吸入制剂包括可吸入粉剂、含喷射剂气体的计量气溶胶或不含喷射剂气体的可吸入溶液。根据本公开的含有活性物质的可吸入粉剂可纯粹由上述活性物质组成或由上述活性物质与可生理上可接受的赋形剂的混合物组成。这些可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些的互相之间的混合物。适当地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，所述糖特别地但不唯一地以其水合物的形式存在。

用于肺中的组合物的颗粒需要小于10微米的粒度，诸如1-9微米，例如1至5μm。活性成分(诸如抗体或片段)的粒度是最重要的。

可用于制备可吸入气溶胶的喷射剂气体在本领域中是众所周知的。合适的喷射剂气体选自烃，诸如正丙烷、正丁烷或异丁烷，和卤代烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯代或氟代衍生物。可单独使用上述喷射剂气体本身或以其混合物使用上述喷射剂气体。

特别合适的喷射剂气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。

含喷射剂气体的可吸入气溶胶还可含有其它成分如助溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活化剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的手段(means)。所有这些成分在本领域中是已知的。

根据本发明的含喷射剂气体的可吸入气溶胶可含有按重量计至多5％的活性物质。根据本发明的气溶胶含有例如按重量计0.002％至5％、按重量计0.01％至3％、按重量计0.015％至2％、按重量计0.1％至2％、按重量计0.5％至2％或按重量计0.5％至1％的活性成分。

或者，还可通过施用液体溶液或悬浮制剂，例如使用装置诸如雾化器，例如连接至压缩机的雾化器(例如，连接至由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)来进行至肺的局部施用。

可将本发明的蛋白质分散在溶剂中(例如以溶液或悬浮液的形式)来进行递送。可将其悬浮于适当的生理溶液，例如盐水或其它药理学可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域中已知的缓冲溶液可含有每1ml水0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸以及0.45mg至0.55mg柠檬酸钠，以获得约4.0至5.0的pH。悬浮液可使用例如冻干的蛋白质。

治疗性悬浮剂或溶液制剂还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域中是众所周知的，包括缓冲剂(例如，柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。可将溶液或悬浮液包封在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌生产方法以基本上无菌的形式提供该制剂。

这可包括生产和用于制剂的经缓冲的溶剂/溶液的过滤灭菌、蛋白质在无菌经缓冲的溶剂溶液中的无菌悬浮，以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配至无菌容器中。

可将根据本公开的可雾化制剂例如作为包装在箔包膜中的单一剂量单位(例如，密封的塑料容器或小瓶)来提供。每一个小瓶在例如2ml的溶剂/溶液缓冲液的体积中包含单位剂量。

本文中公开的多聚体蛋白可适用于通过喷雾进行的递送。

还设想可通过使用基因疗法来施用本发明的蛋白质。为了实现该目的，将在适当的DNA组件控制下的编码所述蛋白质分子的多肽链的DNA序列引入患者，以使得所述多肽链从所述DNA序列表达并原位组装。

在一个实施方案中，我们提供了用于治疗的本发明的多聚体蛋白。

在一个实施方案中，我们提供了用于治疗免疫性病症的本发明的多聚体蛋白。

在一个实施方案中，我们提供了用于治疗癌症的本发明的多聚体蛋白。

在一个实施方案中，我们提供了用作疫苗的本发明的多聚体蛋白。

在一个实施方案中，我们提供了本发明的多聚体蛋白用于制备用于治疗免疫性病症的药剂的用途。

在一个实施方案中，我们提供了本发明的多聚体蛋白用于制备用于治疗癌症的药剂的用途。

在一个实施方案中，我们提供了本发明的多聚体蛋白用于制备疫苗的用途。

可使用本发明的多聚体蛋白治疗的免疫性病症的实例包括免疫性血小板减少症(ITP)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、川崎病和Guillain-Barré综合征(GBS)。

