特异性结合c-met的sema域中表位的抗体的制作方法
【专利摘要】特异性结合c-Met蛋白的SEMA域中的表位的一种抗体或其抗原结合片段，以及与其相关的药物组合物、方法、试剂盒、核酸和细胞。
【专利说明】特异性结合C-MET的SEMA域中表位的抗体
发明领域
[0001]本发明涉及特异性结合C-Met蛋白的SEMA域中的表位的抗体或其抗原结合片段，以及与其相关的药物组合物、方法、试剂盒、核酸和细胞。
[0002]发明背景
[0003]肝细胞生长因子(HGF)是一种间充质来源的多效性(pleitrophic)细胞因子，其结合酪氨酸激酶受体c-Met的胞外区以诱导各种正常细胞和肿瘤细胞中的有丝分裂发生、移动、形态发生和血管发生。HGF/c-Met信号传导途径的调控牵涉到与癌症有关的多种机制如肿瘤进展、转移、迁移、侵入和血管发生。另外，认为c-Met扩增或突变驱动不依赖于配体的肿瘤发生。因此，c-Met最近显现为抗癌疗法的新靶物。
[0004]具体而言，已知C-Met涉及诱导针对普遍使用的抗癌药物的抗性，如此被视为个性化治疗中的重要参与者。靶向表皮生长因子受体(EGFR)(ERBB1)的代表性抗癌药物，如爱必妥(Erbitux)和特罗凯(Tarceva)，通过阻断与癌症进展有关的信号转导来起作用。作为乳腺癌药物而众所周知的赫塞汀(Here印tin)靶向ERBB2 (HER2)且通过阻断细胞增殖所需的信号转导来起作用。然而，最近的发现指示，在对上述药物有抗性的患者中，由于c-Met的过表达和其他引起细胞增殖的信号转导类型的活化，抗癌药物不起作用。因此，许多药物公司正在开发抑制c-Met的抗癌药物。
[0005]有关领域公开了抑制c-Met功能的治疗性抗体药物。然而，在此有关领域中，具有初始结构的抗体诱导c-Met分子的二聚化，由此导致癌症。
[0006]在另一个公开了抑制C-Met功能的治疗性抗体药物的有关领域中，所述抗体能抑制c-Met对作为c-Met配体的HGF c-Met的结合，但抗体对c_Met的结合以不依赖于该配体的方式诱导c-Met的二聚化。因此，所述抗体充当诱导致癌信号的转导的激动剂。
[0007]另一个有关领域公开的是，为了预防c-Met的二聚化，利用遗传重组方法通过修饰双臂抗体形式的激动剂来制备针对c-Met的单臂形式拮抗性抗体，其目前正在进行临床试验中的产品开发。然而，即使在这一有关领域中，所述抗体也仅在与化学疗法一起进行治疗时起作用，而当该抗体独立治疗时，抗癌疗效经证实是较低的。因此，需要研究c-Met上的靶物来开发抑制c-Met功能的新药物组合物用于预防或治疗癌症。
【发明内容】
[0008]技术问题
[0009]本发明提供特异性结合c-Met蛋白SEMA域中的表位的抗体或其抗原结合片段。
[0010]本发明还提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，治疗癌症的方法，筛选c-Met拮抗剂的方法，用于诊断癌症的试剂盒，编码所述抗体或抗原结合片段的核酸，包含该核酸的细胞，和用于制备所述抗体或抗原结合片段的方法。
[0011]问题解决方 案
[0012]现将对实施方案进行详细提述，其例子例示在伴随的附图中，其中同样的参照编号始终指同样的要素。在此方面，本申请实施方案可以具有不同的形式且不应理解为限制本文中所述的说明。因此，参照附图在下文对实施方案的描述仅为解释本说明书的各方面。如本文中使用的，术语“和/或”包括一种或多种所列关联项目的任意和所有组合。
[0013]依照本发明的一个实施方案，提供一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合c-Met蛋白SEMA域中的表位，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分。
[0014]术语“c-Met”或“c-Met蛋白”指结合肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶。c-Met蛋白包括由标识为GenBank登录号NM_000245的核苷酸序列编码的多肽，标识为GenBank登录号NM_000236的多肽序列编码的蛋白质,或其胞外域。受体酪氨酸激酶c-Met参与多种机制，如癌症形成、转移、迁移、侵入和血管发生。
