结合HER3β‑发夹和HER2域II的HER3/HER2双特异性抗体的制作方法

发明背景HER蛋白质家族由4个成员组成：HER1，也称作表皮生长因子受体(EGFR)或ErbB-1；HER2，也称作ErbB-2；ErbB-3，也称作HER3；和ErbB-4，也称作HER4。ErbB家族蛋白质是受体酪氨酸激酶且代表细胞生长、分化和存活的重要介导物。HER家族代表不同配体(像神经调蛋白(NRG)家族、双调蛋白、EGF和TGF-a)的受体蛋白质。调蛋白(也称作HRG或神经调蛋白NRG-1)是例如HER3和HER4的配体。人HER3(ErbB-3，ERBB3，c-erbB-3，c-erbB3，受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-3，SEQIDNO:3)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的一个成员，该家族还包括HER1(也称作EGFR)、HER2、和HER4(Kraus,M.H.etal.,PNAS86:9193-9197(1989)；Plowman,G.D.etal.,PNAS87:4905-4909(1990)；Kraus,M.H.etal.,PNAS90:2900-2904(1993))。就像原型表皮生长因子受体，跨膜受体HER3由胞外配体结合域(ECD)、ECD内的二聚化域、跨膜域、胞内蛋白质酪氨酸激酶域(TKD)和C端磷酸化域组成。这种膜结合蛋白质具有在胞外域内的调蛋白(HRG)结合域，但是没有活性激酶域。因此，它能结合这种配体但没有经由蛋白质磷酸化将信号传递入细胞。然而，它确实与确实具有激酶活性的其它HER家族成员形成异二聚体。异二聚化导致受体介导的信号传导途径激活及其胞内域转磷酸化。HER家族成员之间的二聚体形成扩充HER3的信号传导潜力，而且不仅是信号多样化的手段而且是信号放大的手段。例如，HER2/HER3异二聚体经PI3K和AKT途径诱导HER家族成员中最重要的促有丝分裂信号之一(Sliwkowski,M.X.etal.,J.Biol.Chem.269:14661-14665(1994)；Alimandi,M.etal.,Oncogene.10:1813-1821(1995)；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276:42153-4261(2001)；Singer,E.,J.Biol.Chem.276:44266-44274(2001)；Schaefer,K.L.,Neoplasia8:613-622(2006))。关于HER3及其在HER受体家族和NGR配体家族内的各种相互作用的概述参见例如Sithanandam,G.etal.,CancerGeneTherapy15:413-448(2008)。已经在众多癌症中报告了这种基因的扩增和/或其蛋白质的过表达，包括前列腺、膀胱、和乳腺肿瘤。已经表征了编码不同同等型的可变转录剪接变体。一种同等型缺乏膜间区且分泌到细胞外。这种形式起调控膜结合形式的活性的作用。另外的剪接变体也已有报告，但是它们尚未彻底表征。有趣的是，在其平衡状态，HER3受体以其“闭合构象”存在，这确实意味着HER3β-发夹基序的异二聚化经非共价相互作用系留至HER3ECD域IV(见图1c和1d)。假定“闭合”HER3构象能经配体调蛋白在特定HER3调蛋白结合位点处的结合而开放。这发生于由HER3ECD域I和域III形成的HER3界面。通过这种相互作用，认为HER3受体活化并转变成它的“开放构象”(见图1e和1b和例如Baselga,J.etal.,Nat.Rev.Cancer9:463-475(2009)和Desbois-Mouthon,C.etal.,GastroenterolClinBiol34:255-259(2010))。在这种开放构象中，与HER2的异二聚化和转信号诱导是可能的(见图1b)。WO2003/013602涉及HER活性的抑制剂，包括HER抗体。WO2007/077028和WO2008/100624也涉及HER3抗体。WO97/35885和WO2010/127181涉及HER3抗体。人HER4(也称作ErbB-4、ERBB4、v-erb-a、成红细胞白血病病毒癌基因同系物4、p180erbB4、鸟类成红细胞白血病病毒(v-erb-b2)癌基因同系物4；SEQIDNO:5)是I型单次跨膜蛋白质，具有多个弗林蛋白酶样富含半胱氨酸域、酪氨酸激酶域、磷脂酰肌醇-3激酶结合位点和PDZ域结合基序(Plowman,G.D.etal.,PNAS90:1746-50(1993)；Zimonjic,D.B.etal.,Oncogene10:1235-7(1995)；Culouscou,J.M.etal.,J.Biol.Chem.268:18407-10(1993))。该蛋白质结合神经调蛋白-2和-3、肝素结合性EGF样生长因子和β细胞素并被它们活化。配体结合诱导多种细胞应答，包括有丝分裂和分化。多种蛋白水解事件容许胞质片段和胞外片段释放。已经将这种基因中的突变与癌症关联起来。编码不同蛋白质同等型的可变剪接变体已有记载；然而，并非所有变体均已完全表征。用于抗癌疗法的抗HER4抗体是已知的，例如来自US5,811,098，US7,332,579或Hollmén,M.etal.,Oncogene.28:1309-19(2009)(抗ErbB-4抗体mAb1479)。至今不可能选择特异性结合HER3β-发夹(和/或HER4β-发夹)的抗体，因为这些HER3(或HER4)β-发夹均呈递隐藏的表位，在这些受体处于平衡状态时不可及(见图1)。人HER2是一种跨膜的表面结合的受体酪氨酸激酶，而且正常情况下牵涉导致细胞生长和分化的信号转导途径。HER2是乳腺癌治疗的一种有希望的靶物，因为发现它在约四分之一的乳腺癌患者中过表达(Bangeetal.,2001,NatureMedicine7:548)。癌基因HER2及这种受体的过表达或突变导致它的组成性活化。这驱动多种癌症的形成，像乳腺癌，口腔癌，胰腺癌和肺癌(Schneideretal.,1989；Weineretal.,1990；Houetal.,1992；Revillionetal.,1998)。HER2是HER家族中不像HER1，HER3和HER4那样以系留构象表达的唯一受体。而是，它以开放，伸展构象在细胞表面上表达。在这种构象中，亚域II的β-发夹是可及的。抗体帕妥珠单抗(Pertuzumab，)显示出紧靠着结合HER2胞外域(ECD)β-发夹和亚域II中的周围区域。β-发夹对于与其它HER受体形成二聚体是至关重要的。通过结合这一表位，帕妥珠单抗能够抑制二聚体形成和因此后续信号传导级联的激活。HER2/HER3异二聚体经PI3K和AKT途径诱导HER家族成员中最重要的促有丝分裂信号之一(Sliwkowski,M.X.etal.,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi,M.etal.,Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia8(2006)613-622)。尤其，HRG1β诱导的HER2/HER3异二聚体的形成在具有自分泌HRG环的癌症中发挥关键作用(Gollamudietal.,2004)。另外，当前临床研究的结果指示抗HER2抗体治疗的成就在HRG1β存在下降低(McDonaghetal.,2012)。帕妥珠单抗(rhuMab2C4，美国专利No.7,862,817，以例如PERJETATM销售)是一种人源化单克隆抗体，其特异性设计成阻止HER2受体与细胞表面上的其它HER受体(EGFR/HER1，HER3和HER4)配对(二聚化)，认为该过程在肿瘤生长和存活中发挥作用。帕妥珠单抗结合对二聚化至关重要的HER2域II。帕妥珠单抗特异性结合2C4表位，HER2胞外域上一种与曲妥单抗不同的表位。帕妥珠单抗是HER二聚化抑制剂(HDI)的一个新类别中的第一个。经由其对HER2胞外域的结合，帕妥珠单抗阻断配体活化的HER2与其它HER家族成员的异二聚化，由此抑制与肿瘤生长和进展有关的下游信号传导途径和细胞过程(Franklin,M.C.etal.,CancerCell5(2004)317-328和Friess,T.etal.,ClinCancerRes11(2005)5300-5309)。帕妥珠单抗是鼠抗HER2抗体2C4的一种重组人源化型式(称作rhuMAb2C4或帕妥珠单抗)，而且它与相应制备方法一起记载于WO01/00245和WO2006/007398。发明概述本发明涉及结合人HER3β-发夹(SEQIDNO:1)和人HER2域II(SEQIDNO:59)的双特异性抗体。这两个域负责相应HER受体的二聚化(同和/或异二聚化)。本发明提供在SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER3(和HER4)β-发夹(见例如图2，和SEQIDNO:13和17至24的多肽)用于获得HER3抗体或结合用于生成双特异性HER3/HER2抗体的用途。本发明提供a)至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQIDNO:1的多肽：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3(和，任选地b)至少一种选自下组的多肽：SEQIDNO:21TtSlyDcas-Her4，SEQIDNO:22TtSlyDcys-Her4，SEQIDNO:23TgSlyDser-Her4，和SEQIDNO:24TgSlyDcys-Her4)在选择用于生成双特异性HER3/HER2抗体的抗体，特别是结合人HER3(且结合人HER4)的抗体的方法中的用途，其中该抗体在人HER3的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合；且此类HER3抗体然后用于生成双特异性HER3/HER2抗体。本发明提供一种双特异性抗体，其结合人HER3且结合人HER2，其中该抗体在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3。本发明提供一种双特异性抗体，其结合人HER3且结合人HER2，其中该抗体在SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，该抗体结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且与帕妥珠单抗结合人HER2上相同表位。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，该抗体结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体与帕妥珠单抗结合人HER2上相同表位。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且与帕妥珠单抗竞争结合人HER2。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，该抗体结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体与帕妥珠单抗竞争结合人HER2。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2且包含帕妥珠单抗的所有六种重和轻链HVR(SEQIDNO:60，SEQIDNO:61，SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:64，和SEQIDNO:65)。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2且包含帕妥珠单抗的VH和VL(SEQIDNO:66和SEQIDNO:67)。一个实施方案是如上所述结合人HER3和人HER2的多特异性抗体，其还结合人HER4。在一个实施方案中，此类结合人HER3和人HER2的多特异性抗体还结合人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)。在一个实施方案中此类结合人HER3和人HER2的多特异性抗体还结合包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽。在一个实施方案中，此类双特异性HER3/HER2抗体不与人HER4交叉反应。在一个实施方案中，此类双特异性HER3/HER2抗体不与人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)交叉反应。在一个实施方案中，此类双特异性HER3/HER2抗体不与包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽交叉反应。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，a)其结合人HER3且包含下述重链HVR：SEQIDNO:25重链HVR-H1，M-05-74，SEQIDNO:26重链HVR-H2，M-05-74，和SEQIDNO:27重链HVR-H3，M-05-74，且包含下述轻链重链HVR：SEQIDNO:28轻链HVR-L1，M-05-74，SEQIDNO:29轻链HVR-L2，M-05-74，和SEQIDNO:30轻链HVR-L3，M-05-74；且b)其结合人HER2且包含下述重链HVR：SEQIDNO:60重链HVR-H1，帕妥珠单抗，SEQIDNO:61重链HVR-H2，帕妥珠单抗，SEQIDNO:62重链HVR-H3，帕妥珠单抗，且包含下述轻链重链HVR：SEQIDNO:63轻链HVR-L1，帕妥珠单抗，SEQIDNO:64轻链HVR-L2，帕妥珠单抗，和SEQIDNO:65轻链HVR-L3，帕妥珠单抗。本发明的一个实施方案是一种双特异性抗体，a)其结合人HER3且包含i)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:41的可变轻链域VL，ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:39的可变轻链域VL，或iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:42的可变轻链域VL；且b)其结合人HER2且包含具有氨基酸序列SEQIDNO:66的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的可变轻链域VL。在一个优选实施方案中，此类双特异性抗体是二价的。本发明进一步提供一种分离的核酸，其编码此类双特异性HER3/HER2抗体。本发明进一步提供一种宿主细胞，其包含此类核酸。本发明进一步提供一种生成此类抗体的方法，其包括培养此类宿主细胞使得该抗体生成。在一个实施方案中，此类方法进一步包括自该宿主细胞回收此类抗体。本发明进一步提供一种免疫缀合物，其包含此类双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂。本发明进一步提供一种药物配制剂，其包含此类双特异性HER3/HER2抗体和药学可接受载剂。本发明进一步提供本文中描述的双特异性HER3/HER2抗体，其用作药物。本发明进一步提供本文中描述的双特异性HER3/HER2抗体或包含该双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗癌症。本发明进一步提供本文中描述的双特异性HER3/HER2抗体，其用于抑制HER3/HER2二聚化和/或HER2/HER2二聚化。本发明进一步提供此类双特异性HER3/HER2抗体或包含该双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂的免疫缀合物在制造药物中的用途。本发明进一步提供此类用途，其中该药物用于治疗癌症。本发明进一步提供此类用途，其中该药物用于抑制HER3/HER2二聚化和/或HER2/HER2二聚化。本发明进一步提供一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的本文中描述的双特异性HER3/HER2抗体或包含该双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。本发明进一步提供一种在罹患癌症的个体中抑制肿瘤细胞生长的方法，其包括对该个体施用有效量的本文中描述的双特异性HER3/HER2抗体，由此在该个体中抑制肿瘤细胞生长。公开的是一种选自下组的多肽：i)SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，ii)SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，iii)SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，iv)SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和v)SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3，该多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:1。公开的是一种选自下组的多肽：i)SEQIDNO:21TtSlyDcas-Her4，ii)SEQIDNO:22TtSlyDcys-Her4，iii)SEQIDNO:23TgSlyDser-Her4，和iv)SEQIDNO:24TgSlyDcys-Her4，该多肽包含氨基酸序列SEQIDNO:2。使用在SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER3(和HER4)β-发夹(见例如图2，和SEQIDNO:13和17至24的多肽)能选择本文中描述的结合这些β-发夹的双特异性HER3/HER2抗体。发现了依照本发明的抗体可具有高价值的特性，诸如对表达HER3的癌细胞的强生长抑制，对HER3介导的涉及癌细胞增殖的信号转导(诸如例如HER3磷酸化)的强抑制，或非常特殊的药动学特性(诸如与在调蛋白缺失下(“闭合”构象)相比，在调蛋白存在下(“开放”构象)对活化的HER3的结合更快的结合速率和更高的摩尔比)。而且，它们显示强肿瘤生长抑制且能够有效抑制HER3/HER2二聚化和/或HER2/HER2二聚化。附图简述图1“闭合的”和“开放的”HER3构象的纵览示意图及神经调蛋白家族配体(像例如调蛋白，在此缩写为HR)对构象变化的影响。图2在嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER3β-发夹的3D结构。图3TtSlyD-FKBP-Her3的Ni-NTA纯化的SDS-PAGE分析。E1和E2显示已纯化的级分12和13。SN：纯化之前的大肠杆菌裂解物上清液。图4嗜热栖热菌SlyD-FKBP-Her3的Ni-NTA纯化级分的SEC洗脱图。图5选定克隆的IHC中的特异性和反应性的测试。所有三个克隆均显示结合HER3且与HER4交叉反应。检测不到针对HER1和HER2的交叉反应性。图6T47D细胞中由M-05-74抗体诱导的时间依赖性HER3内在化的FACS分析。图7Biacore传感图重叠图。1：100nMM-05-74*调蛋白/HER3ECD相互作用。2：100nMM-08-11*调蛋白/HER3ECD相互作用。3和4：100nMM-05-74和100nMM-08-11*HER3ECD相互作用。5：缓冲液参照。图8Biacore表位结合实验的传感图重叠。一抗M-05-74(图中的M-074)呈递HER3ECD至二抗M-208，GT(＝8B8)，M-05-74和M-08-11(图8中的M-011)(M-.测量的噪声是5RU。图9Biacore传感图重叠图。1：M-05-74上的90nM调蛋白*HER3ECD复合物。2：M-08-11上的90nM调蛋白*HER3ECD复合物。3：8B8抗体上的90nM调蛋白*HER3ECD复合物。图10Biacore功能测定法鉴定的作用的示意模式。1：M-08-11结合调蛋白活化的HER3ECD并诱导延迟的调蛋白解离，其中M-08-11停留在HER3ECD受体复合物中。2：M-05-74结合调蛋白活化的HER3ECD。调蛋白被捕获在复合物中且抗体留在复合物中。3：8B8结合调蛋白活化的HER3ECD。整个复合物从抗体解离。图11表位作图和丙氨酸扫描办法的策略。调查了EGFR，HER2ECD，HER3ECD和HER4ECD的肽发夹序列(肽发夹)，包括它们的结构埋藏(结构性的)。半胱氨酸用丝氨酸替换。图12HER3和HER4上抗体M-05-74的表位的CelluSpotsTM合成和表位作图。抗HER3/HER4抗体M-05-74结合HER3ECD结合表位VYNKLTFQLEP(SEQIDNO:43)和HER4ECD结合表位VYNPTTFQLE(SEQIDNO:44)。图13来自抗HER3/HER4抗体M-05-74(图中称作M-074)和无HER4交叉反应性的抗HER3抗体M-08-11(称作M-011)的CelluSpotsTM丙氨酸扫描的结果-对抗HER3/HER4抗体M-05-74结合其HER3ECD结合表位VYNKLTFQLEP(SEQIDNO:43)和其HER4ECD结合表位VYNPTTFQLE(SEQIDNO:44)贡献最大的氨基酸以下划线/粗体标示。图14M-05-74(M-074)的结合诱导/促进HRG结合HER3ECD。图15MCF7细胞中对HER2/HER3异二聚体/异二聚化(免疫沉淀和Western印迹)的抑制(HER3-IP＝HER3抗体的免疫沉淀/HER2-IP＝HER3抗体的免疫沉淀)。图16用M-05-74处理MDA-MB175导致抑制细胞增殖。图17M-05-74(M-074)(10mg/kg，q7d，i.p.)处理在FaDuHNSCC移植的异种移植物中导致肿瘤停滞。图18M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-074-PE)(10mg/kg，q7d，i.p.)处理在HRG存在下(粗线)导致比在HRG缺失下(细线)更强的细胞增殖抑制。图19M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE)所致体内肿瘤细胞生长抑制。图例：实线(媒介)；虚线(M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE))。图20Biacore传感图重叠图：本发明的抗体M-05-74(1)与TtSlyDcys-HER3(SEQIDNO:18)的结合，与WO2012/22814中描述的抗HER3抗体MOR09823(2)比较。本发明的抗体M-05-74(1)显示清楚的结合TtSlyDcys-HER3(SEQIDNO:18)的信号，而抗HER3抗体MOR09823(2)显示根本不结合TtSlyDcys-HER3(SEQIDNO:18)。根本无抗体的对照测量(3)不显示任何对TtSlyDcys-HER3(SEQIDNO:18)的结合。图21经核糖体展示选择经过优化的人源化M-05-74抗体：展示选择期间经过富集的RNA的逆转录后获得的PCR产物的分析性DNA芯片电泳。所获得的凝聚图像显示道1中选定构建物DNA的富集和道2中阴性对照(没有抗原的淘选)没有富集。正如预期的，剩余对照也是阴性的。DNA消化是完全的(道3为靶物，道4为背景)。因此，道1中所有获得的DNA衍生自淘选步骤中选择的结合性变体，及其相应的RNA。逆转录的阴性对照和PCR的阴性对照均不显示条带。道7显示纯化后合并PCR反应的产物。图22表达载体构建物-DIB轻链(VL-CK)。图23表达载体构建物-CH3中具有‘节’氨基酸的DIB重链(VH-CH1-CH2-CH3(节))。图24表达载体构建物-帕妥珠单抗交叉轻链(VL-CH1)。图25表达载体构建物-CH3中具有‘穴’突变的帕妥珠单抗交叉重链(VH-CK-CH2-CH3(穴))。图26(A)作为DIB-74和帕妥珠单抗的杂合物的双特异性CrossMabDIBxPERT的布局：示意图显示双特异性CrossMabDIBxPERT和它的亲本抗体DIB-74和帕妥珠单抗。DIB-74和帕妥珠单抗分别结合HER3-ECD和HER2-ECD的β-发夹。深色指示Ig重链，浅色指示Ig轻链。依照‘节-入-穴’技术，CH3Ig域含有‘节’或‘穴’突变。设计帕妥珠单抗重和轻链CH1和CK的域交换来推动正确轻链-重链组装。(B)DIB-MoAb(一种人造单价抗体型式，DIB-74的衍生物)的示意图。应用‘节-入-穴’技术和CH1-CK域交换。图27通过GPC和SDS-PAGE对经过纯化的DIBxPERTCrossMab的定性分析：使用GPC和SDS-PAGE评估DIBxPERT终产物质量。(A)对分析性GPC峰连续编号(1-7)。(B)所有七个GF30峰的列表呈现，列出了保留时间，280nm吸光度和百分比相对峰面积。(C)还原性(+)和非还原性(-)条件下的4-12％SDS-PAGE的考马斯染色，显示DIBxPERT终产物。DIBxPERT和DIBxPERT重和轻链以箭标示。图28通过SPR对DIBxPERT和亲本抗体的动力学特征的比较：在CM5传感器芯片表面上捕捉抗体，并使用BiacoreB3000仪器(GEHealthcare，München，Germany)于25℃测量与可溶性分析物的动力学相互作用。注射分析物达5分钟，并记录解离达10分钟。以五步1:3系列稀释注射分析物HER2-ECD和HER3-ECD/HRG1β，最高浓度270nM。图29溶液中DIBxPERT所致HER2-ECD和活化的HER3-ECD的同时复合物形成：在CM5传感器芯片表面上捕捉抗体，并使用BiacoreB3000仪器(GEHealthcare，München，Germany)于25℃测量与可溶性分析物的动力学相互作用。顺序注射分析物HER2-ECD和HER3-ECD/HRG1β达8分钟，并记录解离达5分钟。(A和C)分别为传感图(B)和(D)的测定法设置。(B和D)传感图显示两种分析物的顺序结合。分析物注射和摩尔比分别以箭和‘MR’标示。图30与亲本抗体比较DIBxPERT所致MDA-MB-175VII癌细胞的生长增殖抑制。MDA-MB-175VII乳腺癌细胞与下述抗体的系列稀释一起温育6天：DIBxPERT，DIB-MoAb，DIB-74，帕妥珠单抗(PERT)，RG7116，DIB-74和帕妥珠单抗，RG7116和帕妥珠单抗和同种型对照。使用每种抗体浓度一式三份的均值计算EC50值。所描绘的标准化的四参数S形曲线剂量-响应曲线。标准偏差以误差棒标示。本发明实施方案的详述I.定义出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。“亲和力成熟的”抗体指与不拥有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。术语“双特异性HER3/HER2抗体”、“结合(人)HER3且结合(人)HER2的双特异性(HER3/HER2)抗体”和“特异性结合(人)HER3且特异性结合(人)HER2的双特异性(HER3/HER2)抗体”指能够以足够的亲和力结合HER3，使得抗体可用作靶向HER3中的诊断和/或治疗剂且能够以足够的亲和力结合HER2，使得抗体可用作靶向HER2中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，双特异性HER3/HER2抗体对无关的、非HER3蛋白(HER4除外)的结合程度小于抗体对HER3或HER2的结合的约10％，如例如通过表面等离振子共振测定法(诸如例如BIACORE)测量的。在某些实施方案中，结合人HER3或HER2的抗体对于结合人HER3或HER2的结合亲和力具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的KD值。在某些实施方案中，依照本发明的抗体(也)结合人HER4且对于结合人HER4的结合亲和力具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的KD值。在一个优选实施方案中，结合亲和力的相应KD值是在表面等离振子共振测定法中分别使用人HER3或HER2的野生型胞外域(ECD)(HER3-ECD或HER2-ECD)(分别对于HER3结合亲和力和HER2结合亲和力)和野生型人HER4-ECD(对于HER4结合亲和力)测定的。