本发明还提供了用于控制自身免疫性疾病的多聚体蛋白(或包含其的组合物)，所述疾病是例如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生病、丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、ANCA相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性性贫血、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突&纳尔神经病变、巴洛病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩病、Cogans综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、扩张型心肌病、盘状红斑狼疮、心肌梗死后综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性血管中心纤维化、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维化肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、多血管炎肉芽肿肉芽肿病(GPA)(见Wegener's)、格雷夫斯病、Guillain-Barre综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性血补体过少小管间质性肾炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关疾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节脂蛋白、炎症性主动脉瘤、炎性假瘤、包涵体肌炎、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病、川崎综合征、Kuttner’s瘤、Lambert-Eaton综合征、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、红斑狼疮(SLE)、莱姆病、慢性纵隔纤维化病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎(Microscopic polyangiitis)、米库利兹综合征、混合型结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren’s ulcer)、Mucha-Habermann病、多灶性纤维硬化、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic's)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、Ormond’s病(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症多神经病(Paraproteinemic polyneuropathies)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、寻常型天疱疮、主动脉周围炎、动脉周围炎、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型&III型自身免疫性多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕激素性皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯红细胞再生障碍、雷诺现象、反射性交感神经营养不良、Reiter’s综合征、复发性多软骨病、下肢不宁综合征、腹膜后纤维化(Ormond’s病)、风湿热、类风湿关节炎、慢性纤维性甲状腺炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征、精子与睾丸自身免疫、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac’s综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风、Waldenstrom巨球蛋白血症、暖特发性溶血性贫血和韦格纳肉芽肿(现称为具有多血管炎肉芽肿(GPA)。

在一个实施方案中，将根据本公开的多聚体蛋白和片段用于治疗或预防癫痫或惊厥。

在一个实施方案中，将根据本公开的多聚体蛋白和片段用于治疗或预防多发性硬化。

在实施方案中，将本公开的多聚体蛋白和片段用于同种免疫性疾病/适应症，所述疾病包括：

·因抗HLA抗体而引起的移植供体不匹配

·胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症，FNAIT(或新生儿同种免疫性血小板减少症，NAITP或NAIT或NAT，或胎儿-母体同种免疫性血小板减少症，FMAITP或FMAIT)。

另外的适应症包括：含Fc的生物药剂学药物从人患者的快速清除，以及多聚体蛋白疗法与其它疗法–IVIg、Rituxan、血浆置换术的组合。例如，可在Rituxan疗法后使用多聚体蛋白疗法。

在实施方案中，将本公开的抗体和片段用于神经病学病症诸如：

·慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)

·Guillain-Barré综合征

·副蛋白血症多发性神经病

·视神经脊髓炎(NMO,NMO谱系病症或NMO谱系疾病)，和

·重症肌无力。

在实施方案中，将本公开的抗体和片段用于皮肤病症诸如：

·大疱性类天疱疮

·寻常型天疱疮

·ANCA相关血管炎

·扩张型心肌病

在一个实施方案中，将本公开的蛋白用于免疫学或血液病学病症诸如：

·特发性血小板减少性紫癜(ITP)

·血栓性血小板减少性紫癜(TTP)

·暖特发性溶血性贫血

·肺出血肾炎综合征

·因抗HLA抗体而引起的移植供体不匹配

在一个实施方案中，所述病症选自重症肌无力、视神经脊髓炎(Neuro-myelitis Optica)、CIDP、Guillaume-Barre综合征、副蛋白血症多发性神经病、难治性癫痫、ITP/TTP、溶血性贫血、肺出血肾炎综合征、ABO不匹配、狼疮性肾炎、肾血管炎、硬皮病、纤维化肺泡炎、扩张型心肌病、格雷夫斯病、1型糖尿病、自身免疫性糖尿病、天疱疮、硬皮病、红斑狼疮、ANCA血管炎、皮肌炎、舍格伦综合征(Sjogren’s Disease)和类风湿关节炎。