[0015]HGF受体c-Met具有3个区域:胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区由SEMA域(其为HGF结合域，具有α亚基通过二硫键连接β亚基的结构)，丛蛋白-臂板蛋白(semaphorin)-整联蛋白(PSI)同源性域，以及丛蛋白和转录因子(IPT)域共享的免疫球蛋白样折叠组成。换言之，c-Met蛋白的SEMA域存在于c-Met的胞外区中且对应于HGF结合区。具体地，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或其部分的表位与c-Met蛋白SEMA域中各个表位的第二和第三螺旋桨(propeller)域之间的环区对应。
[0016]术语“表位”用于本文指示抗原决定簇且解释为意指抗原上由抗体识别的位点。表位可以是具有SEQ ID N0:2或3的氨基 酸序列的多肽。所述多肽也可以是存在于c-Met蛋白SEMA域中的表位。
[0017]具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的表位对应于c_Met蛋白SEMA域中第二和第三螺旋桨域之间的环区的最外部区，而具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的表位指抗体或其抗原结合片段最特异性结合的位点。
[0018]抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区氨基酸序列:SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6，以及轻链可变区，其包含至少一种选自下组的轻链互补性决定区氨基酸序列:SEQ ID NO: 7, SEQ ID N0:8和SEQ IDN0:9。
[0019]所述重链可变区可具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，而轻链可变区可具有SEQ IDNO: 11的氨基酸序列。
[0020]所述抗体或其抗原结合片段可以是选自下组的抗原结合片段:单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，或选自下组的抗原结合片段:scFv、(scFv)2、Fab、Fab’和F(ab，)2。
[0021]天然存在的完整抗体或免疫球蛋白包含4个多肽:两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键连接至一条重链。每条重链具有恒定区和可变区。类似地，每条轻链具有恒定区和可变区。重链有5类(同种型):gamma( Y ) > mu ( μ ) > alpha ( α )、delta ( δ )、或 epsilon ( ε ),和另外几种亚类 gamma I ( y I) > gamma2 ( y 2) > gamma3 ( y 3) >gamma4 ( y 4)、alphal (a I)、和 alpha2 ( a 2)。轻链恒定区可以为 kappa ( κ )或 lambda ( λ )型。抗体中的可变区在序列中不同且用于给定抗体对其特定抗原的结合和特异性。
[0022]术语“重链”用于本文理解为包括全长重链及其片段，所述全长重链包含具有决定对抗原特异性的氨基酸序列的可变区(Vh)和具有3个恒定域(CH1、CH2和Ch3)的恒定区。另外，术语“轻链”用于本文理解为包括全长轻链及其片段，所述全长轻链包含具有决定对抗原特异性的氨基酸序列的可变区和恒定区Q。[0023]术语“互补性决定区(CDR) ”用于本文指见于免疫球蛋白重链或轻链的可变区中的氨基酸序列。CDR决定抗体的特异性且可以提供用于结合抗原特异性表位的接触残基。重链和轻链可分别包含3个CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3 ;和CDRLl、CDRL2和CDRL3)。具有比CDR更高保守性氨基酸序列的4个框架区将Vh或 '中的CDR区分开。
[0024]术语“抗原结合片段”用于本文指完整免疫球蛋白的片段，以及包含具有特异性结合抗原能力的抗原结合区的任意多肽部分。例如，抗原结合片段可以是F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段或scFv片段，但不限于此。Fab片段具有一个抗原结合位点，且含有轻链和重链的可变区、轻链恒定区、和重链的第一恒定区CH1。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于Fab’片段另外包含重链的铰链区，其包含位于重链Chi区C末端的至少一个半胱氨酸残基。？(&13’)2片段凭借Fab’片段的半胱氨酸残基通过二硫键在铰链区联合而产生。Fv片段是最小的抗体片段，仅具有重链可变区和轻链可变区，且用于生成Fv片段的技术是本领域中公知的。双链Fv片段可具有其中重链可变区通过非共价键连接轻链可变区的结构。单链Fv片段一般可以具有如同双链Fv片段中的二聚体结构，其中重链可变区经由肽接头共价结合轻链可变区，或者重链和轻链可变区在其C末端彼此直接连接。抗原结合片段可使用蛋白酶得到(例如，完整抗体用木瓜蛋白酶消化获得Fab片段，而用胃蛋白酶消化获得F (ab’)2片段)，而且可通过使用遗传重组技术来制备。