在双特异性HER3/HER2抗体还结合(人)HER4的情况中，术语“双特异性HER3/HER2抗体”，“结合(人)HER3且结合(人)HER2的双特异性(HER3/HER2)抗体”和“特异性结合(人)HER3且特异性结合(人)HER2的双特异性(HER3/HER2)抗体”指“还结合(人)HER4的多特异性HER3/HER2抗体”，“还结合(人)HER4的结合(人)HER3且结合(人)HER2的多特异性(HER3/HER2)抗体”和“还结合(人)HER4的特异性结合(人)HER3且特异性结合(人)HER2的多特异性(HER3/HER2)抗体”。本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中与完整抗体结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和自抗体片段形成的多特异性抗体。与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。抗体特异性指抗体对特定抗原表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体是对两种不同抗原特异性的，VEGF作为第一抗原且ANG-2作为第二抗原。如本文中使用的，术语“单特异性”抗体指具有各自结合相同抗原的同一表位的一个或多个结合位点的抗体。如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。如此，术语“二价”、“四价”、和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点、和六个结合位点。在本发明的一个优选实施方案中，依照本发明的双特异性抗体是“二价”的。如本文中所使用的，术语“癌症”可以例如是肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌(biliarycancer)、中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)、星形细胞瘤、神经鞘瘤(schwanoma)、室鼓膜瘤(ependymona)、髓母细胞瘤、脑脊膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病，包括任何上述癌症的顽固性型式、或一种或多种上述癌症的组合。在一个优选实施方案中，此类癌症是乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌或前列腺癌。在一个优选实施方案中，此类癌症的进一步特征在于HER3表达(或过表达)。在一个优选实施方案中，此类癌症的进一步特征另外在于HER2表达(或过表达)。本发明的又一个实施方案是在原发性肿瘤和新的转移的同时治疗中使用的本发明的双特异性HER3/HER2抗体。术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类：IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。在一个优选实施方案中，“细胞毒剂”为假单胞菌外毒素A或其变体。在一个优选实施方案中，“细胞毒剂”为鹅膏蕈毒素或其变体。“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索引，如记载于Kabat,E.A.etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)NIHPublication91-3242。“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有本文中定义的Fc区的重链的抗体。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat,E.A.etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,BethesdaMD(1991),NIHPublication91-3242,Vols.1-3中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组卡帕I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化变体”指已经经历人源化的抗体。在一个优选实施方案中，将鼠HVR嫁接入人抗体的框架区以制备“人源化抗体”。参见例如Riechmann,L.etal.,Nature332(1988)323-327；和Neuberger,M.S.etal.,Nature314(1985)268-270。将鼠可变区氨基酸序列与人种系抗体V基因集合比对，并根据序列同一性和同源性进行分选。根据高总体序列同源性，还有任选的接受者序列中早已存在的正确(right)规范残基的存在来选择接受者序列(参见Poul,M-A.andLefranc,M-P.,in“Ingénieriedesanticorpsbanquescombinatores”ed.byLefranc,M-P.andLefranc,G.,LesEditionsINSERM,1997)。种系V基因只编码重链直到HVR3开始和轻链直至HVR3中部的区域。因此，种系V基因的基因不与完整V域比对。人源化构建物包含人框架1至3、鼠HVR、和自人JK4和JH4序列(分别用于轻和重链)衍生的人框架4序列。在选择一种特定接受者序列之前，可确定捐献者抗体的所谓的规范环结构(参见Morea,V.etal.,Methods,Vol20,Issue3(2000)267-279)。通过所谓的规范位置处存在的残基的类型来确定这些规范环结构。这些位置(部分)位于HVR区域以外，而且应当在最终的构建物中保持功能上等同，从而保留亲本(捐献者)抗体的HVR构象。如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上定义的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地，抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的例示性HVR包括：(a)高变环，其存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；(b)CDR，其存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))；(c)抗原接触，其存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、和93-101(H3)(MacCallumetal.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和(d)(a)、(b)、和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、和94-102(H3)。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。“个体”或“受试者”指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如人和非人灵长类，诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者指人。“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述参见例如Flatman,S.etal.,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。“编码双特异性HER3/HER2抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有整个或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。术语“Mab”指单克隆抗体，而术语“hMab”指此类单克隆抗体的人源化变体。“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中(包括如果现有技术有的话免疫缀合物)。“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(WashingtonD.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(SouthSanFrancisco，California)可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统(包括数码UNIXV4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：分数X/Y乘100其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。术语“药物配制剂”指所处形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分的制剂。“药学可接受载剂”指药物配制剂中与活性成分不同，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。如本文中使用的，术语“HER3”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然HER3，除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工HER3以及源自细胞中加工的任何形式的HER3。该术语还包括天然存在的HER3变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人HER3的氨基酸序列显示于SEQIDNO：3。“人HER3”(ErbB-3，ERBB3，c-erbB-3，c-erbB3，受体酪氨酸蛋白激酶erbB-3，SEQIDNO:3)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体(EGFR)家族的一个成员，该家族还包括HER1(也称作EGFR)、HER2、和HER4(Kraus,M.H.etal.,PNAS86:9193-9197(1989)；Plowman,G.D.etal.,PNAS87:4905-4909(1990)；Kraus,M.H.etal.,PNAS90:2900-2904(1993))。就像原型表皮生长因子受体，跨膜受体HER3由胞外配体结合域(ECD)、ECD内的二聚化域、跨膜域、胞内蛋白质酪氨酸激酶域(TKD)和C端磷酸化域组成。这种膜结合蛋白具有调蛋白(HRG)结合域，它在胞外域而非活性激酶域内。因此，它能结合这种配体但没有经由蛋白质磷酸化将信号传递入细胞。然而，它确实与的确具有激酶活性的其它HER家族成员形成二聚体。异二聚化导致受体介导的信号传导途径激活及其胞内域转磷酸化。HER家族成员之间的二聚体形成扩充HER3的信号传导潜力，而且不仅是信号多样化而且是信号放大的手段。例如，HER2/HER3异二聚体诱导HER家族成员中最重要的促有丝分裂信号之一，经PI3K和AKT途径(SliwkowskiM.X.etal.,J.Biol.Chem.269:14661-14665(1994)；AlimandiMetal.,Oncogene.10:1813-1821(1995)；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276:42153-4261(2001)；Singer,E.,J.Biol.Chem.276:44266-44274(2001)；Schaefer,K.L.,Neoplasia8:613-622(2006))。关于HER3及其在HER受体家族和NGR配体家族内的各种相互作用的概述参见例如Sithanandam,G.etalCancerGeneTherapy15:413-448(2008)。有趣的是，在其平衡状态，HER3受体以其“闭合构象”存在，这确实意味着异二聚化HER3β-发夹基序经非共价相互作用系留至HER3ECD域IV(见图1c)。假定“闭合”HER3构象能经配体调蛋白在特定HER3调蛋白结合位点处的结合而开放。这发生于由HER3ECD域I和域III形成的HER3界面。通过这种相互作用，认为HER3受体活化并转变成它的“开放构象”(见图1b和例如Baselga,J.etal.,Nat.Rev.Cancer9:463-475(2009)和Desbois-Mouthon,C.,etal.,GastroenterolClinBiol34:255-259(2010))。在这种开放构象中，与HER2的异二聚化和转信号诱导是可能的(见图1b)。如本文中使用的，术语“HER2”指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠))来源的任何天然HER2，除非另外指明。该术语涵盖“全长”，未加工的HER2以及源自细胞中加工的任何形式的HER2。该术语还涵盖HER2的天然发生变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人HER2的氨基酸序列显示于SEQIDNO:5。“人HER2”(也称作c-erbB2/neu蛋白，p185erbB2，原癌基因Neu，原癌基因c-ErbB-2，受体酪氨酸蛋白质激酶erbB-2，v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物2，成神经/胶质细胞瘤衍生癌基因同系物；SEQIDNO:9)是一种跨膜的表面结合的受体酪氨酸激酶，而且正常情况下牵涉导致细胞生长和分化的信号转导途径。HER2是乳腺癌治疗的一种有希望的靶物，因为发现它在约四分之一的乳腺癌患者中过表达(Bangeetal.,2001,NatureMedicine7:548)。癌基因HER2及这种受体的过表达或突变导致它的组成性活化。这驱动多种癌症的形成，像乳腺癌，口腔癌，胰腺癌和肺癌(Schneideretal.,1989；Weineretal.,1990；Houetal.,1992；Revillionetal.,1998)。HER2是HER家族中不像HER1，HER3和HER4那样以系留构象表达的唯一受体。而是，它以开放，伸展构象在细胞表面上表达。在这种构象中，亚域II的β-发夹是可及的。抗体帕妥珠单抗显示出紧靠着结合HER2胞外域(ECD)β-发夹和亚域II中的周围区域。β-发夹对于与其它HER受体形成二聚体是至关重要的。通过结合这一表位，帕妥珠单抗能够抑制二聚体形成和因此后续信号传导级联的激活。HER2/HER3异二聚体经PI3K和AKT途径诱导HER家族成员中最重要的促有丝分裂信号之一(Sliwkowski,M.X.,etal,J.Biol.Chem.269(1994)14661-14665；Alimandi,M.etal,Oncogene.10(1995)1813-1821；Hellyer,N.J.,J.Biol.Chem.276(2001)42153-4261；Singer,E.,J.Biol.Chem.276(2001)44266-44274；Schaefer,K.L.,Neoplasia8(2006)613-622)。尤其，HRG1β诱导的HER2/HER3异二聚体的形成在具有自分泌HRG环的癌症中发挥关键作用(Gollamudietal.,2004)。另外，当前临床研究的结果指示抗HER2抗体治疗的成就在HRG1β存在下降低(McDonaghetal.,2012)。“帕妥珠单抗的表位”是HER2胞外域中抗体帕妥珠单抗结合的区域。为了筛选与帕妥珠单抗结合相同表位的抗体，可以实施例行交叉阻断测定法，诸如Ed.HarlowandDavidLane,Antibodies,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,(1988)中记载的。或者，可以实施表位作图来评估抗体是否结合HER2的帕妥珠单抗表位(例如HER2的大约残基22至大约残基584的区域中的任一个或多个残基，含端点)。帕妥珠单抗的结合表位包含来自HER2胞外域域II的残基。帕妥珠单抗在域I，II和III的接合处结合HER2胞外域。还可参见Franklinetal.,CancerCell5(2004)317-328。如本文中使用的，术语“HER4”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠))的任何天然HER4，除非另有说明。该术语涵盖“全长”、未加工HER4以及源自细胞中加工的任何形式的HER4。该术语还包括天然存在的HER4变体，例如剪接变体或等位变体。一种例示性人HER4的氨基酸序列显示于SEQIDNO：5。“人HER4”(也称作ErbB-4、ERBB4、v-erb-a、成红细胞白血病病毒癌基因同系物4、p180erbB4、鸟类成红细胞白血病病毒(v-erb-b2)癌基因同系物4；SEQIDNO:5)是I型单次跨膜蛋白质，具有多个弗林蛋白酶样富含半胱氨酸域、酪氨酸激酶域、磷脂酰肌醇-3激酶结合位点和PDZ域结合基序(PlowmanG.D.etal.,PNAS90:1746-50(1993)；ZimonjicD.B.etal.,Oncogene10:1235-7(1995)；CulouscouJ.M.etal.,J.Biol.Chem.268:18407-10(1993))。该蛋白质结合神经调蛋白-2和-3、肝素结合性EGF样生长因子和β细胞素并被它们活化。配体结合诱导多种细胞应答，包括有丝分裂和分化。多种蛋白水解事件容许胞质片段和胞外片段释放。已经将这种基因中的突变与癌症关联起来。编码不同蛋白质同等型的可变剪接变体已有记载；然而，并非所有变体均已完全表征。如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每一个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindt,T.J.etal.,KubyImmunology,6thed.,W.H.FreemanandCo.,N.Y.(2007),page91)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合该抗原的抗体。参见例如Portolano,S.etal.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson,T.etal.,Nature352:624-628(1991))。如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体以及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。II.组合物和方法一方面，本发明部分基于下述发现，使用在SlyD支架内以三维取向功能性呈递的HER3(和任选地HER4)β-发夹(见例如图2，及SEQIDNO.13和17至24的多肽)有可能选择对HER3(和HER4)β-发夹特异性的抗体。它们与针对HER2，具体针对人HER2域II的抗体一起用于生成结合人HER3且结合人HER2的双特异性抗体，其中该抗体在氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1；人HER3β-发夹)内结合人HER3且结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。本发明的双特异性抗体对于例如癌症的诊断或治疗是有用的。A.例示性双特异性HER3/HER2抗体本发明提供一种分离的结合人HER3且结合人HER2的双特异性抗体，其中该抗体在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3。本发明提供一种分离的结合人HER3且结合人HER2的双特异性抗体，其中该抗体在SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合。本发明提供一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹(SEQIDNO:1)且结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。本发明提供一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3且结合人HER2，其中该抗体在SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合人HER3且其中该抗体结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。本发明提供一种分离的双特异性抗体，其结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。本发明提供一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且与帕妥珠单抗结合人HER2上相同表位。本发明提供一种分离的双特异性抗体，其结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体与帕妥珠单抗结合人HER2上相同表位。本发明提供一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且与帕妥珠单抗竞争结合人HER2。本发明提供一种双特异性分离的抗体，其结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体与帕妥珠单抗竞争结合人HER2。本发明提供一种双特异性分离的抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2且包含帕妥珠单抗的所有六种重和轻链HVR(SEQIDNO:60，SEQIDNO:61，SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:64，和SEQIDNO:65)。本发明提供一种双特异性分离的抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2且包含帕妥珠单抗的VH和VL(SEQIDNO:66和SEQIDNO:67)。在本发明的一个实施方案中，本文所述双特异性HER3/HER2抗体还结合人HER4(且因此称作多特异性HER3/HER2抗体)。在本发明的一个实施方案中，本文所述多特异性HER3/HER2抗体还结合人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)。在本发明的一个实施方案中，本文所述多特异性HER3/HER2抗体还结合包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽。结合人HER3β-发夹且还结合人HER4，人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)和包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽的抗体的一个例子是包含SEQIDNO:31的VH(重链可变域VH，M-05-74)和SEQIDNO:32(轻链可变域VL，M-05-74)的VL的抗体。在本发明的一个实施方案中，本文所述双特异性HER3/HER2抗体不与人HER4交叉反应。在本发明的一个实施方案中，本文所述双特异性HER3/HER2抗体不与人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)交叉反应。在本发明的一个实施方案中，本文所述双特异性HER3/HER2抗体不与包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽交叉反应。结合人HER3β-发夹且不与人HER4，人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)和包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)多肽交叉反应(不结合)的抗体的一个例子是包含SEQIDNO:51(重链可变域VH，<Her3>M-08-11)的VH和SEQIDNO:52(轻链可变域VL，<Her3>M-08-11)的VL的抗体。本发明提供一种双特异性分离的抗体，a)其结合人HER3且包含下述重链HVR：SEQIDNO:25重链HVR-H1，M-05-74，SEQIDNO:26重链HVR-H2，M-05-74，和SEQIDNO:27重链HVR-H3，M-05-74，且包含下述轻链重链HVR：SEQIDNO:28轻链HVR-L1，M-05-74，SEQIDNO:29轻链HVR-L2，M-05-74，和SEQIDNO:30轻链HVR-L3，M-05-74；且b)其结合人HER2且包含下述重链HVR：SEQIDNO:60重链HVR-H1，帕妥珠单抗，SEQIDNO:61重链HVR-H2，帕妥珠单抗，SEQIDNO:62重链HVR-H3，帕妥珠单抗，且包含下述轻链重链HVR：SEQIDNO:63轻链HVR-L1，帕妥珠单抗，SEQIDNO:64轻链HVR-L2，帕妥珠单抗，和SEQIDNO:65轻链HVR-L3，帕妥珠单抗。本发明提供一种双特异性分离的抗体，a)其结合人HER3且包含i)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:41的可变轻链域VL，ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:39的可变轻链域VL，或iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:42的可变轻链域VL；且b)其结合人HER2且包含具有氨基酸序列SEQIDNO:66的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的可变轻链域VL。在本发明的一个实施方案中，本文所述双特异性HER3/HER2抗体是二价的。在本发明的一个实施方案中，本文所述双特异性HER3/HER2抗体具有一项或多项下述特性(或是单独的或是任意组合的)：该抗体a)在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3；b)结合选自下组的多肽：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3；c)在HER3/HER2共沉淀测定法中在MCF-7细胞中抑制HER3/HER2异二聚体的异二聚化；d)在体内显示肿瘤生长抑制活性；e)以KD值≤1x10-8M(在一个实施方案中，KD值为1x10-8M至1x10-13M；在一个实施方案中，KD值为1x10-9M至1x10-13M)的亲和力结合HER3-ECD；f)以KD值≤1x10-8M(在一个实施方案中，KD值为1x10-8M至1x10-13M；在一个实施方案中，KD值为1x10-9M至1x10-13M)的亲和力结合HER2-ECD。在一个优选实施方案中，该抗体是IgG1或IgG4同种型的。在一个优选实施方案中，该抗体包含人起源的恒定域(人恒定域)。本发明意义内的包含各自人恒定域的典型人恒定区具有氨基酸序列SEQIDNO:53至SEQIDNO:58(它们是部分包含氨基酸替代的)。1.抗体亲和力在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数KD。在一个优选实施方案中，KD是使用表面等离振子共振测定法使用于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了动力学测量，于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(Evaluation软件版本3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon或ka)和解离速率(koff或kd)。平衡解离常数(KD)以比率kd/ka(koff/kon)计算。参见例如Chenetal.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过106M-1s-1，那么可使用荧光淬灭技术来测定结合速率，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(AvivInstruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯进行的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的升高或降低。