在一个实施方案中，所述病症选自自身免疫性多内分泌腺病综合征1型(APECED或Whitaker’s综合征)和2型(施密特综合征)；普秃；重症肌无力危象；甲状腺危象；甲状腺相关性眼病；甲状腺眼病；自身免疫性糖尿病；自身抗体相关性脑炎和/或脑病；落叶型天疱疮；大疱性表皮松解；疱疹样皮炎；Sydenham’s舞蹈症；急性运动性轴突神经病(AMAN)；米-费综合征；多灶性运动神经病(MMN)；斜视性眼阵挛；炎症性肌病；艾萨克综合征(自身免疫性神经性肌强直)、副肿瘤综合征和边缘系统脑炎。

可使用本发明的多聚体蛋白治疗的癌症的实例包括结肠直肠癌、肝瘤(肝癌)、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌或肺癌。

在一个实施方案中，所述癌症是皮肤癌，诸如黑色素瘤。在一个实施方案中，所述癌症是白血病。在一个实施方案中，所述癌症是胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤或神经母细胞瘤。在一个实施方案中，所述癌症是神经内分泌癌。在一个实施方案中，所述癌症是何杰金氏或非何杰金氏淋巴瘤。

可将根据本发明的多聚体蛋白用于治疗或预防。

本发明还提供了降低个体中不期望的抗体的浓度的方法，其包括向个体施用治疗有效剂量的本文所述的多聚体蛋白的步骤。

本发明的多聚体蛋白还可用于诊断，例如用于涉及Fc受体的疾病状态诸如B细胞相关淋巴瘤的体内诊断和成像。

图例

图1：多肽单体单元的多肽链的示例性氨基酸序列。在每一个序列中，突变以粗体显示并加以下划线。任选的铰链区加以下划线。在包含来自IgM的CH4结构域的构建体中，该区域以斜体显示。

图2：在G3000大小排阻HPLC后，针对在CHO细胞中瞬时表达的IgG1-Fc-L309C获得的纯化级分的重叠(overlay)。结果表明蛋白质组装成具有一系列数目的单体单元的多聚体。该图显示单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和高于五聚体的多聚体形式的存在。

M＝单体

Di＝二聚体

Tri＝三聚体

Tet＝四聚体

Pent+＝五聚体和高于五聚体的多聚体

图3：多聚体蛋白对由人巨噬细胞进行的对B细胞的抗体依赖性吞噬的作用。结果表明，多聚体蛋白抑制巨噬细胞的吞噬作用。数据显示明确的递增的效价(即具有递增数目的单体的多聚体)与递增的效力之间的正相关性。通过多聚体实现的抑制的效力和最高水平显著好于人IVIG。

图4：多聚体蛋白刺激细胞因子释放。

实施例

实施例1:分子生物学

使用标准生物学方法，包括PCR、限制性连接克隆、点诱变(Quikchange)和Sanger测序。将表达构建体克隆入适合用于在CHO细胞中瞬时和稳定表达的表达载体。合适的表达载体的实例是pCDNA3(Invitrogen)。

合成序列的从头设计

DNA序列被设计来含有侧接限制性位点HindIII和EcoRI、Kozak序列、信号肽和目标基因。通过DNA 2.0合成序列。

限制性酶克隆

使用限制性酶HindIII和EcoRI将合成的DNA序列亚克隆入表达载体。

诱变

通过定点诱变将突变引入Fc片段。寡核苷酸(oligo’s)被设计来包含所需突变并且购自Sigma。使用Agilent Quikchange Lightning诱变试剂盒设置PCR反应来取代氨基酸。

在图1中提供了显示多肽单体单元的多肽链的示例性氨基酸序列的图。在每一个序列中，突变以粗体显示并加以下划线。任选的铰链区加以下划线。在包含来自IgM的CH4结构域的构建体中，该区域以斜体显示。

实施例2:表达

使用利用lipofectamine或电穿孔转染的HEK293或CHO细胞的‘瞬时’表达进行小规模的表达。以范围在50-2000ml的规模将培养物在摇瓶或搅动袋中于CD-CHO(Lonza)或ProCHO5(Life Technologies)培养基中生长5至10天。通过离心除去细胞，将培养上清于4℃下贮存直至纯化。在除去细胞后，将防腐剂添加至一些培养物中。