[0025]c-Met可以源自选自下组的c_Met:人c_Met、猴c_Met、小鼠c_Met和大鼠c_Met。
[0026]依照本发明的另一个实施方案，提供一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含治疗有效量的特异 性结合c-Met蛋白SEMA域中表位的抗体或其抗原结合片段，和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分。
[0027]所述癌症可以是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球内黑素瘤、直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺的癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、或者头或颈部的癌。
[0028]所述表位可以是具有SEQ ID N0:2或3的氨基酸序列的多肽。
[0029]用于预防或治疗癌症的药物组合物可以包含药学可接受的载体。所述药学可接受的载体可以是乳糖、右旋糖(dextrose)、鹿糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶(gumacacia)、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆剂、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸盐/酯、丙基羟基苯甲酸盐/酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。所述药物组合物还可包括滑润剂、加湿剂、增甜剂、增味剂(flavor enhancer)、乳化剂、混悬剂和/或防腐剂。
[0030]用于预防或治疗癌症的药物组合物可口服或胃肠外施用。胃肠外施用可包括静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、内皮施用、局部施用、鼻内施用、肺内施用、和直肠施用。由于口服施用导致蛋白质或肽的消化，因此必须将活性成分包裹或配制在药物组合物中以防止消化。另外，所述药物组合物在施用时可装备有靶向能力以返回特定细胞。
[0031]用于预防或治疗癌症的药物组合物的合适剂量可能取决于许多因素，如配制方法、施用方法、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、施用时间、施用路径、排泄速度和反应敏感性。期望的药物组合物剂量对于成人可以在约0.0Ol至100mg/kg的范围内。术语“治疗有效量”用于本文指用于预防或治疗癌症或血管发生相关疾病的足够的量。
[0032]所述药物组合物可与药学可接受的载体和/或赋形剂通过本领域公知的方法配制成单位剂量或多剂量形式。在此方面，制剂可以是油或水性介质中的溶液、混悬剂、糖浆齐?、乳化溶液、提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊，且可进一步包含分散剂或稳定剂。另外，所述药物组合物可施用为单独的药物，或与其他药物一起施用，且可以与先前存在的药物序贯或同时施用。所述药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，如此可配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体可使用本领域中公知的方法制备。所述免疫脂质体是包括磷脂酰胆碱、胆固醇、和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，且可以通过逆相蒸发方法制备。例如，Fab’片段可经由硫醇-二硫键交换附接于脂质体。脂质体中还可包含化学药物如多柔比星(doxorubicin)。
[0033]所述抗体或抗原结合片段可以是C-Met蛋白的拮抗剂。