2.抗体片段在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.etal.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,In:ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,Vol.113,RosenburgandMoore(eds.),Springer-Verlag,NewYork(1994),pp.269-315；还可参见WO93/16185；及美国专利No.5,571,894和No.5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如EP0404097；WO1993/01161；Hudson,P.J.etal.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Holliger,P.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson,P.J.etal.,Nat.Med.9:129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。在一个优选实施方案中，该抗体片段是Fab片段。在一个优选实施方案中，该抗体片段(在该片段含有恒定域的情况中)包含人起源的恒定域(人恒定域)。3.嵌合抗体和人源化的抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；及Morrison,S.L.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如CDR(或其部分)自非人抗体衍生，而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro,J.C.andFransson,J.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步记载于例如Riechmann,I.etal.,Nature332:323-329(1988)；Queen,C.etal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、No.7,527,791、No.6,982,321、和No.7,087,409；Kashmiri,S.V.etal.,Methods36:25-34(2005)(记载SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(记载“重修表面”)；Dall’Acqua,W.F.etal.,Methods36:43-60(2005)(记载“FR改组”)；Osbourn,J.etal.,Methods36:61-68(2005)及Klimka,A.etal.,Br.J.Cancer83:252-260(2000)(记载FR改组的“引导选择”办法)；Morea,V.etal.,Methods,Vol20,Issue3(2000)267-279)及WO2004/006955(经规范结构的办法)。4.人抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于vanDijk,M.A.andvandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有整个或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584，其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M技术，和美国专利申请公开文本No.US2007/0061900，其描述了技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor,D.,J.Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.etal.,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker,Inc.,NewYork(1987),pp.51-63；及Boerner,P.etal.,J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li,J.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些记载于例如美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)及Ni,J.,XiandaiMianyixue26:265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers,H.P.andBrandlein,S.,HistologyandHistopathology20:927-937(2005)及Vollmers,H.P.andBrandlein,S.,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology27:185-191(2005)。也可以如下生成人抗体，即分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。5.文库衍生的抗体可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom,H.R.etal.,MethodsinMolecularBiology178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.etal.,Nature348:552-554(1990)；Clackson,T.etal.,Nature352:624-628(1991)；Marks,J.D.etal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.andBradbury,A.,MethodsinMolecularBiology248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.etal.,J.Mol.Biol.338:299-310(2004)；Lee,C.V.etal.,J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.etal.,J.Immunol.Methods284:119-132(2004)。在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于Winter,G.etal.,Ann.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths,A.D.etal.,EMBOJ,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆非重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由Hoogenboom,H.R.andWinter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373及美国专利公开文本No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。6.多特异性抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对HER3/HER4，而另一种针对任何其它抗原。也可以使用多特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达HER3和/或HER2(和HER4)的细胞。双特异性或多特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.andCuello,A.C.,Nature305:537-540(1983)；WO93/08829；及Traunecker,A.etal.,EMBOJ.10:3655-3659(1991))、和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.etal.,Science229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.etal.,J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber,M.etal.,J.Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.etal.,J.Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US2006/0025576)。本文中的抗体或片段还包括包含结合HER3及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用Fab”或“DAF”(参见例如US2008/0069820)。本文中的抗体或片段还包括WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253、WO2009/080254、WO2010/112193、WO2010/115589、WO2010/136172、WO2010/145792、及WO2010/145793中记载的多特异性抗体。7.抗体变体在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。a)替代、插入、和删除变体在某些实施方案中，提供具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。表1依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；(2)中性、亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；(3)酸性的：Asp，Glu；(4)碱性的：His，Lys，Arg；(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性替代变体是亲和力成熟抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。可以在HVR中做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以在HVR“热点”中，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,P.S.,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，对所得变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom,H.R.etal.,inMethodsinMolecularBiology178:1-37(2002))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其没有实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR或是未改变的，或是含有不多于1、2或3处氨基酸替代。一种可用于鉴定抗体中可作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如记载于Cunningham,B.C.andWells,J.A.,Science,244:1081-1085(1989)。在这种方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望特性。氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。b)糖基化变体在某些实施方案中，改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体添加或删除糖基化位点。在抗体包含Fc区的情况中，可以改变附着于Fc区的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright,A.andMorrison,S.L.,TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改良特性的抗体变体。在一个实施方案中，提供抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。参见例如US2003/0157108；US2004/0093621。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.etal.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki,N.etal.,Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka,J.etal.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US2003/0157108；及WO2004/056312，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki,N.etal.,Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.etal.,Biotechnol.Bioeng.94:680-688(2006)；及WO2003/085107)。进一步提供具有两分型寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO2003/011878；美国专利No.6,602,684；及US2005/0123546。还提供在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087；WO1998/58964；及WO1999/22764。c)Fc区变体在某些实施方案中，可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。在某些实施方案中，本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体，所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物，其中抗体的体内半衰期是重要的，而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch,J.V.andKinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(参见例如Hellstrom,I.etal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA83:7059-7063(1986))及Hellstrom,Ietal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337(参见Bruggemann,M.etal.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.，MountainView，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes,R.etal.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro,H.etal.,J.Immunol.Methods202:163-171(1996)；Cragg,M.S.etal.,Blood101:1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.andM.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.etal.,Int.Immunol.18:1759-1769(2006))。具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体，包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(参见例如美国专利No.6,737,056；WO2004/056312；及Shields,R.L.etal.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))。在某些实施方案中，抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298、333、和/或334(EU残基编号方式)的替代的Fc区。在一些实施方案中，在Fc区中做出改变，其导致改变的(即改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如记载于美国专利No.6,194,551；WO99/51642；及Idusogie,E.E.etal.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934，新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.etal.,J.Immunol.117:587-593(1976)及Kim,J.K.etal.,J.Immunol.24:2429-2434(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn的结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434中的一处或多处具有替代，例如Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。还可参见Duncan,A.R.andWinter,G.,Nature322:738-740(1988)；US5,648,260；US5,624,821；及WO94/29351，其关注Fc区变体的其它例子。d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体在某些实施方案中，可能期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中，替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体缀合至其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块，以创建免疫缀合物，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下述残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。e)抗体衍生物在某些实施方案中，可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的另外的非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三口恶烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着至抗体的聚合物的数目可以变化，而且如果附着了多于一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能、抗体衍生物是否会用于指定条件下的治疗、等。在另一个实施方案中，提供抗体和可以通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，而且包括但不限于对普通细胞没有损害，但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。B.重组方法和组合物可使用重组方法和组合物来生成抗体，例如如记载于美国专利No.4,816,567的。在一个实施方案中，提供编码本文所述双特异性HER3/HER2抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体VL的氨基酸序列和/或包含抗体VH的氨基酸序列(例如抗体的轻和/或重链)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在又一个实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如已经用下述各项转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗体VL的氨基酸序列和包含抗体VH的氨基酸序列，或(2)第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码包含抗体VL的氨基酸序列的核酸，所述第二载体包含编码包含抗体VH的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供生成双特异性HER3/HER2抗体的方法，其中该方法包括在适合于抗体表达的条件下培养包含编码抗体的核酸的宿主细胞，如上文提供的，并任选自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收抗体。对于双特异性HER3/HER2抗体的重组生成，分离编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)，并插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可使用常规规程将此类核酸容易地分离并测序(例如通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合编码抗体重和轻链的基因)。适合于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生成抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应器功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如US5,648,237；US5,789,199；及US5,840,523。还可参见Charlton,K.A.,In:MethodsinMolecularBiology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2003),pp.245-254，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。表达后，可以在可溶性级分中自细菌细胞浆分离抗体，并可以进一步纯化。在原核生物之外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；及Li,H.etal.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也是自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生的。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。也可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利No.5,959,177；No.6,040,498；No.6,420,548；No.7,125,978；及No.6,417,429(其描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。也可使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用哺乳动物宿主细胞系的其它例子有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如记载于例如Graham,F.L.etal.,J.GenVirol.36:59-74(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如记载于例如Mather,J.P.,Biol.Reprod.23:243-252(1980))；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如记载于例如Mather,J.P.etal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于抗体生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki,P.andWu,A.M.,MethodsinMolecularBiology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),HumanaPress,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。C.测定法可通过本领域已知的多种测定法对本文中提供的双特异性HER3/HER2(和它们的亲本抗HER3和抗HER2)抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。公开的是一种用于选择结合人HER3的抗体用于生成双特异性HER3/HER2抗体的方法，其中该抗HER3抗体在人HER3的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合，其中使用a)至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQIDNO:1的多肽：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3来(在结合测定法中)选择显示结合a)下的至少一种多肽的抗体，并由此选择在(人HER3内的)氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合的抗体。在一个实施方案中，选择方法进一步包括下述步骤，其中用选自下组的多肽(测试对该多肽的结合)逆筛选选择的抗体：SEQIDNO:14TtSlyD-野生型SEQIDNO:15TtSlyDcasSEQIDNO:16TgSlyDΔIF以确认选择的抗体不结合不包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的多肽支架。1.结合测定法和其它测定法一方面，对本发明的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知方法诸如ELISA、Western印迹，包括表面等离振子共振(例如BIACORE)等。另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与M-05-74竞争对HER3(和/或HER4)的结合的抗体，还有鉴定与帕妥珠单抗竞争对HER2的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与M-05-74所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法参见Morris(1996)“EpitopeMappingProtocols,”inMethodsinMolecularBiology,vol.66(HumanaPress,Totowa,NJ)。别的方法详细记载于实施例4，使用CelluSpotTM技术。