结果表明多聚体蛋白得到良好表达。

实施例3:纯化和分析

在确认/调整pH为≥6.5后，通过蛋白A层析和使用pH3.4缓冲液的梯度洗脱从培养上清纯化Fc多聚体。立即使用1M Tris pH8.5将洗脱物中和至～pH7.0，随后于4℃贮存。使用S200柱子和级分收集将分析大小排阻层析用于分离Fc结构域的各种多聚体形式。分析级分，并在G3000HPLC以及还原和非还原SDS-PAGE分析后混合所述组分。使用鲎试验(LAL)测定测试内毒素，并且用于测定的样品<1EU/mg。

在防腐剂存在的情况下纯化多聚体蛋白减小了聚集的倾向性，从而产生结构更均一的改良制剂。经显示为有效防腐剂的实例包括硫醇封端剂诸如N-乙基马来酰亚胺(NEM)和谷胱甘肽(GSH)；和二硫化物抑制剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)。

图2显示在G3000大小排阻HPLC后针对于CHO细胞中瞬时表达的IgG1-Fc-L309C获得的纯化级分的重叠。结果表明所述蛋白质组装成具有一系列数目的单体单元的多聚体。该图显示单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和高于五聚体的多聚体形式的存在。

实施例4:B细胞靶的巨噬细胞吞噬作用

设计测定来测量人巨噬细胞对B细胞的抗体依赖性吞噬作用。为了制备巨噬细胞，首先通过密度梯度离心从新鲜血液分离人外周血单核细胞(PBMC)。然后通过将PBMC在6孔组织培养物包被的板中于37℃温育1小时来选择单核细胞，随后除去非贴壁细胞。通过在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)中培养5天来将贴壁单核细胞分化成巨噬细胞。随后通过分离PBMC从分开的(同种异体的)供体制备人B细胞，然后使用MACS(B细胞分离试剂盒II,Miltenyi Biotech)通过阴性选择来纯化B细胞。在一些测定中，利用羧基琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Molecular Probes)标记B细胞。在抗CD20mAb(利妥昔单抗)存在的情况下，以1:5的比率共培养分化的巨噬细胞和B细胞以诱导B细胞的抗体依赖性吞噬作用。以指定的浓度添加多聚体融合蛋白或对照，并将细胞在37℃5％CO₂下温育1-24小时。在每一个时间点结束时，将细胞离心，并在4℃重悬浮于FACS缓冲液中，以终止进一步吞噬作用，并用抗CD19别藻蓝蛋白(APC)对B细胞表面染色，随后通过流式细胞术进行分析。巨噬细胞可通过它们的自发荧光/侧向散射特性相区分，B细胞通过它们的CFSE/CD19标记相区分。对于CD19标记呈阴性的CFSE阳性巨噬细胞被假定含有被吞噬的B细胞。

图3显示多聚体蛋白抑制人巨噬细胞对B细胞的抗体依赖性吞噬。数据显示明确的递增的效价(即，具有递增数目的单体的多聚体)与递增效力之间的正相关性。通过多聚体实现的抑制的效力和最高水平显著好于人IVIG。

使用CFSE染色的B细胞的流式细胞术分析确认作用机制是抑制巨噬细胞的吞噬作用，而非通过其它方式进行的B细胞杀伤或细胞凋亡。

实施例5:人全血细胞因子释放测定

从供体采集新鲜血液于锂肝素真空采血管(vacutainer)中。将目标Fc多聚体构建体或对照于无菌PBS中连续稀释至指定的浓度。将12.5μl的Fc多聚体或对照添加至测定板，随后添加237.5μl的全血。将板在37℃无CO₂补充下温育24小时。将板以1800rpm离心5分钟，并取出血清以进行细胞因子分析。按照制造商的操作方案通过Meso Scale Discovery cytokine multiplex进行细胞因子分析，并在Sector Imager 600上进行读取。

结果示于图4中。数据显示了多聚体蛋白中的单体单元的数目与释放的细胞因子水平之间的正相关性。通过本发明的四聚体和更高级多聚体产生的细胞因子水平与通过纯化的六聚IgG1Fc/IgM尾部产生的细胞因子水平相似。