[0034]术语“拮抗剂”在本文中以最广义使用，且理解为包括部分或完全阻断、抑制和/或中和靶物(例如c-Met)的至少一种生物学活性的所有分子。例如，术语拮抗剂抗体指抑制或降低抗体结合的抗原(例如c-Met)的生物学活性的抗体。拮抗剂可以降低受体磷酸化，或者使配体通过受体相对于配体的结合所活化的细胞失活或将其杀伤。另外，拮抗剂可完全阻断受体和配体之间的相互作用，或者通过改变受体的三级结构或下调而实际性减少其间的相互作用。
[0035]在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可以包含重链可变区，其包含至少一种选自下组的重链互补性决定区氨基酸序列:SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7和SEQ IDN0:8，以及轻链可变 区，其包含至少一种选自下组的轻链互补性决定区氨基酸序列:SEQ IDN0:9、SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11。另外，所述重链可变区可具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列，而所述轻链可变区可具有SEQ ID N0:13的氨基酸序列。
[0036]依照本发明的另一个实施方案，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者施用一种药物组合物，其包含治疗有效量的特异性结合c-Met蛋白SEMA域中表位的抗体或其抗原结合片段以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中所述表位具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列或其部分。
[0037]用于预防或治疗癌症的药物组合物和施用方法如上文描述的。
[0038]用于预防或治疗癌症的药物组合物所给药的受试者可以包括动物。例如，所述动物可以是人、犬、猫或小鼠。
[0039]依照本发明的另一个实施方案，提供一种筛选C-Met拮抗剂的方法，所述方法包括:使SEMA域中的表位与要分析的样品接触，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分；检测所述表位对样品的结合，其中，如果所述表位和样品展现出范围从约IpM至约IOnM的结合亲和力，那么所述样品是候选的c-Met拮抗剂。
[0040]在该筛选方法中，首先，使c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分)与要分析的样品接触。所述c-Met蛋白可以源自，但不限于选自下组的c-Met:人、猴、小鼠和大鼠。术语样品用于本文指用于筛选方法中以确认样品是否结合c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分)的特定材料。样品的例子包括但不限于，多肽如抗体及其抗原结合片段、化学物、多核苷酸、反义-RNA、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和天然提取物。
[0041]其后，测量要分析的样品与c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分)的结合亲和力。结合亲和力的测量可使用本领域中已知的多种方法进行。例如，可以使用Biacore装置来测量结合亲和力。一般而言,可允许作为治疗型药物的结合亲和力的范围可限定为使得结合常数Kd为IOnM或更小。亦即，例如使用Biacore装置通过表面等离振子共振测量c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分)与要分析的样品(例如抗体)之间的结合亲和力时，如果结合亲和力范围为约IpM至约IOnM,约IOpM至约IOnM,或约IOOpM至约IOnM,那么可确定该样品(例如抗体)为用于诊断、预防或治疗癌症的候选材料。
[0042]所述表位可以是具有SEQ ID NO:2或3的氨基酸序列的多肽。换言之，即使在将具有SEQ ID N0:2或3的氨基酸序列的多肽代替c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQID NO:1的氨基酸序列或其部分)而用于筛选方法时，也可以获得相同的筛选结果。