在一种例示性竞争测定法中，在包含第一经标记抗体(其分别结合HER3(/HER4)或HER2，例如M-05-74或帕妥珠单抗)和第二未标记抗体(其要测试与第一抗体竞争对HER3(/HER4)或HER2的结合的能力)的溶液中温育固定化HER3(/HER4)或HER2。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，在包含第一经标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育固定化HER3或HER4。在允许第一抗体结合HER3(/HER4)或HER2的条件下温育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定化HER3(/HER4)或HER2联合的标记物的量。如果测试样品中与固定化HER3(/HER4)或HER2联合的标记物的量相对于对照样品实质性减少，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对HER3(/HER4)或HER2的结合。参见Harlow,E.andLane,D.,Antibodies:ALaboratoryManual,Chapter14,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1988)。2.活性测定法一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的双特异性HER3/HER2抗体的测定法。生物学活性可包括例如抑制HER3和/或HER2磷酸化、抑制表达或过表达HER3和/或HER2(和/或HER4)的癌细胞的癌细胞增殖、抑制HER3/HER2异二聚化、经FACS测定法的(时间依赖性)内在化、具有表达或过表达HER3和/或HER2(和/或HER4)的异种移植癌细胞的异种移植物动物(例如小鼠或大鼠)模型中的体内肿瘤生长抑制。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在某些实施方案中，对本发明的抗体测试此类生物学活性。针对规定生物学活性的例示性体外或体内测定法记载于实施例2e、3、5至9、和11或17。D.免疫缀合物本发明还提供包含本文所述抗HER3/HER4抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合。在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见US5,208,020、US5,416,064和EP0425235B1)；auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见US5,635,483，US5,780,588，及US7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见US5,712,374、US5,714,586、US5,739,116、US5,767,285、US5,770,701、US5,770,710、US5,773,001、和US5,877,296；Hinman,L.M.等人，CancerRes.53:3336-3342(1993)；及Lode,H.N.等人，CancerRes.58:2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz,F.等人，CurrentMed.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey,S.C.等人，BioorgMed.Chem.Letters16:358-362(2006)；Torgov,M.Y.等人，Bioconjug.Chem.16:717-721(2005)；Nagy,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000)；Dubowchik,G.M.等人，Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King,H.D.等人，J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他赛(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含与假单胞菌外毒素A或其变体缀合的本文所述抗体。假单胞菌外毒素A或其变体记载于例如WO2011/32022、WO2009/32954、WO2007/031741、WO2007/016150、WO2005/052006和Liu,W.etal.,PNAS109:11782-11787(2012)。在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如TC99m或I123，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，MRI)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可使用a)重组表达技术(例如用于在例如大肠杆菌中表达与Fab或Fv抗体片段融合的基于氨基酸序列的毒素)或b)多肽偶联技术(像基于氨基酸序列的毒素与Fab或Fv抗体片段基于酶分选酶的偶联)或c)使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta,E.S.等,Science238:1098-1104(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari,R.V.等,CancerRes.52:127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于：商品化(如购自PierceBiotechnologyInc.,Rockford,IL,U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。E.用于诊断和检测的方法和组合物在某些实施方案中，本文中提供的任何双特异性HER3/HER2抗体分别对于检测生物学样品中HER3和/或HER2的存在是有用的。如本文中使用的，术语“检测”涵盖定量或定性检测。在某些实施方案中，生物学样品包括细胞或组织，诸如肿瘤组织。在一个实施方案中，提供在诊断或检测方法中使用的双特异性HER3/HER2抗体。在又一方面，提供分别检测生物学样品中HER3或HER2的存在的方法。在某些实施方案中，该方法包括分别在允许双特异性HER3/HER2抗体结合HER3或HER2的条件下使生物学样品与本文所述双特异性HER3/HER2抗体接触，并检测是否在双特异性HER3/HER2抗体与HER3或HER2之间形成复合物。此类方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，使用抗双特异性HER3/HER2抗体来选择适合用双特异性HER3/HER2抗体治疗的受试者，例如其中HER3和HER2分别是一种用于选择患者的生物标志物。可使用本发明的抗体来诊断的例示性病症包括癌症。在某些实施方案中，提供经标记的双特异性HER3/HER2抗体。标记物包括但不限于直接检测的标记物或模块(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光、和放射性标记物)、以及例如经由酶促反应或分子相互作用间接检测的模块，诸如酶或配体。例示性标记物包括但不限于放射性同位素32P、14C、125I、3H、和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物、罗丹明(rhodamine)及其衍生物、丹酰、伞形酮、萤光素酶例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶(其与采用过氧化氢氧化染料前体的酶诸如HRP偶联)、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/亲合素、自旋标记物、噬菌体标记物、稳定的自由基、等等。F.药物配制剂通过混合具有期望纯度的本文所述双特异性HER3/HER2抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂来制备此类抗体的药物配制剂(Remington′sPharmaceuticalSciences,16thedition,Osol,A.(ed.)(1980))，处于冻干配制剂或水性溶液形式。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rhuPH20(BaxterInternational,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rhuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和No.2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。例示性冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的多于一种活性组分。活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.(ed.)(1980)。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。G.治疗性方法和组合物本文中提供的任何双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物可用于治疗方法。一方面，提供了双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用作药物。又一些方面，提供了双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗癌症。在某些实施方案中，提供了双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗方法。在某些实施方案中，本发明提供双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗具有癌症的个体的方法，包括对该个体施用有效量的双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物。在又一些实施方案中，本发明提供双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于在癌细胞中诱导凋亡和/或抑制癌细胞增殖。在某些实施方案中，本发明提供双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物，其用于在个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖的方法，包括对该个体施用有效量的双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物以诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。依照任何上述实施方案，“个体”优选为人。又一方面，本发明提供双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒剂的免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法，包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在又一个实施方案中，该药物用于诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。在又一个实施方案中，该药物用于在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖的方法，包括对该个体施用有效量的药物以诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。依照任何上述实施方案，“个体”可以为“人”。又一方面，本发明提供用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的双特异性HER3/HER2抗体。依照任何上述实施方案，“个体”可以为人。又一方面，本发明提供用于在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖的方法。在一个实施方案中，该方法包括对该个体施用有效量的双特异性HER3/HER2抗体或双特异性HER3/HER2抗体缀合细胞毒性化合物的免疫缀合物以在罹患癌症的个体中诱导癌细胞凋亡和/或抑制癌细胞增殖。在一个实施方案中，“个体”为人。又一方面，本发明提供包含本文中提供的任何双特异性HER3/HER2抗体的药物配制剂，其用于例如任何上述治疗方法。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何双特异性HER3/HER2抗体和药学可接受载体。可以通过任何合适手段，包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用本发明的抗体(和任何别的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。本发明的抗体应当以一种与较好医学实践一致的方式配制、定剂量、和施用。关于这一点考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状态、病症的起因、药剂递送部位、施用方法、施用日程表、及医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种当前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用路径，或者以本文所述剂量的约1-99％，或者以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。对于疾病的预防或治疗，本发明的抗体(当单独地或与一种或多种其它别的治疗剂组合地使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和病程、施用抗体是出于预防还是治疗目的、之前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、及主治医师的判断。抗体恰当地以一次或一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)的抗体可作为施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开的施用或是通过连续输注。取决于上文所述因素，一个典型日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间的重复施用，取决于状况，治疗一般会持续直至出现疾病症状的期望遏制。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用一剂或多剂约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，或例如约6剂抗体)。可施用一个较高的初始加载剂量，接着是一个或多个较低的剂量。一种例示性剂量给药方案包括施用约4mg/kg的初始加载剂量，接着是约2mg/kg抗体的每周一次维持剂量。然而，其它剂量摄生法可能是有用的。这种疗法的进展易于通过常规技术和测定方法来监测。应当理解，可使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法，作为抗HER3/HER2抗体的替代或补充。III.制品在本发明的另一方面，提供一种制品，其包含对于治疗、预防和/或诊断上文所述病症有用的材料。制品包括容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，并且可具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的这个实施方案中的制品可进一步包括包装插页，其指示可使用组合物来治疗特定状况。或者/另外，制品可进一步包括第二(或第三)容器，其装有药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看期望的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物，作为抗HER3(和抗HER4)抗体的替代或补充。氨基酸序列的描述SEQIDNO:1人HER3的β-发夹SEQIDNO:2人HER4的β-发夹SEQIDNO:3人HER3SEQIDNO:4人HER3胞外域(ECD)SEQIDNO:5人HER4SEQIDNO:6人HER4胞外域(ECD)SEQIDNO:7人HER1SEQIDNO:8人HER1胞外域(ECD)SEQIDNO:9人HER2SEQIDNO:10人HER2胞外域(ECD)SEQIDNO:11人调蛋白片段(HRG)SEQIDNO:12人调蛋白β-1片段(Preprotech提供)SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3SEQIDNO:14TtSlyD-野生型SEQIDNO:15TtSlyDcasSEQIDNO:16TgSlyDΔIFSEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3SEQIDNO:21TtSlyDcas-Her4SEQIDNO:22TtSlyDcys-Her4SEQIDNO:23TgSlyDser-Her4SEQIDNO:24TgSlyDcys-Her4SEQIDNO:25重链HVR-H1，M-05-74SEQIDNO:26重链HVR-H2，M-05-74SEQIDNO:27重链HVR-H3，M-05-74SEQIDNO:28轻链HVR-L1，M-05-74SEQIDNO:29轻链HVR-L2，M-05-74SEQIDNO:30轻链HVR-L3，M-05-74SEQIDNO:31重链可变域VH，M-05-74SEQIDNO:32轻链可变域VL，M-05-74SEQIDNO:33重链可变域VH的人源化变体A，M-05-74_VH-ASEQIDNO:34重链可变域VH的人源化变体B，M-05-74_VH-BSEQIDNO:35重链可变域VH的人源化变体C，M-05-74_VH-CSEQIDNO:36重链可变域VH的人源化变体D，M-05-74_VH-DSEQIDNO:37重链可变域VH的人源化变体E，M-05-74_VH-ESEQIDNO:38轻链可变域VL的人源化变体A，M-05-74_VL-ASEQIDNO:39轻链可变域VL的人源化变体B，M-05-74_VL-BSEQIDNO:40轻链可变域VL的人源化变体C，M-05-74_VL-CSEQIDNO:41轻链可变域VL的人源化变体D，M-05-74_VL-DSEQIDNO:42轻链可变域VL的人源化变体E，M-05-74_VL-ESEQIDNO:43在人HER3β-发夹内的结合表位SEQIDNO:44在人HER4β-发夹内的结合表位SEQIDNO:45假单胞菌外毒素变体PE24LR8M_3G(包括GGG接头)SEQIDNO:46M-05-74轻链(M-05-74_LC)SEQIDNO:47带分选酶标签的M-05-74重链HC(M-05-74_HC)SEQIDNO:48缀合假单胞菌外毒素变体PE24LR8M的M-05-74重链HC(Fab-074-PE重链1)SEQIDNO:49缀合假单胞菌外毒素变体PE24LR8M的M-05-74重链HC(Fab-074-PE重链2)，作为直接PE24LR8M融合物SEQIDNO:50可溶性金黄色葡萄球菌分选酶ASEQIDNO:51重链可变域VH，<Her3>M-08-11SEQIDNO:52轻链可变域VL，<Her3>M-08-11SEQIDNO:53人卡帕轻链恒定区SEQIDNO:54人拉姆达轻链恒定区SEQIDNO:55自IgG1衍生的人重链恒定区SEQIDNO:56自IgG1衍生的人重链恒定区，在L234A和L235A上突变SEQIDNO:57自IgG1衍生的人重链恒定区，在L234A、L235A和P329G上突变SEQIDNO:58自IgG4衍生的人重链恒定区SEQIDNO:59人HER2的域IISEQIDNO:60重链HVR-H1，帕妥珠单抗SEQIDNO:61重链HVR-H2，帕妥珠单抗SEQIDNO:62重链HVR-H3，帕妥珠单抗SEQIDNO:63轻链HVR-L1，帕妥珠单抗SEQIDNO:64轻链HVR-L2，帕妥珠单抗SEQIDNO:65轻链HVR-L3，帕妥珠单抗SEQIDNO:66重链可变域VH，帕妥珠单抗SEQIDNO:67轻链可变域VL，帕妥珠单抗SEQIDNO:68重链1，双特异性HER3/HER2抗体DIBxPERTSEQIDNO:69轻链1，双特异性HER3/HER2抗体DIBxPERTSEQIDNO:70重链2，双特异性HER3/HER2抗体DIBxPERTSEQIDNO:71轻链2，双特异性HER3/HER2抗体DIBxPERT提供下面的实施例和附图来帮助理解本发明，其真正范围列于所附权利要求书。要理解的是，可以在所列规程中进行修饰而不偏离本发明的精神。下面列出本发明的数个实施方案：1.至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQIDNO:1的多肽在选择用于生成双特异性HER3/HER2抗体的结合人HER3的抗体的方法中的用途：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3，其中该HER3抗体在人HER3的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合；且此类HER3抗体然后用于生成双特异性HER3/HER2抗体。2.一种分离的结合人HER3且结合人HER2的双特异性抗体，其中该抗体在选自下组的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合：SEQIDNO:13TtSlyD-FKBP-Her3，SEQIDNO:17TtSlyDcas-Her3，SEQIDNO:18TtSlyDcys-Her3，SEQIDNO:19TgSlyDser-Her3，和SEQIDNO:20TgSlyDcys-Her3。3.一种分离的结合人HER3且结合人HER2的双特异性抗体，其中该抗体在在SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合。4.一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹(SEQIDNO:1)且结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。5.一种分离的结合人HER3且结合人HER2的双特异性抗体，其中该抗体在SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽中包含的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)内结合人HER3且其中该抗体结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。6.一种分离的双特异性抗体，该抗体结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体结合人HER2域II(SEQIDNO:59)。7.一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且与帕妥珠单抗结合人HER2上相同表位。8.一种分离的双特异性抗体，该抗体结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体与帕妥珠单抗结合人HER2上相同表位。9一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且与帕妥珠单抗竞争结合人HER2。10.一种分离的双特异性抗体，该抗体结合包含氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)的SEQIDNO:18(TtSlyDcys-Her3)的多肽且该抗体与帕妥珠单抗竞争结合人HER2。11.一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2且包含帕妥珠单抗的所有六种重和轻链HVR(SEQIDNO:60，SEQIDNO:61，SEQIDNO:62，SEQIDNO:63，SEQIDNO:64，和SEQIDNO:65)。12.一种分离的双特异性抗体，其结合人HER3β-发夹PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQIDNO:1)且结合人HER2且包含帕妥珠单抗的VH和VL(SEQIDNO:66和SEQIDNO:67)。13.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其还结合人HER4。14.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其还结合人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)。15.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其还结合包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽。16.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其不与人HER4交叉反应。17.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其不与人HER4β-发夹PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)交叉反应。18.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其不与包含氨基酸序列PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:22(TtSlyDcys-Her4)的多肽交叉反应。19.一种分离的双特异性抗体，a)其结合人HER3且包含下述重链HVR：SEQIDNO:25重链HVR-H1，M-05-74，SEQIDNO:26重链HVR-H2，M-05-74，和SEQIDNO:27重链HVR-H3，M-05-74，且包含下述轻链重链HVR：SEQIDNO:28轻链HVR-L1，M-05-74，SEQIDNO:29轻链HVR-L2，M-05-74，和SEQIDNO:30轻链HVR-L3，M-05-74；且b)结合人HER2且包含下述重链HVR：SEQIDNO:60重链HVR-H1，帕妥珠单抗，SEQIDNO:61重链HVR-H2，帕妥珠单抗，SEQIDNO:62重链HVR-H3，帕妥珠单抗，且包含下述轻链重链HVR：SEQIDNO:63轻链HVR-L1，帕妥珠单抗，SEQIDNO:64轻链HVR-L2，帕妥珠单抗，和SEQIDNO:65轻链HVR-L3，帕妥珠单抗。20.一种分离的双特异性抗体，a)其结合人HER3且包含i)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:41的可变轻链域VL，ii)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:39的可变轻链域VL，或iii)具有氨基酸序列SEQIDNO:33的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:42的可变轻链域VL；且b)结合人HER2且包含具有氨基酸序列SEQIDNO:66的可变重链域VH和具有氨基酸序列SEQIDNO:67的可变轻链域VL。21.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其中该双特异性抗体是二价的。22.一种分离的核酸，其编码依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体。23.一种宿主细胞，其包含实施方案22的核酸。24.一种生成依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体的方法，其包括培养此类宿主细胞使得该抗体生成。25.实施方案24的方法，其进一步包括自该宿主细胞回收此类抗体。26.一种免疫缀合物，其包含依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂。27.一种药物配制剂，其包含依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，和药学可接受载剂。28.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其用作药物。29.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，或包含该双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂的免疫缀合物，其用于治疗癌症。30.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，其用于抑制HER3/HER2二聚化和/或HER2/HER2二聚化。31.依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体或包含该双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂的免疫缀合物在制造药物中的用途。32.实施方案31的用途，其中该药物用于治疗癌症。33.实施方案31的用途，其中该药物用于抑制HER3/HER2二聚化和/或HER2/HER2二聚化。34.一种治疗具有癌症的个体的方法，其包括对该个体施用有效量的依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体或包含该双特异性HER3/HER2抗体和细胞毒剂的免疫缀合物。35.一种在罹患癌症的个体中抑制肿瘤细胞生长的方法，其包括对该个体施用有效量的依照前述实施方案任一项的双特异性HER3/HER2抗体，由此在该个体中抑制肿瘤细胞生长。实施例材料和通用方法重组DNA技术使用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.etal.，MolecularCloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989中所述。依制造商的说明书使用分子生物学试剂。基因合成从通过化学合成生成的寡核苷酸制备期望的基因区段。包括PCR扩增在内，通过退火和连接寡核苷酸装配侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的400-1600bp长基因区段，并随后经由指定的限制性位点例如EcoRI/BlpI或BsmI/XhoI克隆入下文所述表达载体。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。依照给定的规格在Geneart(Regensburg，Germany)定购基因合成片段。DNA序列测定通过在SequiserveGmbH(Vaterstetten，Germany)实施的双链测序测定DNA序列。DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理使用Infomax的VectorNT1Advance套组版本11.5.0进行序列创建、定位、分析、注释和说明。实施例1抗原和筛选蛋白质的制备-用于选择结合HER3β-发夹和HER4β-发夹的抗体的功能性β-发夹HER3和β-发夹HER4构建物的生成为了生成功能性β-发夹HER3和HER4构建物，将HER3(SEQIDNO:1)和HER4(SEQIDNO:2)的β-发夹的氨基酸序列移植入包含FKBP域的SlyD多肽框架。在此类构建物中，移植的β-发夹可自由接近，与HER3或HER4的天然未活化构象中的隐藏结构(在配体例如HRG缺失下)形成对比(见图1c和1d，其中HER3的β-发夹是隐藏的)。所有融合SlyD多肽均可通过使用几乎相同的方案纯化和重折叠。将用特定表达质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有用于选择性生长的相应抗生素(卡那霉素30μg/ml，或氨苄青霉素100μg/ml)的LB培养基中于37℃生长至OD600为1.5，并通过添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导胞质溶胶过表达。诱导后3小时，通过离心(5,000g，20分钟)来收获细胞，冷冻并保存于-20℃。为了细胞裂解，在补充有7MGdmCl和5mM咪唑的冷却50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中重悬浮冷冻团粒。其后将悬浮液在冰上搅动2-10小时至细胞完全裂解。离心(25,000g，1h)和过滤(硝酸纤维素膜，8.0μm，1.2μm，0.2μm)后，将裂解物应用到用裂解缓冲液平衡的Ni-NTA柱上。在随后的清洗步骤中，将咪唑浓度提高至10mM(在包含7MGdmCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)中)，并添加5mMTCEP以保持硫醇模块处于还原形式及防止早熟二硫桥形成。应用至少15-20个体积的还原性清洗缓冲液。其后，用包含100mMNaCl，10mM咪唑，和5mMTCEP的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)替换GdmCl溶液以诱导基质结合的SlyD融合多肽的构象重折叠。为了避免共纯化蛋白酶的再活化，将蛋白酶抑制剂混合物(无EDTA，Roche)添加至重折叠缓冲液。在过夜过程中应用总计15-20个柱体积的重折叠缓冲液。其后，通过用10个柱体积的包含100mMNaCl和10mM咪唑的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)清洗来去除TCEP和无EDTA抑制剂混合物二者。在最后的清洗步骤中，将咪唑浓度升高至30mM(10个柱体积)以去除粘着的污染物。然后通过应用相同缓冲液中的250mM咪唑来洗脱重折叠的多肽。通过Tricine-SDS-PAGE(Schaegger，H.andvonJagow，G.，Anal.Biochem.166(1987)368-379)评估含蛋白质级分的纯度。随后，对蛋白质进行大小排阻层析(SuperdexTMHiLoad，AmershamPharmacia)，使用磷酸钾作为缓冲系统(50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，100mMKCl，0.5mMEDTA)。最后，合并含蛋白质的级分，并在Amiconcell(YM10)中浓缩至约5mg/ml的浓度。TtSlyD-FKBP-Her3的Ni-NTA纯化的例示性SDS-PAGE分析显示于图3，而嗜热栖热菌SlyD-FKBP-Her3的Ni-NTA纯化级分的SEC洗脱概况显示于图4。嗜热栖热菌SlyD(TtSlyD)-Her3融合多肽可作为可溶性的和稳定的多肽以单体形式成功纯化。最后的产量定量为来自级分12和13的16.4mg纯化蛋白质。表2：开发的基于SlyD的表位支架(它们携带HER3二聚化域片段(HER3β-发夹(SEQIDNO:1))作为插入物或HER4二聚化域片段(HER4β-发夹(SEQIDNO:2))作为插入物)的氨基酸序列的汇总。TtSlyD-FKBP-Her3，TtSlyDcas-Her3，TtSlyDcys-Her3，耐伽马热球菌(Thermococcusgammatolerans)TgSlyDser-Her3和TgSlyDcys-Her3携带HER3二聚化域片段(HER3β-发夹(SEQIDNO:1))作为插入物，并用作免疫原及ELISA筛选中的阳性对照。使用TtSlyD-野生型，TtSlyDcas，TgSlyDΔIF作为ELISA筛选中的阴性对照(没有HER3二聚化域片段(HER3β-发夹(SEQIDNO:1))或HER4二聚化域片段(HER4β-发夹(SEQIDNO:2))作为插入物)。在ELISA筛选中使用TtSlyDcas-Her4，TtSlyDcys-Her4，TgSlyDser-Her4和TgSlyDcys-Her4(它们携带HER4二聚化域片段(HER4β-发夹(SEQIDNO:2))作为插入物)来检查开发的克隆对HER4的交叉反应性。当在大肠杆菌中表达表位支架时，N末端甲硫氨酸残基可以存在或不存在。(Nt＝N末端；Ct＝C末端)表2实施例2a)HER3抗体的免疫接种和选择为了生成抗HER3和HER4β-发夹的抗体，给Balb/C，NMRI或SJL小鼠免疫接种不同抗原。使用以下蛋白质作为抗原：全长HER3ECD，或表位支架蛋白TtSlyD-FKBP12-Her3，TtSlyDcys-Her3，TtSlyDcas-Her3，TgSlyDcys-Her3和TgSlyDser-Her3。TtSlyD-FKBP12-Her3变体代表第一代表位支架，用于生成HER3二聚化域特异性抗体。尽管使用SlyD变体作为表位支架的一般原理可使用第一代SlyD-FKBP12支架早就证明，还是开发了具有更高稳定性的改良支架变体。这些SlyD变体衍生自嗜热栖热菌和耐伽马热球菌。在免疫接种活动开始后的时间点0，6和10周对所有小鼠进行3次免疫接种。在每个时间点给每只小鼠免疫接种在100μlPBS中溶解的100μg无内毒素免疫原。为了第一次免疫接种，将免疫原与100μlCFA混合。为了第二次和第三次免疫接种，将免疫原与IFA混合。第一次和第三次免疫接种是经由腹膜内路径应用的，而第二次免疫接种是皮下应用的。在为了使用杂交瘤技术开发抗体而制备脾细胞前2和3天，用100μlPBS中且无佐剂的12.5μg免疫原对小鼠进行静脉内强化免疫接种。滴度分析为了测定针对相应免疫原和筛选蛋白质的血清滴度，在免疫接种活动开始后第11周收集每只小鼠的小量血清。为了ELISA，在平板表面上固定化免疫原或筛选支架蛋白。以1μg/ml的浓度固定化HER3ECD，并以0.5μg/ml的浓度使用支架蛋白TtSlyD-FKBP12-Her3，TtSlyD-FKBP12，TtSlyDcys-Her3，TtSlyDcas-Her3，TtSlyDcas，TgSlyDcys-Her3，TgSlyDser-Her3和TgSlyDΔIF。使用支架蛋白TtSlyDcas和TgSlyDΔIF作为阴性对照。在含1％BSA的PBS中稀释来自每只小鼠的血清，并将稀释液添加至平板。以1:300，1:900，1:2700，1:8100，1:24300，1:72900，1:218700和1:656100稀释度测试血清。用HRP标记的F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)并用ABTS(Roche)作为底物检测结合的抗体。即使在血清滴定的水平上，已经显而易见的是经过免疫接种的小鼠产生针对HER3β-发夹域的抗体。在用HER3ECD免疫接种的小鼠中，这可通过针对包含二聚化β-发夹环的支架蛋白之一的滴定来显示。强降低信号可通过下述事实来解释，即通过用HER3ECD免疫接种生成的大部分抗体靶向ECD内的其它部分，只有一小部分结合二聚化β-发夹域。在用包含HER3二聚化环的支架免疫接种的小鼠中，靶向该环的抗体的部分可通过针对HER3ECD的滴定(阳性对照)和针对无HER3插入的对照支架的滴定(阴性对照)来显示。b)抗体开发和ELISA筛选/选择使用此处描述的表位支架技术主要提供两种策略用于开发靶向HER3二聚化域(HER3β-发夹(SEQIDNO:1))的抗体。一种策略是免疫接种全长HER3ECD并使用支架筛选二聚化域特异性抗体。另一种策略是直接使用支架进行免疫接种及使用HER3ECD、具有另一种主链的支架或没有插入的支架进行反筛选。利用杂交瘤技术通过将原代B细胞与P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合产生抗体。最终的强化免疫接种后两天，处死接受免疫接种的小鼠并制备脾细胞群。通过使用PEG融合技术将脾细胞与P3X63Ag8.653融合。将来自融合的细胞批次培养物于37℃在5％CO2下温育过夜。次日将包含融合细胞的细胞批次以400g离心10分钟。之后，将细胞在补充有0.1x重氮丝氨酸-次黄嘌呤(Sigma)的杂交瘤选择培养基中悬浮，并以2.5x104个细胞每孔的浓度接种在96孔板中。将板于37℃在5％CO2下培养至少1周。ELISA分析前3天更换选择培养基。在针对HER3ECD和各种支架蛋白的ELISA中测试原代培养物上清液。进行针对支架蛋白的测试以证明选定的克隆结合天然HER3ECD的二聚化域β-发夹。进行针对对照支架TtSlyDcas和TgSlyDΔIF的测试以显示选定的克隆结合插入的HER3衍生序列而非支架主链。为了检查交叉反应性，针对Her家族的其它成员(即HER1，HER2和HER4)的全长ECD测试产生的克隆。如显示的，所有选定的克隆均是对HER3高度特异性的，而且能检测到针对HER4的高度特异性的交叉反应性，而未检测到针对HER家族其它成员的交叉反应性。为了ELISA筛选，使用抗原在下型式(antigendownformat)。以1μg/ml的浓度固定化HER3ECD，并以0.5μg/ml的浓度固定化支架蛋白TtSlyD-FKBP12-Her3，TtSlyD-FKBP12，TtSlyDcys-Her3，TtSlyDcas-Her3，TtSlyDcas，TgSlyDcys-Her3，TgSlyDser-Her3和TgSlyDΔIF。将杂交瘤上清液添加至板，并于室温温育1小时。用HRP标记的F(ab`)2山羊抗小鼠Fcγ(Dianova)检测结合的抗体，并使用ABTS(Roche)作为HRP底物。表3：通过ELISA对选定克隆的评估。针对支架蛋白TtSlyDcas-Her3，TtSlyDcys-Her3，TgSlyDser-Her3和TgSlyDcys-Her3和全长HER3ECD测试克隆以验证它们的HER3二聚化域插入物(HER3β-发夹(SEQIDNO:1))特异性。使用支架蛋白TtSlyDcas和TgSlyDΔIF作为阴性对照。另外，针对HER1，HER2，HER3和HER4的全长ECD测试克隆以验证潜在的交叉反应性。克隆显示结合全长HER3ECD，而且针对全长HER4ECD是交叉反应性的。c)免疫组织化学在IHC中测试所有选定克隆的反应性和特异性。因此用分别编码全长HER1，HER2，HER3或HER4的质粒瞬时转染HEK293细胞。转染后两天，收获此刻正在表达HER1，HER2，HER3或HER4的不同细胞系，随后在福尔马林中固定并在琼脂糖中包埋以产生IHC对照。另外在福尔马林中固定过夜后在石蜡中包埋琼脂糖块。使用未转染的HEK293细胞作为阴性对照，并依照已转染的细胞进行处理。石蜡包埋后，使用切片机制备3μm的薄切片。在玻璃显微镜载玻片上封固切片并干燥2小时。使用VentanaBenchmarkXT进行免疫组织化学染色规程的所有进一步步骤。将载玻片脱蜡，并通过加热1小时实施抗原修复。为了抗原修复，使用Ventana缓冲液CC1。以1μg/ml的浓度使用抗体。为了检测结合的抗体，使用VentanaUltraView检测试剂盒。结果显示于图5。所有三个克隆均显示结合HER3且与HER4交叉反应。检测不到针对HER1和HER2的交叉反应性。d)选定抗HER3杂交瘤的DNA测序为了获得选定杂交瘤克隆的DNA序列，进行5`RacePCR。为了RT-PCR，通过使用总RNA纯化试剂盒(Qiagen)从5x106个细胞制备总RNA。使用5`引发RACEPCR试剂盒(Roche)进行逆转录和PCR。通过凝胶电泳和随后的凝胶纯化纯化自重链和轻链产生的PCR片段。使用TopoZero-Blunt克隆试剂盒(Invitrogen)克隆PCR片段，并转化入感受态细胞。对来自每个杂交瘤的数个克隆进行测序以获得对于选定克隆的一致序列。对M-05-74，M-15-02，M-15-04进行测序，对所有3个克隆产生同样的VH和VL序列。类似地对M-15-03，M-15-05，M-15-08，M-15-09，M-15-11，M-16-01进行测序，对所有克隆也产生同样的VH和VL序列。e)经由FACS的M-05-74的时间依赖性内在化分析使用表达HER3的肿瘤细胞系T47D在FACS中分析选定克隆M-05-74对HER3的结合和内在化。用50ng重组人调蛋白片段(HRG)(SEQIDNO:11)处理5x105个细胞。将包括氨基酸序列SEQIDNO:11的片段克隆入pCDNA.1载体(Invitrogen)。依照Invitrogen描述的方案在FreeStyleTM293-F细胞中表达该HRG片段。(FreeStyleTM293表达系统，目录号K9000-01)。在20mM组氨酸，140mMNaCl；pH6.0中溶解经过纯化的HRG片段，并贮存于-80℃。使用未处理的(-)细胞作为阴性对照。调蛋白诱导的活化后不久将1μgM-05-74添加至细胞。将细胞于37℃温育0，5，15，30，45，60，75，90，105，120，180或240分钟。温育后，将细胞立即放置于冰上。用3mlFACS缓冲液清洗细胞一次，然后用1μgR-藻红蛋白山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗染色30分钟。使用FACSCantoTM流式细胞仪(BDBiosciences)进行流式细胞术。结果是T47D细胞中M-05-74诱导的时间依赖性HER3受体内在化的FACS分析。在有或没有补充重组人调蛋白片段(HRG)的情况下，M-05-74显示结合表达的HER3ECD。M-05-74导致HER3受体在4小时的时间段里内在化。结果显示于图6。同种型对照指示为恒定的水平黑条。在有或无人调蛋白片段(-)和(+HRG)下，M-05-74显示结合表达的HER3ECD。M-05-74在4小时时间段里引起HER3受体内在化。同种型对照指示为恒定的水平黑条。在HRG存在下，抗体诱导的HER3内在化更快(例如在1小时后)。与在HRG缺失下(-)的数值相比，在HRG存在下(+HRG)的HER3内在化多至少25％。实施例3a)HER3抗体的动力学筛选/结合特性依照Schraeml等人(Schraml，M.andM.Biehl，MethodsMolBiol901(2012)171-181)在安装有BiacoreCM5传感器的BIAcore4000仪器上实施动力学筛选。在所有测定法中捕捉测试抗体。系统处于软件版本V1.1控制下。仪器缓冲液是HBS-EP(10mMHEPES(pH7.4)，150mMNaCl，1mMEDTA，0.05％(w/v)P20)。于25℃操作系统。使用EDC/NHS化学依照制造商的用法说明书在流通池1，2，3和4中的点1，2，4和5上固定化10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中的30μg/ml家兔多克隆抗体(RAMIgG(具有Fcγ特异性的家兔抗小鼠IgG)GEHealthcare)。使用1M乙醇胺饱和传感器。在每个流通池中，使用点1-2和点5-4计算参考信号，点3充当空白对照。将抗原(人重组HER3ECD(68kDa)和包含HER3β-发夹肽(SEQIDNO:1)的重组嗜热栖热菌SlyDFKBP-Her3(15kDa))在补充有1mg/mlCMD(羧甲基右旋糖苷，Sigma)以抑制非特异结合的仪器缓冲液中稀释成150nM。在应用它们之前，将杂交瘤培养物上清液在仪器缓冲液中1:5稀释。以30μl/分钟的流速注射稀释的混合物2分钟。监测抗体以响应单位计的捕捉水平(CL)。之后立即以30μl/分钟的流速注射相应抗原3分钟结合时间。之后，记录抗体-抗原复合物解离信号5分钟。通过以30μl/分钟的流速注射10mM甘氨酸-HCl溶液(pH1.7)2分钟来再生传感器。注射抗原结束之前不久记录的信号表示以响应单位计的结合后期(BL)。解离记录结束之前不久记录的信号表示以响应单位计的稳定后期(SL)。测定、计算解离速率常数。用下述公式计算以分钟计的抗体-抗原复合物稳定性：ln(2)/60*kd。用下述公式计算摩尔比：MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)。结合后期(BL)代表在分析物注射结束时的响应单位。测量作为传感器表面上配体捕捉到的抗体的量，作为以响应单位计的捕捉水平(CL)。连同测试的分析物的分子量信息，可计算溶液中抗体和分析物的摩尔比。假使用适当量的抗体配体捕捉水平配置传感器，每个抗体应能够功能性结合溶液中的至少一个分析物，它以摩尔比MR＝1.0代表。然后，摩尔比也是分析物结合的效价模式的指标。对于结合两个分析物的抗体而言，最大效价可以是MR＝2，每个Fab配价对应一个。假使空间限制或功能障碍的分析物结合，摩尔比可指示化学计量下的结合，类似于HER3ECD以其“闭合”构象受到结合的情况。摩尔比测定中的最大测定偏差是MR＝0.2。抗HER3抗体M-05-74的筛选/选择：在一项实验中，用来自不同融合的杂交瘤原代培养物驱动动力学筛选，该融合是自用人重组HER3ECD免疫接种小鼠获得的。目标是选择对HER3异二聚体化域β-发夹肽(SEQIDNO:1)有结合特异性的培养物。作为溶液中的抗原，使用人重组HER3ECD(68kDa)和包含HER3β-发夹肽(SEQIDNO:1)的重组嗜热栖热菌SlyDFKBP-Her3(15kDa)。阳性命中分类为对抗原二者具有结合活性的原代培养物上清液。表4示例性显示原代培养物上清液，从中M-05-74达到这些要求，表明对HER3β-发夹的表位特异性。因此这是筛选结合SEQIDNO:1的HER3发夹的抗HER3抗体的合适方法。表4：自用来自融合的一套杂交瘤原代培养物进行的动力学筛选实验获得的示例性结果，其中抗体M-05-74鉴定为结合HER3ECD和thermoSlyD-Her3构建物内的HER3β-发夹(SEQIDNO:1)二者。已经发现M-05-74在它对人HER3ECD分析物的结合中显示降低的摩尔比(MR＝0.5)，而在其对包含HER3β-发夹(SEQIDNO:1)的分析物嗜热栖热菌SlyDFKBP-Her3的结合中，M-05-74显示提高的摩尔比(MR＝1.1)，指示功能性的化学计量1:1结合及改善的表位可及性(与人HER3ECD相比)。b)HER3抗体M-05-74，M-205和M-208的动力学，为了研究在调蛋白(HRG)缺失和存在下M-05-74的作用模式在其平衡状态，HER3ECD处于它的“闭合构象”，这确实意味着异二聚化HER3β-发夹基序经由非共价相互作用系留至HER3ECD域IV(见图1c和d)。有人提出，“闭合”HER3构象可经由配体调蛋白在特定HER3调蛋白结合位点处结合而开放。这发生在由HER3ECD域I和域III形成的HER3界面。认为通过这种相互作用，HER3受体被活化并转变成它的“开放构象”(见图1b和e)。当这发生时，HER3β-发夹对于所述抗体是可及的。这种作用模式可通过Biacore实验在体外模拟。使用BiacoreT100仪器(GEHealthcare)在动力学上对单克隆抗体评估它们对调蛋白活化的HER3胞外域(HER3_ECD)的行为。依照制造商的用法说明书将CM5系列传感器安装入系统中并在HBS-ET缓冲液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.005％w/vTween20)中标准化。样品缓冲液是补充有1mg/mlCMD(羧甲基右旋糖苷，Sigma#86524)的系统缓冲液。于25℃操作系统。依照制造商的用法说明书使用EDC/NHS化学在所有四个流通池上固定化6500RURAM-Fcγ(Fcγ片段RamIgG的相对单位，GEHealthcare)。使用1M乙醇胺灭活传感器。在动力学上测试相应抗体针对分析物的结合活性。通过于35nM浓度以5μl/分钟注射1分钟来捕捉抗体。流速设置为100μl/分钟。测试的溶液中的分析物是人调蛋白片段(HRG)(SEQIDNO:11)，一种44kDa同二聚体蛋白质(依照实施例2e制备)，人重组HER2ECD(SEQIDNO:10)(69.6kDa)，人重组HER3ECD(SEQIDNO:4)(68kDa)，人重组HER4ECD(SEQIDNO:6)，和各100nM的HER3ECD和HER4ECD(各自与5倍摩尔过量的调蛋白室温温育60分钟，产生HER3ECD-HRG复合物和HER4ECD-HRG复合物(复合物分子量增加))。以0nM，1.1nM，3.7nM，11.1nM，33.1nM和90nM的不同浓度步骤注射溶液中的分析物3.5分钟。监测解离15分钟。在可能的情况下，依照Langmuir拟合评估动力学特征。表5a：M-05-74(＝M-074)，M-205和M-208的SPR解析的动力学数据MR＝摩尔比，BL＝结合后期，CL＝捕捉水平；n.d.＝检测不到＝无结合。用下述公式计算摩尔比：MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)。抗体M-205是一种鼠单克隆抗体，其具有针对在HER3ECD调蛋白结合位点附近的表位的结合活性(在WO2011/076683中描述为Mab205.10.2)。M-205在它在HER3ECD上的结合位点周围与调蛋白竞争。抗体M-208是一种鼠单克隆抗体，其具有针对HER3ECD域IV的结合活性。M-208独立于HER3ECD构象状态结合HER3ECD。由于HER3发夹处于其“开放”构象时更好的可及性，M-05-74(＝表5中的M-074)以改善的动力学结合处于其活性“开放”构象(在配体(例如调蛋白HRG)存在下)的HER3ECD。MR要高至少两倍。对于阴性对照分析物调蛋白β(HRG)和HER2胞外域(HER2_ECD)没有观察到抗体结合(n.d.)。测试的抗体显示均结合Her3-ECD(HER3_ECD)，但是具有强烈不同的BL数值。M-05-74以比克隆M-205和M-208更慢的结合速率常数ka＝1.3E+041/Ms和更小的BL(70RU)结合处于其“闭合”构象的HER3ECD，克隆M-205具有更快的ka＝4.9E+041/Ms和BL时高的信号幅度(235RU)，M-208具有更快的ka＝5.8E+041/Ms和同样BL时高的信号幅度(367RU)。这暗示结合的化学计量(MR)，其中M-205(MR＝1.0)和M-208(MR＝1.0)均对HER3-ECD显示功能性1:1结合，而M-05-74显示非功能性结合(MR＝0.2)。这里猜想M-05-74对HER3ECD的这种相互作用是对一部分有结构障碍的HER3ECD分析物的残留结合。这种猜想也适用于M-05-74对HER4ECD的相互作用，其也显示非功能性结合，其中BL为27RU且MR为0.1。一个令人惊讶的结果是M-05-74结合速率常数ka从“闭合”HER3ECD到“开放”HER3ECD/调蛋白复合物升高超过4倍(接近5倍)；从ka＝1.3E+041/Ms(Her3_ECD)到ka＝6.3E+041/Ms(Her3-ECD-HRG)。所以，M-05-74以4.0或更高的在调蛋白存在下(Ka(+调蛋白))和在调蛋白缺失下(Ka(-调蛋白))的结合常数(Ka)之比(Ka(+调蛋白)/Ka(-调蛋白)＝ka(Her3-ECD-HRG)/ka(Her3-ECD)＝6.3E+04[1/Ms]/1.3E+04[1/Ms]＝4.85)结合HER3-ECD。由此，摩尔比提高3倍，指示现M-05-74与HER3ECD调蛋白复合物在1:1的相互作用。因此，M-05-74以3.0的在调蛋白存在下(MR(+调蛋白))和在调蛋白缺失下(MR(-调蛋白))的摩尔比MR之比(MR(+调蛋白)/MR(-调蛋白)＝0.6/0.2＝3)结合HER3-ECD。这对于HER4ECD/调蛋白复合物也是有效的，其中摩尔比提高6倍，指示M-05-74与HER4ECD调蛋白复合物的1:1相互作用。因此，M-05-74以6.0的在调蛋白存在下(MR(+调蛋白))和在调蛋白缺失下(MR(-调蛋白))的摩尔比MR之比(MR(+调蛋白)/MR(-调蛋白)＝0.6/0.1＝6)结合HER4-ECD。而且令人惊讶的是，M-05-74结合速率常数ka从“闭合”HER4ECD到“开放”HER4ECD/调蛋白复合物升高超过20倍，从ka＝6.7E+031/Ms(Her3_ECD)到ka＝1.6E+05。