[0043]依照本发明的另一个实施方案，提供一种用于诊断癌症的试剂盒，其包含抗体或其抗原结合片段以及其他利用抗体、抗体片段和蛋白质的表位结合来用于多种应用的生物技术工具。
[0044]癌症可以是但不限于肺癌或卵巢癌。在患有肺癌或卵巢癌的一些患者中，已知c-Met蛋白SEMA域中表位的SEQ ID N0:3氨基酸序列中的第168位氨基酸，即Glu被Asp取代(M.Sattler 等,Ther.Adv.Med.0ncol.，3 ⑷:171-184 (2011))。
[0045]特异性结合c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列、SEQID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID N0:3的氨基酸序列)的抗体或抗原结合片段可包含在生物学样品中。例如，所述 生物学样品可以是但不限于，怀疑的癌症患者的组织、细胞或全血。
[0046]特异性结合c-Met蛋白SEMA域中的表位(具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分、SEQ ID NO:2的氨基酸序列或SEQ ID NO:3的氨基酸序列)的抗体或抗原结合片段与具有SEQ ID N0:3的氨基酸序列的表位有高结合亲和力，而与具有上述变异的c-Met蛋白表位(SEQ ID NO:70)有低结合亲和力。如此，如果源自怀疑的癌症患者的生物学样品在与具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的表位接触时形成抗原-抗体复合物，但与具有SEQ IDNO: 70的氨基酸序列的表位接触时不形成抗原-抗体复合物，那么所述患者可能诊断为患有癌症。
[0047]可使用多种检测方法来确认抗原-抗体复合物的形成，如比色方法、电化学方法、荧光计量方法、化学发光计量学(Iuminometry)、颗粒计数方法、视觉评估方法或闪烁计数方法。
[0048]术语“检测”用于本文指用于检测抗原-抗体复合物的过程，使用各种标志物实施。标志物的例子包括但不限于，酶、荧光材料、配体、发光材料、纳米颗粒和放射性同位素。
[0049]酶的例子包括乙酰胆碱酯酶、碱性磷酸酶、β -D-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶和β-内酰胺酶。荧光材料的例子包括荧光素、Eu3+、Eu3+螯合物和穴合物(cryptat印)。配体可以是生物素衍生物等。发光材料可以是吖啶酯、异氨基苯二酰肼(isoluminol)衍生物等。纳米颗粒的例子包括胶体金纳米颗粒和有色乳胶纳米颗粒。放射性同位素的例子包括57Co、3H、125I 和 1251-Bonton Hunter 试剂。
[0050]例如，所述抗原-抗体复合物可使用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来检测。ELISA方法的例子包括使用识别固定化于固体支持物上的抗原的经标记抗体的直接ELISA，使用识别(抗体识别固定化于固体支持物上的抗原的)复合物中的捕捉抗体的经标记二抗的间接ELISA，使用识别固定化于固体支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原的另一种经标记抗体的直接夹心式ELISA，和间接夹心式ELISA，其中使识别固定化于固体支持物上的抗原-抗体复合物中的抗原的另一种经标记抗体反应，然后使用识别所述另一种经标记抗体的经标记的二抗。所述抗体或其抗原结合片段可具有可检测的标志物。如果所述抗体或其抗原结合片段不具有可检测的标志物，那么可将其用另一种抗体处理，该抗体能够捕捉所述抗体或其抗原结合片段且具有可检测的标志物。
[0051 ] 依照本发明的另一个实施方案，提供编码特异性结合c-Met蛋白的SEMA域中的表位的抗体或抗原结合片段的核酸，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分。编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸可以是，例如DNA或RNA，且任选地可以包含在载体中。
[0052]依照本发明的另一个实施方案，提供一种细胞，其包含编码特异性结合C-Met蛋白SEMA域中的表位的抗体或抗原结合片段的核酸，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分。