所以，M-05-74以20.0或更高的在调蛋白存在下(Ka(+调蛋白))和在调蛋白缺失下(Ka(-调蛋白))的结合常数(Ka)之比(Ka(+调蛋白)/Ka(-调蛋白)＝ka(Her4ECD-HRG)/ka(Her4-ECD)＝6.7E+04[1/Ms]/1.6E+05[1/Ms]＝23.88)结合HER4-ECD。正如预期的，调蛋白置换者M-205降低其BL值和摩尔比。摩尔比降低2.5比，从完全功能性的1:1相互作用MR＝1.0(Her3-ECD)及BL时的235RU变成不太功能性的MR＝0.4(Her3-ECD-HRG)及BL时的164RU。这指示由于过量调蛋白的竞争性存在所致功能性损失。结合HER3ECD域IV的抗体M-208保持完全不受调蛋白存在的影响。未能检测到摩尔比MR的显著变化。图7显示抗HER3/HER4β-发夹抗体M-05-74对调蛋白活化的HER3ECD复合物的结合模式。M-05-74(见曲线1)捕捉并防止调蛋白从复合物解离。M-05-74是调蛋白的陷阱(“调蛋白池”)。M-05-74不与调蛋白竞争HER3ECD上的结合位点。为了比较，显示了M-08-11(曲线2)；M-08-11(VH和VL见SEQIDNO:51和52)是没有HER4ECD和HER4β-发夹交叉反应性的另一种HER3β-发夹结合者，它结合与M-05-74不同的表位。在另一项实验中，测量中还包括HER1ECD，T.T.SlyD-cysHer3和无HER3β-发夹的T.T.SlyD-cas–结果显示于表5b，它实质上揭示了M-05-74的相同结合特性。给BiacoreT200仪器(GEHealthcare)安装CM5系列传感器。依照制造商的用法说明书将传感器在HBS-ET缓冲液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％w/vTween20)中标准化。样品缓冲液是补充有1mg/mlCMD(羧甲基右旋糖苷，Sigma#86524)的系统缓冲液。于25℃操作系统。依照制造商的用法说明书使用胺偶联EDC/NHS化学在所有四个流通池上固定化6500RURAM-Fcγ(Fcγ片段RamIgG的相对单位，GEHealthcare)。使用1M乙醇胺灭活传感器。通过以10μl/分钟注射1分钟在传感器表面上捕捉单克隆抗体(CL，捕捉水平)。测量浓度依赖性动力学。以0nM，1.1nM，3.3nM，2x10nM，30nM和90nM注射分析物HER1-ECD，HER2-ECD，HER3-ECD，HER4-ECD，T.T.SlyD-cysHer3和T.T.SlyD-cas中每一种的浓度系列。以0nM，17nM，2x50nM，150nM和450nM注射调蛋白β(HRG)，将90nMHER3ECD和90nMHER4ECD与5倍摩尔过量的HRGβ一起预温育2小时，并以0nM，1.1nM，3.3nM，2x10nM，30nM和90nM的HER浓度步骤注射。以100μl/分钟流速注射所有分析物5分钟结合时间和10分钟解离时间。通过以10μl/分钟注射10mM甘氨酸pH1.73分钟使传感器捕捉系统再生。在可能的情况中使用BiacoreT200评估软件评估动力学数据。使用Langmuir拟合模型评估HER3-ECD，HER4-ECD和T.T.SlyD-cysHer3动力学。依照Langmuir拟合模型评估M-05-74的HER-3-ECD-HRG和HER-4-ECD-HRG动力学。表5b：M-05-74的SPR解析动力学数据MR＝摩尔比，BL＝结合后期，CL＝捕捉水平；n.d.＝检测不到＝无结合。M-05-74以1:1的化学计量结合HER3-ECD-HRG和HER4-ECD-HRG，以10:1的化学计量结合无活性HER3-ECD和HER4-ECD。M-05-74以比HER4-ECD和HER4-ECD-HRG更高的亲和力结合HER3-ECD和HER3-ECD-HRG。M-05-74不与HER-1，HER-2和HRG相互作用。M-05-74以1:2的化学计量结合T.T.SlyD-cysHer3且不与T.T.SlyD-cas相互作用。实施例4抗HER3抗体M-05-74的表位作图和M-05-74与独特表位(HER3和HER4β-发夹)的作用模式分析使用Biacore2000(GEHealthcare)仪器对可及性表位克隆培养物上清液评估它们的结合特异性。依照制造商的用法说明书将CM5传感器安装入系统并在HBS-ET缓冲液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.005％w/vTween20)中标准化。样品缓冲液是补充有1mg/mlCMD(羧甲基右旋糖苷，Sigma)的系统缓冲液。于37℃操作系统。依照制造商的用法说明书使用EDC/NHS化学在所有四个流通池上固定化10000RURAM-Fcγ(Fcγ片段家兔抗小鼠IgG的相对单位，JacksonLaboratories)。使用1M乙醇胺灭活传感器。以10μl/分钟的流速在所有流通池上捕捉一抗50nM抗HER3M-05-741分钟。流速设置为30μl/分钟，并注射IgG封闭溶液(50μg/mlIgG(20:2:1IgG1-Fcγ，IgG2a-Fcγ，IgG2b)，Roche)5分钟。以1.5μM注射抗原HER3ECD3分钟。之后，以30μl/分钟注射100nM抗HER3二抗(a)M-05-74，b)来自WO97/35885的8B8(在图中称作GT)，c)结合HER3域IV的M-208，和d)M-08-11；没有HER4ECD和HER4β-发夹交叉反应性的另一种HER3β-发夹结合者)3分钟。使用以30μl/分钟三次连续注射10mM甘氨酸pH1.760秒来实现传感器表面的酸性再生。通过二次M-05-74注射的再结合(它再饱和了已解离的一次M-05-74)来定义测量噪声。实验显示(见图8)M-208和M-05-74占据HER3ECD上的不同表位，因为在M-05-74存在下，二次M-208信号完全饱和HER3ECD。M-08-11结合被M-05-74的存在完全封闭。M-08-11二次信号甚至低于噪声。尽管如此，M-08-11结合与M-05-74不同的表位，因为M-08-11不结合人HER4ECD和HER4β-发夹。(还见下文关于HER3和HER4的β-发夹的精确表位作图数据)。在M-05-74存在下，8B8(＝GT)二抗产生显著的信号，高于噪声。因此，8B8(＝GT)抗体结合与M-05-74和M-08-11不同的表位。M-05-74具有独特表位和作用模式使用BiacoreB3000仪器(GEHealthcare)在动力学上以HER3ECD的“闭合”构象和调蛋白活化的HER3ECD的“开放”构象评估克隆培养物M-05-74和抗体8B8(来自WO97/35885，在图中称作GT)。依照制造商的用法说明书将CM5系列传感器安装入系统并在HBS-ET缓冲液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.005％w/vTween20)中标准化。样品缓冲液是补充有1mg/mlCMD(羧甲基右旋糖苷)的系统缓冲液。于25℃操作系统。依照制造商的用法说明书使用EDC/NHS化学在所有流通池上固定化10000RURAM-Fcγ(Fcγ片段家兔抗小鼠IgG的相对单位，JacksonLaboratories)。使用1M乙醇胺灭活传感器。以100μl/分钟以0nM，1.1nM，3.7nM，11.1nM，33.1nM和90nM的不同浓度步骤注射溶液中的分析物2分钟。监测解离5分钟。使用以30μl/分钟三次连续注射10mM甘氨酸pH1.760秒来实现传感器表面的酸性再生。依照Langmuir拟合评估动力学数据。表6：M-05-74的Langmuir动力学，与8B8(GT)比较。8B8具有更低的抗原复合物稳定性(t/2解离)和更少的功能性(MR)。MR＝摩尔比，BL＝结合后期，CL＝捕捉水平在上文表中，列出了抗体克隆M-05-74和抗体8B8的动力学数据。M-05-74以高功能性MR＝0.8结合调蛋白活化的HER3ECD。M-05-74起调蛋白陷阱的作用(还可见图Biacore传感图实施例3b和图7)。8B8抗体的复合物稳定性较弱，t1/2解离＝0.8分钟。8B8以MR＝0.4结合。未能鉴定出8B8抗体和调蛋白解离的分开解离相。调蛋白以相同的时帧和相同的速率完全解离，就像8B8。8B8抗体没有延迟调蛋白解离。M-05-74以KD＝27nM功能性地结合(MR＝1.5)包含HER3β-发夹SEQIDNO:1的嗜热栖热菌SlyDFKBP-Her3。由于抗体8B8不结合包含HER3β-发夹的嗜热栖热菌SlyDFKBP-Her3融合多肽，因此这种抗体靶向与M-05-74不同的表位。图9是抗HER3/HER4抗体M-05-74，抗HER3抗体M-08-11和抗HER3抗体8B8(来自WO97/35885)的Biacore传感图的重叠图，显示不同结合作用模式。抗HER3/HER4抗体M-05-74诱捕调蛋白活化的HER3ECD(1)(t1/2解离＝18分钟)并充当调蛋白池。抗HER3抗体M-08-11HER3(无HER4ECD和HER4β-发夹交叉反应性的β-发夹结合者)延迟调蛋白解离(2)并产生复杂的两状态动力学。8B8抗体(3)不诱捕调蛋白，而且也不延迟调蛋白从HER3ECD/调蛋白复合物解离。既然这是完美的Langmuir相互作用，因此调蛋白/HER3ECD复合物以完整的复合物从8B8抗体快速且完全解离。在图10中显示这些结合作用模式的示意图：1：M-08-11结合调蛋白活化的HER3ECD并诱导延迟的调蛋白解离，其中M-08-11停留在HER3ECD受体复合物中。2：M-05-74结合调蛋白活化的HER3ECD。调蛋白被诱捕在复合物中且抗体停留在复合物中。3：8B8结合调蛋白活化的HER3ECD。整个复合物从抗体解离。基于肽的二维表位作图在另一个实施方案中，使用CelluSpotsTM合成和表位作图技术进行基于肽的表位作图实验以表征HER3ECD表位。依靠与人HER1ECD，HER2ECD，HER3ECD和HER4ECD肽发夹的序列对应的重叠的，固定化的肽片段(长度：15个氨基酸)的文库进行表位作图。在图11中显示表位作图的策略和丙氨酸扫描办法。调查了HER1(EGFR)ECD，HER2ECD，HER3ECD和HER4ECD的肽发夹序列(β-发夹)，包括它们的结构埋藏(结构上的)。用丝氨酸替换半胱氨酸。为了抗体经结合此类β-发夹的抗体选择，通过SEQIDNO:1和SEQIDNO:2定义HER3和HER4的β-发夹。每种合成肽位移一个氨基酸，即，它有14个氨基酸分别与之前和之后的肽重叠。为了制备肽阵列，采用IntavisCelluSpotsTM技术。在这种办法中，用自动化合成仪(IntavisMultiPepRS)在经修饰纤维素圆盘上合成肽，合成后溶解。然后将共价连接至高分子纤维素的个别肽的溶液点到经过包被的显微镜载玻片上。在384孔合成板中在氨基修饰的纤维素圆盘上利用9-芴甲氧羰酰(Fmoc)化学逐步进行CelluSpotsTM合成。在每个偶联循环中，用DMF中的DIC/HOBt溶液活化相应的氨基酸。在偶联步骤之间，用乙酸酐、二异丙基乙胺和1-羟基苯并三唑的混合物给未反应的氨基基团加帽。合成完成后，将纤维素圆盘转移至96孔板并用三氯乙酸(TFA)、二氯甲烷、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合物处理以进行侧链脱保护。去除切割溶液后，用TFA、TFMSA、TIS和水的混合物溶解结合有纤维素的肽，用二异丙醚沉淀，并在DMSO中重悬浮。随后使用Intavis载玻片点样机器人将肽溶液点到IntavisCelluSpotsTM载玻片上。为了表位分析，用乙醇然后用Tris缓冲盐水(TBS；50mMTris，137mMNaCl，2.7mMKCl，pH8)清洗如上所述制备的载玻片，之后用5mL10xWestern封闭试剂(RocheAppliedScience)、TBS中的2.5g蔗糖、0.1％Tween20于4℃封闭16小时。用TBS和0.1％Tween20清洗载玻片，之后与1μg/mL相应IGF1抗体一起在TBS和0.1％Tween20中于环境温度温育2小时，随后用TBS+0.1％Tween20清洗。为了检测，将载玻片与抗家兔/抗小鼠HRP-二抗(TBS-T中1:20000)一起温育，接着与化学发光底物鲁米诺(luminol)一起温育并用LumiImager(RocheAppliedScience)显现。对ELISA阳性SPOT定量，并通过相应肽序列的指派鉴定抗体结合表位。如图12中所绘，M-05-74显示具有氨基酸序列VYNKLTFQLEP(SEQIDNO:43)的HER3ECD表位及与具有氨基酸序列VYNPTTFQLE(SEQIDNO:44)的HER4ECD表位的交叉反应性，对EGFR和HER2ECD中的发夹基序没有可检测信号。用8B8抗体根本没有可检测信号，因此8B8抗体靶向与发夹肽基序不同的表位。M-08-11显示具有氨基酸序列PLVYNKLTFQLE的HER3ECD特异性表位，与HER家族的其它发夹序列没有可检测的交叉反应性。在图13中，通过丙氨酸扫描鉴定为对抗HER3/HER4抗体M-05-74结合其HER3ECD结合表位VYNKLTFQLEP(SEQIDNO:43)及其HER4ECD结合表位VYNPTTFQLE(SEQIDNO:44)贡献最大的氨基酸以下划线/粗体标示。实施例5在HER3抗体存在下HRG对HER3-ECD的结合(ELISA)将链霉亲和素包被的96孔板与含有带SBP标签的HER3-ECD的细胞培养物上清液一起于4℃温育。次日用清洗缓冲液(PBS+0.05％Tween-20)清洗孔3次，并用含有1％BSA的PBS封闭1小时。用清洗缓冲液再清洗3次后，将40μl抗体溶液(在Delfia结合缓冲液中)作为预期终浓度(10-3至103nM，或者10-4至102nM)的2x贮液添加至每个孔。立即添加40μl20nM铕标记的调蛋白-β(PeproTech，目录号100-03)以实现终浓度10nM。将板在摇床上于室温温育2小时。用Delfia清洗缓冲液清洗3次后，添加Delfia增强溶液，并在摇床上温育15分钟(避光)。最后，使用时间解析荧光测量方案在TecanInfiniteF200读数仪上测量板。M-05-74(即图14中的M-074)的结合可促进HRG结合HER3-ECD直至在650的信号达到平台。结果显示于图14。实施例6a)ZR-75-1细胞中对HER3磷酸化的抑制依照下述方案在ZR-75-1细胞中实施测定法：在含10％FCS的RPMI1640中以500,000个细胞/孔将细胞接种入聚D-赖氨酸包被的6孔板中。温育24小时。通过吸取去除培养基，与500μl/孔含0.5％FCS的RPMI1640一起温育过夜。在500μl含0.5％FCS的RPMI1640中添加抗体。温育1小时。添加调蛋白-β(PeproTech，目录号100-03)(终浓度500ng/ml)10分钟。为了裂解细胞，去除培养基，添加80μl冰冷的Triton-X-100细胞裂解缓冲液，并在冰上温育5分钟。将裂解物转移入1.5ml反应管中并于4℃以14000rpm离心15分钟后，将上清液转移入新鲜反应管中。将在SDS加载缓冲液中含有等量蛋白质的样品在SDS-PAGE上分开，并进行印迹，使用半干Western印迹至硝酸纤维素膜。用1xNET缓冲液+0.25％明胶封闭膜1小时，并分别用抗体αPhospho-HER3/ErbB3(Tyr1289)(21D3)(CellSignaling，#4791)和抗体αErbB3(C-17)(SantaCruz，#sc-285)检测pHER3和HER3。在清洗及用偶联有POD的二抗检测信号后，密度法扫描条带。抗HER3抗体M-05-74对ZR-75-1细胞中的受体磷酸化的百分比(％)抑制显示于下文表7。表7：对ZR-75-1细胞中HER3磷酸化的％抑制b)二价亲本M-05-74和M-05-74的Fab片段(Fab-74)对HER3磷酸化的抑制将MCF-7细胞接种入24孔板(1mlRPMI，10％FCS，3x105个细胞每孔)，并于37℃以5％CO2温育过夜。24小时后，用1ml含有0.5％FCS的培养基更换培养基。48小时后，添加抗体至终浓度10μg/ml，1μg/ml和0.1μg/ml(M-05-74)和6.66μg/ml，0.66μg/ml和0.066μg/ml(Fab-074)。将板于37℃温育50分钟，然后添加调蛋白-β(PeproTech，目录号100-03)至终浓度500ng/ml。将板于37℃以5％CO2再温育10分钟。用PBS清洗细胞，并在40μl含有抑肽酶(10μg/ml)，原钒酸盐(0.4mM)，苯甲磺酰氟(1mM)的Triton裂解缓冲液(1％Triton)中裂解。将26μl收集的裂解物转移至反应管，并添加14μl样品缓冲液(NuPAGELDS样品缓冲液4x，NuPAGE样品还原剂10x)。将样品于70℃温育10分钟，然后通过SDS-PAGE(NuPAGE，4-12％Bis-Tris微型胶)分析。使用iBlot干印迹系统(Invitrogen)实施电印迹。将硝酸纤维素膜与phosphoHER3抗体(αPhosphoHer3，Cellsignaling目录号4791，家兔1:1000)一起温育，接着与缀合有HRP的二抗(山羊抗家兔1:5000，BioRad目录号170-6515)一起温育。使用ECL检测试剂(AmershamRPN2209)在X射线胶片(RocheLumi-Film化学发光检测胶片11666657001)上显现信号。以等摩尔量调查抗HER3抗体M-05-74(自杂交瘤纯化的全长)和该抗体的Fab片段Fab-74(通过全长M-05-74的木瓜蛋白酶切割获得)。通过抗体的木瓜蛋白酶消化来生成Fab片段。简言之，给1ml含有大约2mg/ml抗体的溶液补充25mM半胱氨酸和70μg木瓜蛋白酶(Roche)。于37℃温育1.5小时后，通过添加碘乙酰胺来终止消化反应，并通过MabSelectSure(GEHealthcare)来纯化反应混合物。通过大小排阻层析(Superdex200；GEHealthcare)进一步纯化含有Fab的流出级分。抗HER3抗体对MCF7细胞中的受体磷酸化的百分比(％)抑制汇总于下文表8。抗体M-05-74(来自杂交瘤的全长)和这种抗体的Fab片段Fab-74能以等摩尔浓度以相当的程度抑制HER3磷酸化。表8：对MCF-7细胞中HER3磷酸化的％抑制实施例7MCF7细胞中HER2/HER3异二聚体的抑制(免疫沉淀和Western印迹)将MCF-7细胞接种入6孔板(2mlRPMI，10％FCS，8x105个细胞每孔)并生长过夜。次日用2ml含有0.5％FCS的饥饿培养基更换培养基。第三天添加抗体至终浓度10μg/ml并将平板于37℃温育。50分钟后，添加调蛋白-β(PeproTech，目录号100-03)至终浓度500ng/ml并将板于37℃再温育10分钟。用PBS清洗细胞并在250μl含有1％毛地黄皂苷的Triton裂解缓冲液中裂解。将60μl收集的裂解物转移至反应管，并与40μl偶联有抗体的Sepharose(Herceptin或HER3抗体#208)和500μl含有0.3％毛地黄皂苷的缓冲液一起温育。将反应混合物在轮状旋转器上于4℃温育过夜。次日用500μl含有0.3％毛地黄皂苷的缓冲液清洗反应混合物3次。最后一次清洗后，丢弃上清液，并添加10μl4x加载缓冲液。将管于70℃温育10分钟，随后将上清液加载到凝胶上进行SDS-PAGE。在随后的半干Western印迹后，将含有用HER2抗体免疫沉淀的样品的膜与抗HER3/HER4抗体M-05-74(图15中的M-074)一起温育，反之亦然。然后将膜与缀合有HRP的二抗一起温育，并将ECL信号转移到X-射线胶片上。结果显示于图15，显示M-05-74对HER2/HER异二聚体形成(HER2/HER异二聚化)的强抑制。实施例8MDA-MB-175细胞中M-05-74对肿瘤细胞增殖的抑制在细胞增殖测定法中使用MDA-MB-175细胞(VII人乳腺癌细胞，ATCC目录号HTB-25)评估HER3抗体M-05-74的抗肿瘤功效。用含有10％FCS的DMEM/F12细胞培养基将20,000个细胞每孔接种入无菌96孔组织培养板，并于37℃±1℃及5％±1％CO2温育1天。该细胞是缓慢生长细胞，倍增时间大约3天。以稀释系列添加抗HER3抗体，并再温育6天。然后使用读出评估细胞存活力。计算EC50值。表9：MDA-MB-175细胞中M-05-74对肿瘤细胞增殖的抑制的EC50抗体EC50[μg/ml]M-05-745,8实施例9抗HER3抗体M-05-74的体内抗肿瘤功效可以在对SCID米色移植的多种肿瘤起源(例如SCCHN和胰腺癌)的基于细胞的模型中检测抗HER3抗体M-05-74(M-074)的体内抗肿瘤功效。例如，显示了SCCHN异种移植物模型FaDu(基于细胞系的)的数据。测试试剂作为来自Roche(Penzberg，Germany)的储存溶液提供M-05-74，它是自杂交瘤细胞表达和纯化的。抗体缓冲液包括组氨酸。在注射前在缓冲液中自储液恰当稀释抗体溶液。细胞系和培养条件FaDu人HNSCC细胞最初得自ATCC。于37℃在水饱和气氛中以5％CO2在补充有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠和0.1mMNEAA的MEMEagle培养基中例行培养该肿瘤细胞系。用胰蛋白酶/EDTA实施培养物传代，每三天进行1x拆分。动物雌性SCID米色或裸鼠购自饲养者(例如CharlesRiver，Sulzfeld，Germany)，并依照承诺的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)在无特定病原体条件下维持，12小时光照/12小时黑暗的日周期。实验性研究方案得到了当地政府的审查和批准。到达后，将动物在动物设备的检疫部分中维持一周以适应新环境及进行观察。定期进行连续健康监测。随意提供固定食物(ProvimiKliba3337)和水(酸化的pH2.5-3)。每天对动物监控临床症状和不利作用检测。对于贯穿实验的监测，记录动物的体重。在细胞移植后在动物随机化后开始动物处理，此时中值肿瘤尺寸为约100-150mm3。以单一药剂，10mg/kg，i.p.，q7d，每周一次施用抗体，取决于模型持续数周。在同日施用相应媒介。研究第10-24天用抗体M-05-74处理携带FaDuHNSCC异种移植物的小鼠。结果是，H-74抗体处理显示显著的抗肿瘤功效，几乎s.c.FaDu异种移植物肿瘤停滞。肿瘤生长抑制(TGI)计算为89％。M-05-74(10mg/kg，q7dx3，i.p.)处理导致几乎FaDu肿瘤停滞。结果显示于图17，其中M-05-74称作M-074。实施例10M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(命名为M-07-54-PE)的产生基于序列SEQIDNO:45，46，47，48(或49)，M-05-74的Fab片段，PE24变体，和缀合至假单胞菌外毒素变体PE24LR8M的M-05-74Fab片段的表达、纯化和复性。Fab的表达(例如为了分选酶偶联)–表达载体为了表达描述的Fab片段，将基于有或无CMV-内含子A启动子的cDNA组织或基于有CMV启动子的基因组组织的表达质粒的变体应用于瞬时表达(例如HEK293-F)细胞。除了抗体表达盒之外，载体还包含：-复制起点，其允许这种质粒在大肠杆菌中复制，和-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。抗体基因的转录单元由下述元件构成：-在5’端的一个或多个独特限制性位点，-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，-接着是在cDNA组织的情况中，内含子A序列，-人抗体基因的5’非翻译区，-免疫球蛋白重链信号序列，-作为cDNA或作为基因组组织具有免疫球蛋白外显子-内含子组织的人抗体链-具有多腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和-在3’端的一个或多个独特限制性位点。通过PCR和/或基因合成产生包含如下文所述抗体链的融合基因，并通过已知重组方法和技术通过连接(例如使用相应载体中的独特限制性位点)相应的核酸区段进行装配。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。为了瞬时转染，通过来自经过转化的大肠杆菌培养物的质粒制备物(NucleobondAX，Macherey-Nagel)制备较大量的质粒。细胞培养技术如CurrentProtocolsinCellBiology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.andYamada，K.M.(eds.)，JohnWiley&Sons，Inc中所述使用标准细胞培养技术。通过在如下文所述悬浮培养的HEK29-F细胞中瞬时共转染重链和轻链的表达质粒来表达Fab片段。HEK293-F系统中的瞬时转染通过依照制造商的用法说明书使用HEK293-F系统(Invitrogen)用相应质粒(例如编码重链和经修饰重链，以及相应的轻链和经修饰轻链)瞬时转染来产生Fab片段。简言之，用四种表达质粒和293-FreeTM(Novagen)或Fectin(Invitrogen)的混合物转染在摇瓶或搅拌型发酵罐中在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)。对于2L摇瓶(Corning)，以1.0E*6个细胞/mL的密度在600mL中接种HEK293-F细胞，并以120rpm，8％CO2温育。次日，以大约1.5E*6个细胞/mL的细胞密度用大约42mL下述溶液的混合物转染细胞：A)20mL含有分别编码重链或经修饰重链和相应轻链(等摩尔比)的600μg总质粒DNA(1μg/mL)的Opti-MEM(Invitrogen)和B)20mlOpti-MEM+1.2mL293-Free(Novagen)或Fectin(2μl/mL)。根据葡萄糖消耗，在发酵过程期间添加葡萄糖溶液。5-10天后收获含有分泌抗体的上清液，并从上清液直接纯化抗体，或者冷冻并保存上清液。关于分选酶偶联表达载体，假单胞菌外毒素变体PE24-LR8M的表达为了表达PE24-LR8M，使用大肠杆菌表达质粒。除了假单胞菌外毒素A域III的表达盒之外，载体还包含：-来自载体pBR322的复制起点，用于在大肠杆菌中复制(依照Sutcliffe，G.，etal.，Quant.Biol.43(1979)77-90)，-来自大肠杆菌的lacI阻遏基因(Farabaugh，P.J.，Nature274(1978)765-769)，-编码乳清苷5’-磷酸脱羧酶(Rose，M.etal.，Gene29(1984)113-124)的酿酒酵母URA3基因，其允许通过大肠杆菌pyrF删除菌株(尿嘧啶营养缺陷型)的互补进行质粒选择。毒素基因的转录单元由下述元件构成：-在5’端的一个或多个独特限制性位点，-T5杂合启动子(依照Bujard，H.，etal.，Methods.Enzymol.155(1987)416-433和Stueber，D.，etal.，Immunol.MethodsIV(1990)121-152的T5-PN25/03/04杂合启动子)，包括依照Stueber，D.，etal.(见前文)的合成核糖体结合位点，-具有N-末端偶联标签，接着是弗林蛋白酶位点的假单胞菌外毒素A域III(SEQIDNO:45，假单胞菌外毒素变体PE24LR8M_3G，包括用于分选酶偶联的GGG接头)，-两个噬菌体衍生转录终止子，λ-T0终止子(Schwarz，E.，etal.，Nature272(1978)410-414)和fd终止子(BeckE.andZink，B.，Gene1-3(1981)35-58)，-在3’端的一个或多个独特限制性位点。假单胞菌外毒素A构建物变体PE24-LR8M_3G在大肠杆菌补料-分批工艺中在化学成分限定培养基上的培养和表达为了表达PE24-LR8M_3G_Ecoli(25kDa)，采用通过大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)的互补实现无抗生素的质粒选择的大肠杆菌宿主/载体系统(EP0972838和US6,291,245)。通过用表达质粒电穿孔来转化大肠杆菌K12菌株。经过转化的大肠杆菌细胞首先于37℃在琼脂板上生长。将从此板挑取的一个菌落转移至3mL滚瓶培养，并于37℃生长至光密度1-2(以578nm测量)。然后将1000μl培养物与1000μl无菌86％甘油混合，并立即于-80℃冷冻，供长时间贮存。首先在小规模摇瓶实验中验证这个克隆的正确产物表达并用SDS-PAGE分析，之后转移至10L发酵罐。预培养：为了预发酵，使用化学成分限定培养基。对于预发酵，用来自原始种子库安瓿的1.0ml接种带4块挡板的1000mlErlenmeyer摇瓶中的220ml培养基。在旋转摇床上于32℃和170rpm实施培养8小时直至获得2.9的光密度(578nm)。使用100ml预培养物接种10L生物反应器的分批培养基。