[0053]依照本发明的另一个实施方案，提供一种制备特异性结合c-Met蛋白SEMA域中的表位的抗体或抗原结合片段的方法，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分，所述方法包括在细胞中表达编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
[0054]附图简述
[0055]这些和/或其他方面将从对以下实施方案的描述连同伴随的附图变得更加明显和更容易领会，附图中:
[0056]图1显示使用重叠延伸PCR来获得huAbF46抗体的scFv库基因，其中目标⑶R已
突变；
[0057]图2显示依照一个实施方案，确认小鼠抗体AbF46对全长c_Met的识别的结果；
[0058]图3的一组图是显不依照一个实施方案，确认小鼠抗体AbF46对SEMA域的识别的结果;
[0059]图4的一组图是显示依照一个实施方案，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)进行huAbF46的表位作图的结果；
[0060]图5a和5b是依照一个实施方案，确认huAbF46的表位在SEMA域上位置的图；
[0061]图6a和6b是显示依照一个实施方案,通过BrdU测定法确认人源化抗体huAbF46的激动作用程度的结果的图；
[0062]图7 是依照一个实施方案，例示 huAbF46-H4-Al、huAbF46-H4_A2、huAbF46-H4_A3和huAbF46-H4-A5抗体的体外细胞活力的结果的图；
[0063]图8a和8b是显示依照一个实施方案,通过Akt磷酸化确认人源化抗体huAbF46的激动作用程度的结果的图；
[0064]图9例示依照一个实施方案，通过测量c-Met的降解程度，显示huAbF46-H4_Al、huAbF46-H4-A2、huAbF46-H4-A3 和 huAbF46_H4_A5 抗体的抗癌效果；
[0065]图10显示依照一个实施方案，人源化抗体huAbF46的体外细胞活力分析的结果； [0066]图1la至Ilc显示依照一个实施方案，通过用小鼠脑癌异种移植物模型或胃癌异种移植物模型，分析小鼠抗体AbF46和嵌合抗体chAbF46的体内抗癌效果的结果；和
[0067]图12显示依照一个实施方案，通过用小鼠肺癌异种移植物模型，分析小鼠抗体AbF46和人源化抗体huAbF46的体内抗癌效果的结果。
实施例
[0068]现将参照以下实施例对本发明的一个或多个实施方案进行更详细地描述。然而，这些实施例仅用于例示目的且不意图限制本发明的范围。
[0069]实施例1:生成针对c-Met的小鼠抗体AbF46
[0070](I)小鼠的免疫
[0071]为了获得形成杂交瘤细胞系所需的免疫小鼠，将IOOug人c-Met/Fc融合蛋白(R&DSystems)和相同量的完全弗氏佐剂混合，并经由腹膜内注射将混合物施用到5只4至6周龄BALB/c小鼠(Japan SLC, Inc.)的每一只中。2周后，使用与上文所述相同的方法将抗原(先前注射量的一半)与不完全弗氏佐剂混合，并经由腹膜内注射将混合物施用到每只小鼠中。I周后，实施末次加强注射，并在3天后从每只小鼠的尾部收集血液以获得血清。然后，将血清以1/1000用PBS稀释，并进行ELISA来分析识别c-Met的抗体的滴度是否提高。之后，选出其中获得充足量抗体的小鼠，并在选出的小鼠上进行细胞融合过程。
[0072](2)细胞融合和 杂交瘤细胞的制备
[0073]在细胞融合实验3天前，经由腹膜内注射将50ug PBS与人c-Met/Fc融合蛋白的混合物施用给每只小鼠。将每只免疫后小鼠麻醉，然后提取其位于身体左侧的脾并用网磨碎(ground with a mesh)以分离细胞，将其与培养基(DMEM)混合来制备脾细胞悬浮液。将该悬浮液离心以收集细胞层。将获得的IxlO8个脾细胞与IO8个骨髓瘤细胞(Sp2/0)混合，并将混合物离心以将细胞沉淀。将沉淀物缓慢分散，用lml45% (w/v)聚乙二醇(PEG)的DMEM溶液处理，并在37°C维持I分钟，接着添加Iml DMEM0在引入另外的IOml DMEM达I分钟后，将所得物在37°C水浴中维持5分钟。使其总量达到50ml，并将所得物离心。将所得细胞沉淀物以1-2 X IO5个细胞/ml的浓度重悬于分离培养基(HAT培养基)。然后，将所得物分布于96孔板(0.1ml每孔)，将其置于37°C二氧化碳培养箱中来制备杂交瘤细胞。
[0074](3)选择产生针对c-Met蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞
[0075]为了从(2)中制备的杂交瘤细胞选出特异性结合c-Met的杂交瘤细胞，使用人c-Met/Fc融合蛋白和人Fe蛋白作为抗原通过ELISA来筛选制备的杂交瘤细胞。
[0076]将50ul (2ug/ml)人c-Met/Fc融合蛋白包被在微滴定板的每个孔上，并通过清洗除去未反应的抗原。为了排除结合Fe而非c-Met的抗体，使用与上文相同的方法在另一个微滴定板的每个孔上包被人Fe蛋白。然后，将50ul的杂交瘤细胞悬浮液添加到这些微滴定板的每个孔以反应I小时。接着，将这些微滴定板用磷酸盐缓冲液-tween20 (TBST)溶液清洗以除去未反应的培养基。向其添加山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(IgG-HRP)，并允许反应在室温进行I小时，用TBST溶液进行清洗。之后，向每个孔添加过氧化物酶的底物溶液(OPD)，并通过使用ELISA读数器测量在450nm处的吸收来评估反应程度。经由此方法，重复地选择能产生对人c-Met蛋白而非对人Fe蛋白高度特异性的抗体的杂交瘤细胞系。在获得的杂交瘤细胞系上进行有限稀释以获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系的单个克隆。选出的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系在Korean Cell Line Bank以登录号KCLRF-BP-00220登记。
[0077](4)单克隆抗体的产生和纯化
[0078]将在上文(3)中获得的杂交瘤细胞在无血清培养基中培养以产生单克隆抗体，并从培养物将其纯化。
[0079]首先，将在有10% FBS的50ml培养基(DMEM)中培养的AbF46杂交瘤细胞离心以获得细胞沉淀物，将其用20ml PBS清洗超过2次以除去FBS。然后，引入50ml DMEM以将细胞沉淀物重悬，并将所得物在37°C二氧化碳培养箱中温育3天。在离心以移出产生抗体的细胞之后，将包含抗体的细胞培养物分离并储存于4°C，或直接使用。使用装备有亲和柱(蛋白G琼脂糖柱Pharmacia, USA)的AKTA纯化装置(GE Health)从50至300ml培养物中纯化出抗体，并通过使用用于蛋白质聚集的滤器(Amicon)将上清液用PBS替换来存储纯化的抗体。
[0080]实施例2:制备针对c-Met的嵌合抗体chAbF46
[0081]一般地，当将小鼠抗体施用到人中用于治疗目的时，其很可能引起免疫排斥反应。为了解决此问题，从依照实施例1制备的小鼠抗体AbF46来制备嵌合抗体chAbF46,其中恒定区(而非牵涉抗原结合的可变区)被人抗体IgGl的序列取代。
[0082]合成具有对应于’EcoR1-信号序列-VH-Nhel-CH-TGA-XhoI’(SEQID NO: 12)的重链碱基序列的基因，并合成具有对应于’ EcoR1-信号序列-VL-BsiW1-CL-TGA-XhoI’ (SEQID N0:13)的轻链碱基序列的基因。然后，通过使用限制酶EcoRI(NEB，R0101S)将具有对应于重链的碱基序列的DNA片段(SEQ ID NO: 12)克隆到包含在由Invitrogen制造的0ptiCH0?Antibody Express试剂盒(目录号 12762-019)中的pOptiVECtm-TOPO TA Cloning试剂盒中，通过使用限制酶XhoI (NEB, R0146S)将具有对应于轻链的碱基序列的DNA片段(SEQ ID NO: 13)克隆到包含在由 Invitrogen 制造的 OptiCHO? Antibody Express 试剂盒(目录号 12762-019)中的 pcDNA?3.3-T0P0 TA Cloning 试剂盒(目录号 8300-01)中，由此完成用于表达嵌合抗体的载体的构建。
[0083]将每种构建的载体使用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增。将包含具有重链碱基序列的DNA片段的载体和包含具有轻链碱基序列的DNA片段的载体以4:l(80ug:20ug)的比率转染到添加了 360ul2M CaCl2的2.5xl07个293T细胞中。接着，将转染的细胞在包含10% FBS的DMEM培养基中于37°C在5% CO2中培养5小时，然后在不含FBS的DMEM培养基中于37°C在5% CO2中培养48小时。 [0084]将培养的细胞离心以获得100mL的上清液，并使用AKTA Prime (GE healthcare)将上清液纯化。将蛋白A柱(GE healthcare, 17-0405-03)安装于AKTA Prime中，并使培养物以5ml/分钟的流速流动从其通过,用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific, 21004)洗脱。将缓冲液用PBS缓冲液替换，由此获得最终纯化的嵌合抗体AbF46 (下文中称为chAbF46)。