发酵：为了在10LBiostatC，DCU3发酵罐(Sartorius，Melsungen，Germany)中发酵，使用化学成分限定分批培养基。在去离子水中溶解所有成分。用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/lL-甲硫氨酸的12.5％(w/v)NH3水溶液。以4.2L无菌分批培养基加来自预培养的100ml接种物开始，于31℃，pH6.9±0.2，800mbar回压和起始通气速率10L/分钟实施分批发酵。通过提高搅拌器速度至1500rpm贯穿发酵将相对溶氧值(pO2)保持于50％。在最初补充的葡萄糖耗尽后，根据溶氧值急剧升高指示，将温度改变成25℃，15分钟后发酵进入以两种补料(分别是60和14g/h)开始的补料-分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预定补料概况逐步升高，在7小时内从60至最终的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定升高至20L/分钟。通过在光密度为大约120时添加2.4gIPTG来诱导重组PE24-LR8M_3G_Ecoli蛋白表达。靶蛋白在细胞质内可溶性表达。培养24小时后，光密度达到209，将整个培养液冷却至4-8℃。用流过式离心机(13,000rpm，13L/h)经离心收获细菌，并将获得的生物质贮存于-20℃直至进一步加工(细胞破碎)。产量为67.5g干细胞每升。产物形成的分析：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析取自发酵罐的样品，一份在诱导前，其它在诱导蛋白质表达后的专门时间点。在5mLPBS缓冲液中悬浮相同量的来自每份样品的细胞(OD靶＝10)，并在冰上经超声波处理进行破碎。然后将100μL每份悬浮液离心(15,000rpm，5分钟)，取出每份上清液并转移至分开的管形瓶。这是为了区分可溶性和不溶性的表达的靶蛋白。对每份上清液(＝可溶性蛋白质组分)和每份团粒(＝不溶性蛋白质组分)分别添加100μL和200μLSDS样品缓冲液(Laemmli，U.K.，Nature227(1970)680-685)。将样品在剧烈混合下于95℃加热15分钟以溶解及还原样品中的所有蛋白质。冷却至室温后，将5μL每份样品转移至4-20％TGXCriterion无染料聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)。另外施加5μl分子量标准品(PrecisionPlusProteinStandard，Bio-Rad)。于200V运行电泳60分钟，之后将凝胶转移至GelDOCEZ成像仪(Bio-Rad)并用UV照射加工5分钟。使用ImageLab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。通过比较产物条带的体积与分子量标准品的25kD条带的体积进行蛋白质表达的相对定量。抗体片段轻链构建物(VL)和抗体片段重链假单胞菌外毒素A变体融合物(Fab-PE24)在大肠杆菌补料-分批工艺中在化学成分限定培养基上的培养和表达为了表达Fab-轻链(23.4kDa)和Fab-重链PE24融合物(48.7kDa)，采用通过大肠杆菌营养缺陷型(PyrF)的互补实现无抗生素的质粒选择的大肠杆菌宿主/载体系统(EP0972838和US6,291,245)。通过用相应表达质粒电穿孔来转化大肠杆菌K12菌株。经过转化的大肠杆菌细胞首先于37℃在琼脂板上生长。对于每项转化，将从此板挑取的一个菌落转移至3mL滚瓶培养，并于37℃生长至光密度1-2(以578nm测量)。然后将1000μl培养物与1000μl无菌86％甘油混合，并立即于-80℃冷冻，供长时间贮存。首先在小规模摇瓶实验中验证这些克隆的正确产物表达并用SDS-PAGE分析，之后转移至10L发酵罐。预培养：为了预发酵，使用化学成分限定培养基。对于预发酵，用来自原始种子库安瓿的1.0ml接种带4块挡板的1000mlErlenmeyer摇瓶中的220ml培养基。在旋转摇床上于37℃和170rpm实施培养9小时直至获得7-8的光密度(578nm)。使用100ml预培养物接种10L生物反应器的分批培养基。发酵(RC52#003)：为了在10LBiostatC，DCU3发酵罐(Sartorius，Melsungen，Germany)中发酵，使用化学成分限定分批培养基。用于pH调节的碱溶液是补充有11.25g/lL-甲硫氨酸的12.5％(w/v)NH3水溶液。以4.2L无菌分批培养基加来自预培养的100ml接种物开始，于31℃，pH6.9±0.2，800mbar回压和起始通气速率10L/分钟实施分批发酵。通过提高搅拌器速度至1500rpm贯穿发酵将相对溶氧值(pO2)保持在50％。在最初补充的葡萄糖耗尽后，根据溶氧值急剧升高指示，将温度改变成37℃，15分钟后发酵进入以两种补料(分别是60和14g/h)开始的补料-分批模式。补料2的速率保持恒定，而补料1的速率以预定补料概况逐步升高，在7小时内从60至最终的160g/h。当二氧化碳废气浓度水平高于2％时，通气速率在5小时内从10恒定升高至20L/分钟。通过在光密度为大约40时添加2.4gIPTG来诱导重组靶蛋白作为位于细胞质中的不溶性包涵体的表达。培养24小时后，光密度达到185，将整个培养液冷却至4-8℃。用流过式离心机(13,000rpm，13L/h)经离心收获细菌，并将获得的生物质贮存于-20℃直至进一步加工(细胞破碎)。产量为40-60g干细胞每升。产物形成的分析：用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析取自发酵罐的样品，一份在诱导前，其它在诱导蛋白质表达后的专门时间点。在5mLPBS缓冲液中悬浮相同量的来自每份样品的细胞(OD靶＝10)，并在冰上经超声波处理进行破碎。然后将100μL每份悬浮液离心(15,000rpm，5分钟)，取出每份上清液并转移至分开的管形瓶。这是为了区分可溶性和不溶性的表达的靶蛋白。对于每份上清液(＝可溶性蛋白质组分)和每份团粒(＝不溶性蛋白质组分)分别添加100μL和200μLSDS样品缓冲液(Laemmli，U.K.，Nature227(1970)680-685)。将样品在剧烈混合下于95℃加热15分钟以溶解及还原样品中的所有蛋白质。冷却至室温后，将5μL每份样品转移至4-20％TGXCriterion无染料聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)。另外施加5μl分子量标准品(PrecisionPlusProteinStandard，Bio-Rad)和具有已知靶蛋白质浓度(0.1μg/μl)的3种量(0.3μl，0.6μl和0.9μl)的定量标准品。于200V运行电泳60分钟，之后将凝胶转移至GelDOCEZ成像仪(Bio-Rad)并用UV照射加工5分钟。使用ImageLab分析软件(Bio-Rad)分析凝胶图像。利用三个标准品，计算线性回归曲线，系数＞0.99，并计算最初的样品中靶蛋白的浓度。(M-05-74的Fab片段，PE24变体，和缀合至假单胞菌外毒素变体PE24LR8M的M-05-74Fab片段的)纯化、分选酶偶联和复性Fab片段依照制造商的描述通过亲和层析(NiSepharoseTM高效HisTrapTM)纯化Fab片段。简言之，将上清液加载到在50mM磷酸钠pH8.0，300mMNaCl中平衡的柱上。用pH7.0的相同缓冲液以含有4mM咪唑，接着是升高至100mM咪唑的梯度的清洗步骤实施蛋白质洗脱。合并含有期望Fab片段的级分，并针对20mMHis，140mMNaCl，pH6.0透析。用于分选酶偶联的PE24通过在20mMTris，2mMEDTA，pH8.0+完全蛋白酶抑制剂混合物片(Roche)中的高压匀浆(若需要详情：ChristianSchantz)来裂解表达PE24的大肠杆菌细胞。过滤裂解物并加载到在20mMTris，pH7.4中平衡的QsepharoseFF(GEHealthcare)上。用相同缓冲液中升至500mMNaCl的梯度洗脱蛋白质。通过SDS-PAGE鉴定含有PE24的级分。浓缩合并池并施加至在20mMTris，150mMNaCl，pH7.4中平衡的HiLoadTMSuperdexTM75(GEHealthcare)。根据SDS-PAGE合并含有PE24的级分，并冷冻于-80℃。Fab片段至PE24的分选酶偶联使用Ultra4离心过滤装置(MerckMillipore)将Fab片段和PE24分开渗滤入50mMTris，150mMNaCl，5mMCaCl2pH7.5，并浓缩至5-10mg/ml。以1:1:0.8摩尔比组合两种蛋白质和分选酶。于37℃温育1小时后，将混合物加载到在50mM磷酸钠，pH8.0，300mMNaCl中平衡的NiSepharoseTM高效HisTrapTM上。用相同缓冲液pH7.0中升至100mM咪唑的梯度实施洗脱。浓缩含有终产物Fab-PE24的流出级分，并加载到在20mMTris，150mMNaCl，pH7.4中平衡的HiLoadTMSuperdexTM200(GEHealthcare)上。合并含有期望偶联蛋白质的级分，并贮存于-80℃。使用可溶性金黄色葡萄球菌分选酶A作为分选酶(SEQIDNO:50)。使用下述表达质粒表达和纯化可溶性金黄色葡萄球菌分选酶A：分选酶基因编码N-末端截短的金黄色葡萄球菌分选酶A(60-206)分子。用于在HEK293细胞中瞬时表达可溶性分选酶的表达质粒除了可溶性分选酶表达盒之外还包含来自载体pUC18的复制起点(其允许这种质粒在大肠杆菌中复制)和β-内酰胺酶基因(其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性)。可溶性分选酶的转录单位包含下述功能性元件：-来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子，包括内含子A，-人重链免疫球蛋白5’非翻译区(5’UTR)，-鼠免疫球蛋白重链信号序列，-N-末端截短的金黄色葡萄球菌分选酶A编码核酸，和-牛生长激素多腺苷酸化序列(BGHpA)。自大肠杆菌包涵体衍生的Fab-PE24的复性在8M盐酸胍，100mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0+100mM二硫苏糖醇(DTT)中分开溶解VH-PE24和VL-C卡帕的包涵体。室温12-16小时后，将增溶物的pH调节至3.0，将经过离心的溶液针对8M盐酸胍，10mMEDTA，pH3.0透析。通过双缩脲反应测定蛋白质浓度，通过SDS-PAGE评估包涵体制备物的纯度。将等摩尔量的两条链在两个步骤中稀释入0.5M精氨酸，2mMEDTA，pH10+1mMGSH/1mMGSSG中至终浓度0.2-0.3mg/ml。于4-10℃12-16小时后，用H2O将复性蛋白质稀释至<3mS/cm，并加载到在20mMTris/HCl，pH7.4中平衡的QsepharoseFF(GEhealthcare)上。用相同缓冲液中升至400mMNaCl的梯度实施洗脱。通过SDS-PAGE和分析型大小排阻层析(SEC)鉴定含有正确产物的级分。浓缩合并的级分，并加载到在20mMTris，150mMNaCl，pH7.4中或在20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0中平衡的HiLoadTMSuperdexTM200(GEHealthcare)上。根据分析型SEC分析和合并级分，并贮存于-80℃。基于SEQIDNO:46和SEQIDNO:49，也可以作为直接PE24LR8M融合物一样重组表达、纯化和复性M-05-74的Fab片段与假单胞菌外毒素变体PE24LR8M的免疫缀合物(M-05-74-PE)。实施例11M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE)对不同肿瘤细胞系的细胞杀伤将过表达HER3的A549细胞接种入白色96孔板(透明平底，1x104个细胞每孔)，并在RPMI(10％FCS)中生长过夜。次日，用50μl饥饿培养基(RPMI，0.5％FCS)更换培养基。至少4小时后，添加5μl调蛋白-β(PeproTech，目录号100-03)(HRGβ)至终浓度500ng/ml。添加50μlFab-74-PE溶液至终浓度10，3.3，1.1，0.37，0.12，0.04，0.014，0.005和0.002μg/ml。将板温育72小时。24小时和48小时后，再次添加5μl调蛋白-β至终浓度500ng/ml。72小时后，在TecanInfiniteF200读数仪中使用Promega的CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法(目录号G7571)测量发光。M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE)的EC50值在HRGβ缺失下是1,93μg/ml而在存在下是0,13μg/ml。表10：M-05-74-Fab-假单胞菌对A549细胞的细胞杀伤的EC50实施例12a抗HER3抗体M-05-74的人源化变体使用鼠抗体M-05-7重链和轻链可变域来搜索相似的人抗体可变域。在为每一种链获得的200项结果中，丢弃约一半，因为它们来自非人来源。对所有剩余人抗体分析框架内涉及VH/VL界面的关键残基和对于CDR环结构重要的残基。尽可能在人源化变体中维持这些对于VH/VL界面和规范环结构重要的关键残基，然而有时包括这些位置的某些变化。将来自鼠抗体链的CDR嫁接入这些人抗体框架。基于先前的标准，还有计算机筛选T细胞表位的结果选择头五位嫁接域进行进一步开发。因而，将小鼠抗HER3抗体M-05-74人源化，产生M-05-74的下述人源化变体VH和VL域：表11：M-05-74的人源化变体抗体的VH和VL序列在这5种VH和VL域的25种理论上可能的组合中，如下选择最有力的结合者：为了找到<Her3>M-05-74抗体的具有有利动力学特性的最优化人源化变体，如上所述设计了重和轻链各5种变体。在scFv-核糖体展示构建物中以所有组合(总共25种)生成所获得的序列。通过侧翼引物扩增25种scFv构建物以获得线性模板DNA，它们是核糖体展示必需的。用琼脂糖凝胶电泳，继以用QiagenMinElute试剂盒依照制造商的说明书提取来纯化每一种PCR产物。测定产物DNA浓度，所有线性模板DNA的200ng等摩尔混合物是37℃，60分钟体外转录/翻译的基础。所利用的试剂盒包含PURExpress体外蛋白质合成试剂盒(NEB)，包括两种二硫键增强剂(DBE1和2)。加工两份反应样品，每一份样品具有加倍的反应量。第一份样品在后续淘选步骤中包括生物素化的和调蛋白活化的靶物(HER3-ECD)。第二份样品是阴性对照，淘选步骤中没有靶蛋白。同样处理两份样品。对转录和翻译后获得的三元复合物(mRNA-核糖体-scFv变体)的集合用所采用的磁珠(链霉亲合素M-270Dynabeads,LifeTechnologies)于4℃，30分钟进行一个预淘选步骤以去除非特异性结合变体。通过离心去除预淘选珠，并将含有剩余三元复合物的上清液添加至准备好的靶物/调蛋白混合物，在淘选步骤中于4℃温育30分钟。在淘选步骤之前将靶物/调蛋白复合物以1:6摩尔比温育60分钟以获得受体域的开放构象和暴露74亲本抗体的表位。淘选反应中生物素化HER3-ECD的终浓度为100nM。此后所有采用的缓冲液含有300nM调蛋白。经靶物生物素标签和上文所述链霉亲合素珠捕捉靶物和所有结合三元复合物。用于捕捉的温育时间为4℃，20分钟。利用珠的磁特性，可以通过重复温育和去除清洗缓冲液来清洗复合物。为了去除弱结合性变体，随清洗步骤提高清洗压力。总共采用5个500uL清洗缓冲液(含有调蛋白)的清洗步骤(2，4，5，5和1分钟)，之间在磁场中捕捉2分钟。使用最后一步将剩余强结合性变体转移入一个干净的新的反应管进行洗脱步骤(10分钟，4℃，100uL含有EDTA的洗脱缓冲液)，接着离心以去除珠。用QiagenRNEasyRNA纯化试剂盒依照制造商的说明书纯化上清液中所获得的RNA。为了确保稍后通过逆转录生成的DNA的起源，预先对RNA进行DNA酶消化。消化(Ambion无DNA试剂盒)以12uL经过纯化的RNA起始，并于37℃温育30分钟。去除DNA酶后，每份样品各12uL启动3份逆转录反应，并于37℃温育1小时。使用各12uL经过消化的RNA样品(消化产物)作为第一PCR的阴性对照以证明完全去除DNA痕迹。为每一份样品合并逆转录反应的产物，并用于启动5份100uLPCR反应以扩增DNA选择集合。合并产物，并通过凝胶电泳(1％制备性琼脂糖凝胶和分析性AgilentDNA7500芯片，1uL样品体积)和QiagenMinElute试剂盒依照制造商的方案进行纯化。图1中所获得的凝胶图像清楚地显示道1中选定构建物DNA的富集和道2中阴性对照(没有靶物的淘选)没有富集。正如预期的，剩余对照也是阴性的。DNA消化是完全的(道3为靶物，道4为背景)。因此，道1中所有获得的DNA衍生自淘选步骤中选择的结合性变体，及其相应的RNA。逆转录的阴性对照和PCR的阴性对照均不显示条带。道7显示纯化后合并PCR反应的产物。扩增PCR产物以生成足够DNA进行克隆。在CutSmart缓冲液中用MfeI-HF和NotI-HF(均来自NEB)将选择集合和表达载体Her_scFv_huFc(各1ug)于37℃消化1小时。首先纯化选择插入物和切割载体，然后用NEBQuick连接酶于室温连接30分钟。切割插入物与载体的摩尔比为5:1(25ng切割插入物和50ng切割载体)。直接使用2ul连接产物来转化50uLDH5α(LifeTechnologies)感受态细胞。长出后，在具有氨苄青霉素抗性的LB板(LBamp)上涂布50uL，并于37℃温育16小时。使用34个菌落来接种5mLLBamp培养基，37℃，16小时。收获细胞，并用QiagenMiniprep试剂盒依照制造商的说明书分离DNA，将每一份样品的300ng质粒DNA送至SequiserveGmbH进行测序。结果–<Her3>M-05-74抗体的最优化的人源化变体测序结果显示一种特定变体的富集：VH-A/VL-D。相应序列在34份样品中获得6次，这清楚地指示上文所述测定法中最有力的对HER-ECD的结合特性。还有，组合VH-A/VH-B和VH-A/VH-E发生2次，因而显示与剩余不太富集的VH/VL组合相比较为卓越的对HER3ECD的结合特性。令人惊讶地，所有富集变体包括VH-A。因此，VH-A是<Her3>M-05-74的所有HER3结合性人源化变体的一项关键特征，尤其是在优选组合VH-A/VL-D，VH-A/VH-B和VH-A/VH-E中。剩余24种序列都是不同的且特征在于次要删除和/或点突变组合。这些序列无法完美编辑且未进行分析。如上所述以人IgG1同种型(具有Cκ轻链恒定域)或者例如作为与假单胞菌外毒素的融合蛋白(免疫毒素)表达组合VH-A/VL-D，VH-A/VH-B和VH-A/VH-E中的每一种。如上文例如实施例2，3，5，6，7，8，9，11中所述或如下文实施例13所述测定结合特征和生物学特性。实施例12b抗HER3抗体M-05-74的人源化变体的结合为了调查在配体调蛋白存在和缺失下(实施例12a中描述的)抗HER3抗体M-05-74的人源化变体VH-A/VL-D对HER3-ECD和HER4-ECD的结合，于37℃使用Biacore3000装置(GEHealthcare)进行SPR分析(表11)。由于升高的表位可及性，抗HER3抗体M-05-74的人源化变体VH-A/VL-D优先结合配体活化的ECD复合物。它以KD10nM的亲和力结合HER3-ECD/HRG复合物。令人惊讶地，抗HER3抗体M-05-74的人源化变体VH-A/VL-D显示与亲本抗体M-05-74(KD4nM)相比强烈降低的HER4-ECD/HRG反应性(KD211nM)，同时维持它的HER3-ECD/HRG反应性(KD10nM，与KD7nM相比)。实施例13M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE)所致体内肿瘤细胞生长抑制将用编码人HER3的表达载体稳定转染的人A431-B34非小细胞肺癌细胞系皮下接种入雌性SCID米色小鼠的右体侧中(1x107个细胞每只动物)。在肿瘤接种后第21天，将动物随机化并分派入治疗组和一个媒介组，产生中值肿瘤体积约110mm3每组。同日，用M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE)(1.0mg/kg)静脉内处理动物2个周期，每个周期由3q7d(隔天)组成。对照接受媒介(Tris缓冲液)。两个周期由一周治疗中断分开。依照NCI方案计算原发性(primary)肿瘤体积(TV)(TV＝(长度x宽度2)/2)，其中“长度”和“宽度”为以mm计的肿瘤块长和短直径(Corbettetal.,1997)。自分期(肿瘤接种后第21天)直至肿瘤接种后第42天实施计算，并以中值和四分位间距离(IQR)(定义为第三和第一四分位的差异)记录数值。对于治疗期期间百分比肿瘤生长抑制(TGI)的计算，比较每个治疗组与其相应媒介对照。TV第z天代表在限定研究日(第z天)动物个体的肿瘤体积，而TV第x天代表在分期日(第x天)动物个体的肿瘤体积。应用下述公式：使用非参数方法来应用治疗对对照比(TCR)及置信区间(CI)的计算。中值肿瘤体积的结果及四分位间距离显示于图19。M-05-74-Fab-假单胞菌外毒素缀合物(M-05-74-PE)的肿瘤生长抑制为66％，TCR为0.509(CI：0.33–0.734)。实施例14与WO2012/22814中描述的抗HER3抗体MOR09823(2)比较，抗体M-05-74(1)对TtSlyDcys-HER3(SEQIDNO:18)的结合依照制造商的用法说明书给BiacoreT200仪器(GEHealthcare)安装CM5系列传感器，并在HBS-ET+缓冲液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.05％w/vTween20)中标准化。样品缓冲液是补充有1mg/mlCMD(羧甲基右旋糖苷)的系统缓冲液。于37℃操作系统。在传感器表面上建立双重抗体捕捉系统。依照制造商的用法说明书使用EDC/NHS化学在所有流通池上固定化6500RU单抗<M-IgG>R。使用1M乙醇胺灭活传感器。流通池1充当参照，并以10μl/分钟捕捉抗TSHIgG1抗体1分钟。在流通池2上以10μl/分钟捕捉M-05-741分钟。在流通池3上以10μl/分钟捕捉鼠抗人Fc泛抗体1分钟，接着以10μl/分钟注射抗HER3抗体M-05-74(1)或抗HER3抗体MOR09823抗体1分钟。流速设置为60μl/分钟。以0nM和150nM的浓度注射在溶液中的分析物TtSlyDcys-HER3(SEQIDNO:18)5分钟，并监测解离600秒。通过以10μl/分钟一次注射10mM甘氨酸pH1.7缓冲液3分钟使传感器完全再生。图20描绘传感图重叠图，显示150nMTtSlyDcys-Her3和缓冲液的结合信号。上述重叠图显示抗体M-05-74结合150nMTtSlyDcys-HER3(1)。MOR09823抗体不结合TtSlyDcas-HER3(2)。(3)显示TtSlyDcas-HER3对单抗<M-IgG>R捕捉表面的背景结合信号。WO2012/22814中描述的抗HER3抗体MOR09823(2)不显示与150nMTtSlyDcys-Her3的任何相互作用。阳性对照抗体M-05-74(1)显示对TtSlyDcas-Her3的显著结合。在注射150nMTtSlyDcys(无HER3插入)时两种抗体均不可测定到相互作用(数据未显示)。实施例15结合HER3β-发夹和HER2域II的HER3/HER2双特异性抗体DIBxPERT的生成和评估材料和方法重组DNA技术使用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.etal.，MolecularCloning:Alaboratorymanual；ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，1989中所述。依制造商的说明书使用分子生物学试剂。基因合成依照给定的规格在Geneart(Regensburg，Germany)定购期望的基因合成片段。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的600-1500bp长基因区段经由指定的限制性位点例如BamHI/XbaI，BamHI/XhoI克隆入pUC表达载体(图22-25)。通过DNA测序确认亚克隆基因片段的DNA序列。DNA序列测定通过在SequiserveGmbH(Vaterstetten，Germany)实施的双链测序测定DNA序列。DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理使用Infomax的VectorNT1Advance套组版本11.5.0进行序列创建、定位、分析、注释和说明。CrossMab设计CrossMab技术(Schaeferetal.,2011)将具有不同特异性的不同亲本抗体的两条重和轻链组合成一种IgG样型式。为了推动两条不同重链的异二聚化，应用‘节-入-穴’技术，其中一个CH3域中的较小氨基酸用较大氨基酸替换(‘节’)。在第二抗体的CH3域中，较大氨基酸用较小氨基酸替换(‘穴’)。为了确保轻链与对应重链的正确组装，将一条重链的CH1域与相应轻链的Cκ(CK)域交换。终产物一般称作CrossMab。在这里，使用M-05-74(DIB-74)抗体轻(图22)和重链(图23)，其中在DIB重链的CH3域中引入‘节’突变。使用帕妥珠单抗作为第二亲本抗体。在这里，在轻链的CK域(图24)和重链的CH1域(图25)之间引入交换。在CH3域中引入‘穴’突变。所得CrossMab称作DIBxPERT(见序列SEQIDNO:68-71，其中PERT(帕妥珠单抗)前面的x指示在帕妥珠单抗位点中引入了交换(图26)。DIBxPERT的表达为了由HEK293F细胞表达DIBxPERT，通过QIAGENPlasmidPlusMaxi试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)依照制造商的说明书获得质粒DNA。以1.0E+06个细胞每mlFreeStyleTM293表达培养基接种细胞。使用293-FreeTM转染试剂依照制造商的说明书用四种质粒(CB01_DIB-LC_VL-CK，CB02_DIB-HC_VH-CH1-CH2-CH3_节，NN21pUC-Exp_xMab_Pertuzu_LC，NN24pUC-xPertuzu-SSKHC2-RSE)各22pmol转染1L细胞。将细胞以150rpm摇动(LabThermLT-XC，KühnerAG，Birsfelden，Schweiz)于37℃，8％CO2和80％空气湿度温育7天。温育后，添加50mMPMSF(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)，1ngMgCl2(MerckGmbH，Darmstadt，Germany)和10U/mlDNA酶I(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim，Germany)，并将细胞温育30分钟。通过将细胞以890xg离心30分钟(Rotanta460R，和reasHettichGmbH，Tuttlingen，Germany)来收获含有抗体的上清液。直至纯化，将上清液保存于-20℃。DIBxPERT的纯化使用仪器(GEHealthcare，München，Germany)分离抗体。用50mMKH2PO4，150mMKCl，pH7.4系统缓冲液平衡蛋白AHiTrapMabSelectSuRe(5ml)(GEHealthcare，München，Germany)。预先用0.22μm无菌过滤单元过滤上清液，然后以流速0.9ml/min应用到柱上过夜。随后，以流速2ml/min使用系统缓冲液去除未结合的物质。然后，以流速1ml/min使用0.1M柠檬酸钠pH3.7自柱洗脱结合的抗体，并直接用1ML-精氨酸缓冲液中和。合并想要的级分，并通过凝胶渗透层析(GPC)来纯化，由此将缓冲液透析入20mM组氨酸，140mMNaCl，pH6.0贮存缓冲液。通过280nm光谱术分析DIBxPERT终产物数量。使用TSK-QC-PAKGF30柱(TosohBioscienceGmbH，Stuttgart，Germany)和UltiMate3000Dionex仪器(FisherScientificGmbH，Schwerte，Germany)通过GPC来控制质量(图27A和B)。作为第二质量控制，使用还原性和非还原性条件的4-12％Bis-TrisSDS-PAGE(LifeTechnologiesGmbH，Darmstadt，Germany)(图27C)。通过还原性条件，重和轻链之间的共价二硫桥遭到破坏。为了评估DIBxPERT的纯度和聚集状态，使用TSK-QC-PAKGF30柱(TosohBioscience，Stuttgart，Germany)进行分析性GPC。DIBxPERT以96％的相对GPC峰面积得到纯化(图27A)。与标准曲线参照的比较确认了摩尔质量为145kDa。非还原性条件下的SDS-PAGE(图27B)揭示大约145kDa处的蛋白质条带。在还原性条件下，重和轻链之间的二硫键遭到破坏。因此，在SDS-PAGE中找到两条条带，它们可指派为重(大约50kDa)和轻(大约25kDa)抗体链(图27C)。DIBxPERT终产物的纯度对于后续实验和分析是足够的。实施例16通过SPR分析测定HER3/HER2双特异性抗体DIBxPERT动力学特征在其平衡状态，HER3-ECD处于其“闭合构象”，这确实意味着HER3β-发夹基序的异二聚化经非共价相互作用系留至HER3-ECD域IV。假定“闭合”HER3构象能经配体调蛋白在特定HER3调蛋白结合位点处的结合而开放。这发生于由HER3-ECD域I和域III形成的HER3界面。通过这种相互作用，认为HER3受体活化并转变成它的“开放构象”。当这发生时，HER3β-发夹对于所描述的抗体是可及的。这种作用模式可以在体外通过Biacore实验来模拟。为了调查DIBxPERT是否保留亲本抗体DIB-74和帕妥珠单抗的动力学特征，使用SPR分析收集实时数据，使用BiacoreB3000仪器(GEHealthcare)于25℃在动力学上对单克隆抗体评估它们对调蛋白活化的HER3胞外域(HER3-ECD)和组成性开放的HER2-ECD的行为。将CM5系列芯片安装入系统中，并依照制造商的说明书在HBS-ET缓冲液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3mMEDTA，0.005％w/vTween20)中标准化。样品缓冲液为补充有1mg/mlCMD(羧甲基葡聚糖，Sigma#86524)的系统缓冲液。于25℃操作系统。使用EDC/NHS化学在所有四个流动室上固定化10000RU单克隆鼠抗人Fc抗体(MAK<h-Fc>M-R10Z8E9，RocheDiagnosticsGmbH，Penzberg，Germany)。使用1M乙醇胺灭活传感器。所测试的溶液中的分析物为270nM人重组HER2-ECD(69.6kDa)和270nM人重组HER3-ECD(68kDa)，将它与3倍摩尔过量的人调蛋白1β(HRG1β)(一种44kDa同二聚体蛋白质)一起于室温温育60分钟，产生HER3-ECD/HRG1β复合物。以流速30μl/min以不同浓度步骤0nM，3.3nM，10nM，30nM，90nM和270nM注射溶液中的分析物达5分钟(图28)。监测解离达10分钟。在可能时依照朗格缪尔(Langmuir)拟合来评估动力学签名。为了评估DIBxPERT同时结合HER2-ECD和HER3-ECD/HRG1β复合物二者的能力，使用第二测定法设置。在这里，连续注射分析物HER2-ECD(270nM)和HER3-ECD/HRG1β复合物(270nMHER3-ECD及3倍过剩的HRG1β)，或反之(图29)。监测结合和解离速率分别达10分钟和8分钟。DIBxPERT保留亲本抗体的特异性使用SPR分析比较DIBxPERT和亲本抗体DIB-74(单价单抗型式的)和帕妥珠单抗(二价IgG型式的)。DIBxPERT保留它的亲本抗体帕妥珠单抗和DIB-74的特异性且结合HER2-ECD以及HER3-ECD/HRG1β复合物(图7)。数据显示帕妥珠单抗对HER2-ECD的亲和力(KD1.7nM)在DIBxPERT中得到保留(KD1.6nM)。帕妥珠单抗的摩尔比(MR＝1.3)比DIBxPERT的(MR＝0.6nM)高2倍。结合开放HER3-ECD(HER3-ECD/HRG1β)的能力在DIBxPERT中也得到保留。DIBxPERT对HER3-ECD/HRG1β复合物的亲和力(KD3.9nM)与DIB-MoAb对HER3-ECD/HRG1β复合物的亲和力(KD2.1nM)相当。两种抗体均以分别为0.6和0.5的亚化学计量的摩尔比结合(表12)。表12：使用B3000Biacore仪器(GeHealthcare)通过SPR分析测定的DIBxPERT和亲本抗体DIB-MoAb和帕妥珠单抗的动力学参数。CL：以响应单位计的捕捉水平，Rmax：分析物的最大结合水平，ka：以1/Ms计的结合速率常数，kd：以1/s计的解离速率常数，t1/2-diss：以分钟计的复合物半衰期，KD：平衡解离常数，MR：摩尔比。DIBxPERT对可溶性HER2-ECD和HER3-ECD/HRG1β复合物的同时结合使用SPR分析评估DIBxPERT同时结合可溶性HER2-ECD和HER3-ECD/HRG1β复合物的能力(图29)。我们发现DIBxPERT能够以一个效价结合HER3-ECD/HRG1β复合物(MR＝0.7)，甚至在早就以第二效价结合至HER2-ECD时(MR＝0.8)。倒过来，在早就以第二效价结合至HER3-ECD/HRG1β复合物时(MR＝0.8)，DIBxPERT以一个效价结合HER2-ECD(MR＝0.8)。数据显示在使用可溶性分析物时，DIBxPERT能够在同一时间结合两种靶物(HER2-ECD和HER3-ECD/HRG1β)。实施例17：MDA-MB-175VII细胞中HER3/HER2双特异性抗体DIBxPERT的肿瘤细胞增殖抑制使用MDA-MB-175细胞(VII人乳腺癌细胞，ATCC产品目录号HTB-25)在细胞增殖测定法中评估DIBxPERT的抗肿瘤功效。将20,000个细胞每孔接种入装有含有10％FCS和2mML-谷氨酰胺的DMEM/F12细胞培养培养基的无菌96孔组织培养板，并于37℃和5％CO2温育1天。该细胞是缓慢生长的细胞，倍增时间为大约3天。用含有2mML-谷氨酰胺的含有0.5％FCS的DMEM/F12细胞培养培养基使细胞饥饿。以稀释系列添加DIBxPERT和对照抗体，并进一步温育6天。所应用的抗体列于表13。然后使用读出评估细胞存活力。使用每种抗体浓度一式三份的均值计算EC50值(图30)。表13：用于在体外在MDA-MB-175VII细胞中抑制肿瘤细胞增殖的抗体。在下文所述单一处理外，还在体外应用DIB-74与帕妥珠单抗和RG7116与帕妥珠单抗的组合处理。MDA-MB-175VII细胞中DIBxPERT的肿瘤细胞增殖抑制在体外使用MDA-MB-175VII细胞检查DIBxPERT的肿瘤细胞增殖抑制。在MDA-MB-175VII细胞系(倍增时间3天)，从自分泌HRG生长环产生致癌信号。将细胞与一系列经过稀释的抗体DIBxPERT，DIB-MoAb，DIB-74，帕妥珠单抗，RG7116，DIB-74与帕妥珠单抗的组合和RG7116与帕妥珠单抗的组合和同种型对照一起温育(图30)。6天后，与其它单一和组合处理形成对比，DIBxPERT实现79％的最大生长抑制(表14)。对用DIB-74与帕妥珠单抗的组合(76％)和RG7116与帕妥珠单抗的组合(76％)处理的细胞看到第二高的最大抑制效果。DIBxPERT介导的生长抑制的EC50为1nM，优于对照抗体的EC50。帕妥珠单抗单一处理或帕妥珠单抗与DIB-74或RG7116的组合显示2nM的生长抑制EC50。与之相比，单独的RG7116(EC507nM)和DIB(EC5026nM)在体外介导更低的肿瘤生长抑制。序列表<110>豪夫迈·罗氏有限公司（F.Hoffmann-LaRocheAG）<120>结合HER3β-发夹和HER2域II的HER3/HER2双特异性抗体<130>P32126WO<150>EP14168323.5<151>2014-05-14<160>71<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>PRT<213>人（HomoSapiens）<400>1ProGlnProLeuValTyrAsnLysLeuThrPheGlnLeuGluProAsn151015ProHisThr<210>2<211>19<212>PRT<213>人（HomoSapiens）<400>2ProGlnThrPheValTyrAsnProThrThrPheGlnLeuGluHisAsn151015PheAsnAla<210>3<211>1323<212>PRT<213>人（HomoSapiens）<400>3SerGluValGlyAsnSerGlnAlaValCysProGlyThrLeuAsnGly151015LeuSerValThrGlyAspAlaGluAsnGlnTyrGlnThrLeuTyrLys202530LeuTyrGluArgCysGluValValMetGlyAsnLeuGluIleValLeu354045ThrGlyHisAsnAlaAspLeuSerPheLeuGlnTrpIleArgGluVal505560ThrGlyTyrValLeuValAlaMetAsnGluPheSerThrLeuProLeu65707580ProAsnLeuArgValValArgGlyThrGlnValTyrAspGlyLysPhe859095AlaIlePheValMetLeuAsnTyrAsnThrAsnSerSerHisAlaLeu100105110ArgGlnLeuArgLeuThrGlnLeuThrGluIleLeuSerGlyGlyVal115120125TyrIleGluLysAsnAspLysLeuCysHisMetAspThrIleAspTrp130135140ArgAspIleValArgAspArgAspAlaGluIleValValLysAspAsn145150155160GlyArgSerCysProProCysHisGluValCysLysGlyArgCysTrp165170175GlyProGlySerGluAspCysGlnThrLeuThrLysThrIleCysAla180185190ProGlnCysAsnGlyHisCysPheGlyProAsnProAsnGlnCysCys195200205HisAspGluCysAlaGlyGlyCysSerGlyProGlnAspThrAspCys210215220PheAlaCysArgHisPheAsnAspSerGlyAlaCysValProArgCys225230235240ProGlnProLeuValTyrAsnLysLeuThrPheGlnLeuGluProAsn245250255ProHisThrLysTyrGlnTyrGlyGlyValCysValAlaSerCysPro260265270HisAsnPheValValAspGlnThrSerCysValArgAlaCysProPro275280285AspLysMetGluValAspLysAsnGlyLeuLysMetCysGluProCys290295300GlyGlyLeuCysProLysAlaCysGluGlyThrGlySerGlySerArg305310315320PheGlnThrValAspSerSerAsnIleAspGlyPheValAsnCysThr325330335LysIleLeuGlyAsnLeuAspPheLeuIleThrGlyLeuAsnGlyAsp340345350ProTrpHisLysIleProAlaLeuAspProGluLysLeuAsnValPhe355360365ArgThrValArgGluIleThrGlyTyrLeuAsnIleGlnSerTrpPro370375380ProHisMetHisAsnPheSerValPheSerAsnLeuThrThrIleGly385390395400GlyArgSerLeuTyrAsnArgGlyPheSerLeuLeuIleMetLysAsn405410415LeuAsnValThrSerLeuGlyPheArgSerLeuLysGluIleSerAla420425430GlyArgIleTyrIleSerAlaAsnArgGlnLeuCysTyrHisHisSer435440445LeuAsnTrpThrLysValLeuArgGlyProThrGluGluArgLeuAsp450455460IleLysHisAsnArgProArgArgAspCysValAlaGluGlyLysVal465470475480CysAspProLeuCysSerSerGlyGlyCysTrpGlyProGlyProGly485490495GlnCysLeuSerCysArgAsnTyrSerArgGlyGlyValCysValThr500505510HisCysAsnPheLeuAsnGlyGluProArgGluPheAlaHisGluAla515520525GluCysPheSerCysHisProGluCysGlnProMetGluGlyThrAla530535540ThrCysAsnGlySerGlySerAspThrCysAlaGlnCysAlaHisPhe545550555560ArgAspGlyProHisCysValSerSerCysProHisGlyValLeuGly565570575AlaLysGlyProIleTyrLysTyrProAspValGlnAsnGluCysArg580585590ProCysHisGluAsnCysThrGlnGlyCysLysGlyProGluLeuGln595600605AspCysLeuGlyGlnThrLeuValLeuIleGlyLysThrHisLeuThr610615620MetAlaLeuThrValIleAlaGlyLeuValValIlePheMetMetLeu625630635640GlyGlyThrPheLeuTyrTrpArgGlyArgArgIleGlnAsnLysArg645650655AlaMetArgArgTyrLeuGluArgGlyGluSerIleGluProLeuAsp660665670ProSerGluLysAlaAsnLysValLeuAlaArgIlePheLysGluThr675680685GluLeuArgLysLeuLysValLeuGlySerGlyValPheGlyThrVal690695700HisLysGlyValTrpIleProGluGlyGluSerIleLysIleProVal705710715720CysIleLysValIleGluAspLysSerGlyArgGlnSerPheGlnAla725730735ValThrAspHisMetLeuAlaIleGlySerLeuAspHisAlaHisIle740745750ValArgLeuLeuGlyLeuCysProGlySerSerLeuGlnLeuValThr755760765GlnTyrLeuProLeuGlySerLeuLeuAspHisValArgGlnHisArg770775780GlyAlaLeuGlyProGlnLeuLeuLeuAsnTrpGlyValGlnIleAla785790795800LysGlyMetTyrTyrLeuGluGluHisGlyMetValHisArgAsnLeu805810815AlaAlaArgAsnValLeuLeuLysSerProSerGlnValGlnValAla820825830AspPheGlyValAlaAspLeuLeuProProAspAspLysGlnLeuLeu835840845TyrSerGluAlaLysThrProIleLysTrpMetAlaLeuGluSerIle850855860HisPheGlyLysTyrThrHisGlnSerAspValTrpSerTyrGlyVal865870875880ThrValTrpGluLeuMetThrPheGlyAlaGluProTyrAlaGlyLeu885890895ArgLeuAlaGluValProAspLeuLeuGluLysGlyGluArgLeuAla900905910GlnProGlnIleCysThrIleAspValTyrMetValMetValLysCys915920925TrpMetIleAspGluAsnIleArgProThrPheLysGluLeuAlaAsn930935940GluPheThrArgMetAlaArgAspProProArgTyrLeuValIleLys945950955960ArgGluSerGlyProGlyIleAlaProGlyProGluProHisGlyLeu965970975ThrAsnLysLysLeuGluGluValGluLeuGluProGluLeuAspLeu980985990AspLeuAspLeuGluAlaGluGluAspAsnLeuAlaThrThrThrLeu99510001005GlySerAlaLeuSerLeuProValGlyThrLeuAsnArgProArg101010151020GlySerGlnSerLeuLeuSerProSerSerGlyTyrMetProMet102510301035AsnGlnGlyAsnLeuGlyGluSerCysGlnGluSerAlaValSer104010451050GlySerSerGluArgCysProArgProValSerLeuHisProMet105510601065ProArgGlyCysLeuAlaSerGluSerSerGluGlyHisValThr107010751080GlySerGluAlaGluLeuGlnGluLysValSerMetCysArgSer108510901095ArgSerArgSerArgSerProArgProArgGlyAspSerAlaTyr110011051110HisSerGlnArgHisSerLeuLeuThrProValThrProLeuSer111511201125ProProGlyLeuGluGluGluAspValAsnGlyTyrValMetPro113011351140AspThrHisLeuLysGlyThrProSerSerArgGluGlyThrLeu114511501155SerSerValGlyLeuSerSerValLeuGlyThrGluGluGluAsp116011651170GluAspGluGluTyrGluTyrMetAsnArgArgArgArgHisSer117511801185ProProHisProProArgProSerSerLeuGluGluLeuGlyTyr119011951200GluTyrMetAspValGlySerAspLeuSerAlaSerLeuGlySer120512101215ThrGlnSerCysProLeuHisProValProIleMetProThrAla122012251230GlyThrThrProAspGluAspTyrGluTyrMetAsnArgGlnArg123512401245AspGlyGlyGlyProGlyGlyAspTyrAlaAlaMetGlyAlaCys125012551260ProAlaSerGluGlnGlyTyrGluGluMetArgAlaPheGlnGly126512701275ProGlyHisGlnAlaProHisValHisTyrAlaArgLeuLysThr128012851290LeuArgSerLeuGluAlaThrAspSerAlaPheAspAsnProAsp129513001305TyrTrpHisSerArgLeuPheProLysAlaAsnAlaGlnArgThr131013151320<210>4<211>624<212>PRT<213>人（HomoSapiens）<400>4SerGluValGlyAsnSerGlnAlaValCysProGlyThrLeuAsnGly151015LeuSerValThrGlyAspAlaGluAsnGlnTyrGlnThrLeuTyrLys202530LeuTyrGluArgCysGluValValMetGlyAsnLeuGluIleValLeu354045ThrGlyHisAsnAlaAspLeuSerPheLeuGlnTrpIleArgGluVal505560ThrGlyTyrValLeuValAlaMetAsnGluPheSerThrLeuProLeu65707580ProAsnLeuArgValValArgGlyThrGlnValTyrAspGlyLysPhe859095AlaIlePheValMetLeuAsnTyrAsnThrAsnSerSerHisAlaLeu100105110ArgGlnLeuArgLeuThrGlnLeuThrGluIleLeuSerGlyGlyVal115120125TyrIleGluLysAsnAspLysLeuCysHisMetAspThrIleAspTrp130135140ArgAspIleValArgAspArgAspAlaGluIleValValLysAspAsn145150155160GlyArgSerCysProProCysHisGluValCysLysGlyArgCysTrp165170175GlyProGlySerGluAspCysGlnThrLeuThrLysThrIleCysAla180185190ProGlnCysAsnGlyHisCysPheGlyProAsnProAsnGlnCysCys195200205HisAspGluCysAlaGlyGlyCysSerGlyProGlnAspThrAspCys210215220PheAlaCysArgHisPheAsnAspSerGlyAlaCysValProArgCys225230235240ProGlnProLeuValTyrAsnLysLeuThrPheGlnLeuGluProAsn245250255ProHisThrLysTyrGlnTyrGlyGlyValCysValAlaSerCysPro260265270HisAsnPheValValAspGlnThrSerCysValArgAlaCysProPro275280285AspLysMetGluValAspLysAsnGlyLeuLysMetCysGluProCys290295300GlyGlyLeuCysProLysAlaCysGluGlyThrGlySerGlySerArg305310315320PheGlnThrValAspSerSerAsnIleAspGlyPheValAsnCysThr325330335LysIleLeuGlyAsnLeuAspPheLeuIleThrGlyLeuAsnGlyAsp340345350ProTrpHisLysIleProAlaLeuAspProGluLysLeuAsnValPhe355360365ArgThrValArgGluIleThrGlyTyrLeuAsnIleGlnSerTrpPro370375380ProHisMetHisAsnPheSerValPheSerAsnLeuThrThrIleGly385390395400GlyArgSerLeuTyrAsnArgGlyPheSerLeuLeuIleMetLysAsn405410415LeuAsnValThrSerLeuGlyPheArgSerLeuLysGluIleSerAla420425430GlyArgIleTyrIleSerAlaAsnArgGlnLeuCysTyrHisHisSer435440445LeuAsnTrpThrLysValLeuArgGlyProThrGluGluArgLeuAsp450455460IleLysHisAsnArgProArgArgAspCysValAlaGluGlyLysVal465470475480CysAspProLeuCysSerSerGlyGlyCysTrpGlyProGlyProGly485490495GlnCysLeuSerCysArgAsnTyrSerArgGlyGlyValCysValThr500505510HisCysAsnPheLeuAsnGlyGluProArgGluPheAlaHisGluAla515520525GluCysPheSerCysHisProGluCysGlnProMetGluGlyThrAla530535540ThrCysAsnGlySerGlySerAspThrCysAlaGlnCysAlaHisPhe545550555560ArgAspGlyProHisCysValSerSerCysProHisGlyValLeuGly565570575AlaLysGlyProIleTyrLysTyrProAspValGlnAsnGluCysArg580585590ProCysHisGluAsnCysThrGlnGlyCysLysGlyProGluLeuGln595600605AspCysLeuGlyGlnThrLeuValLeuIleGlyLysThrHisLeuThr610615620<210>5<211>1283<212>PRT<213>人（HomoSapiens）<400>5GlnSerValCysAlaGlyThrGluAsnLysLeuSerSerLeuSerAsp151015LeuGluGlnGlnTyrArgAlaLeuArgLysTyrTyrGluAsnCysGlu202530ValValMetGlyAsnLeuGluIleThrSerIleGluHisAsnArgAsp354045LeuSerPheLeuArgSerValArgGluValThrGlyTyrValLeuVal505560AlaLeuAsnGlnPheArgTyrLeuProLeuGluAsnLeuArgIleIle65707580ArgGlyThrLysLeuTyrGluAspArgTyrAlaLeuAlaIlePheLeu859095AsnTyrArgLysAspGlyAsnPheGlyLeuGlnGluLeuGlyLeuLys100105110AsnLeuThrGluIleLeuAsnGlyGlyValTyrValAspGlnAsnLys115120125PheLeuCysTyrAlaAspThrIleHisTrpGlnAspIleValArgAsn130135140ProTrpProSerAsnLeuThrLeuValSerThrAsnGlySerSerGly145150155160CysGlyArgCysHisLysSerCysThrGlyArgCysTrpGlyProThr165170175GluAsnHisCysGlnThrLeuThrArgThrValCysAlaGluGlnCys180185190AspGlyArgCysTyrGlyProTyrValSerAspCysCysHisArgGlu195200205CysAlaGlyGlyCysSerGlyProLysAspThrAspCysPheAlaCys210215220MetAsnPheAsnAspSerGlyAlaCysValThrGlnCysProGlnThr225230235240PheValTyrAsnProThrThrPheGlnLeuGluHisAsnPheAsnAla245250255LysTyrThrTyrGlyAlaPheCysValLysLysCysProHisAsnPhe260265270ValValAspSerSerSerCysValArgAlaCysProSerSerLysMet275280285GluValGluGluAsnGlyIleLysMetCysLysProCysThrAspIle290295300CysProLysAlaCysAspGlyIleGlyThrGlySerLeuMetSerAla305310315320GlnThrValAspSerSerAsnIleAspLysPheIleAsnCysThrLys325330335IleAsnGlyAsnLeuIlePheLeuValThrGlyIleHisGlyAspPro340345350TyrAsnAlaIleGluAlaIleAspProGluLysLeuAsnValPheArg355360365ThrValArgGluIleThrGlyPheLeuAsnIleGlnSerTrpProPro370375380AsnMetThrAspPheSerValPheSerAsnLeuValThrIleGlyGly385390395400ArgValLeuTyrSerGlyLeuSerLeuLeuIleLeuLysGlnGlnGly405410415IleThrSerLeuGlnPheGlnSerLeuLysGluIleSerAlaGlyAsn420425430IleTyrIleThrAspAsnSerAsnLeuCysTyrTyrHisThrIleAsn435440445TrpThrThrLeuPheSerThrIleAsnGlnArgIleValIleArgAsp450455460AsnArgLysAlaGluAsnCysThrAlaGluGlyMetVa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