[0085]实施例3:从嵌合抗体chAbF46制备人源化抗体huAbF46
[0086](I)重链人源化
[0087]为了设计Hl-重链和H3-重链，首先，经由NCBI Ig Blast分析与小鼠抗体AbF46的VH基因最同源的人种系基因。结果，确认VH3-71在氨基酸水平具有83%同源性，小鼠抗体AbF46的CDR-Hl、CDR-H2和CDR-H3通过Kabat编号方式定义，并将小鼠抗体AbF46的⑶R引入VH3-71基因的框架中。在此方面，将第30、48、73和78位的氨基酸回复突变为小鼠AbF46抗体的初始氨基酸序列(即分别为(S — T)、(V — L)、(D — N)和(T — L))。然后，还突变位置第83和84位的氨基酸(即分别为(R —K)和(A —T))，由此完成Hl-重链(SEQ ID NO: 14)和 H3-重链(SEQ ID NO: 15)的构建。
[0088]为了设计H4-重链，搜寻人抗体框架的序列。结果，用已知最稳定的现存VH3亚型，发现了具有与小鼠抗体AbF46的框架序列紧密同源的序列且通过Kabat编号方式定义的小鼠抗体 AbF46 的 CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3，将其用于构建 H4-重链(SEQ ID NO: 16)。
[0089](2)轻链人源化
[0090]为了设计 Hl-轻链(SEQ ID NO: 17)和 H2-轻链(SEQ ID NO: 18)，首先，经由 NCBIIg Blast分析与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。结果，确认VK4-1在氨基酸水平具有75%同源性，小鼠抗体AbF46的CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L3通过Kabat编号方式定义，并将小鼠抗体AbF46的CDR引入VK4-1基因的框架中。在此方面，在Hl-轻链中，将第36、46和49位的氨基酸回复突变为小鼠AbF46抗体的初始氨基酸序列(即分别为(Y — H)、(L-M)和(Y — I))，而在H2-轻链中，仅第49位的氨基酸回复突变(即(Y — I))，由此完成Hl-轻链和H2-轻链的构建。
[0091]为了设计H3-轻链(SEQ ID NO: 19)，经由NCBI Blast分析与小鼠抗体AbF46的VL基因最同源的人种系基因。结果，发现VK2-40以及VK4-1。确认VK2-40与小鼠抗体AbF46VL在氨基酸水平具有61 %同源性，小鼠抗体AbF46的CDR-Ll、CDR-L2和CDR-L3通过Kabat编号方式定义，并将小鼠抗体AbF46的 ⑶R区引入VK4-1框架中。在H3-轻链中，将第36、46和49位的氨基酸回复突变(即分别为Y — H、L — M和Y — I)。
[0092]为了设计H4-轻链(SEQ ID NO:20)，搜寻人抗体框架的序列。结果，使用已知为最稳定的现存VKl亚型引入通过Kabat编号定义的小鼠抗体AbF46的⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3。在此方面，将第36、46和49位的氨基酸进一步回复突变(即分别为Y — H、L — M和Y — I)从而构建H4-轻链。
[0093]之后，通过使用限制酶EcoRI (NEB, R0101S)将具有对应于重链的碱基序列的DNA片段(Hl-重链:SEQ ID NO: 21，H3-重链:SEQ ID NO: 22，H4-重链:SEQ ID NO:23)克隆至Ij包含在由 Invitrogen 制造的 0ptiCH0?Antibody Express 试剂盒(目录号 12762-019)中的pOptiVECtm-TOPO TA Cloning试剂盒中，通过使用限制酶XhoI (NEB, R0146S)将具有对应于轻链的碱基序列的DNA片段克隆到包含在由Invitrogen制造的0ptiCH0?AntibodyExpress试剂盒(目录号12762-019)中的pcDNA?3.3-T0P0 TA Cloning试剂盒中，由此完成用于表达人源化抗体的载体的构建。
[0094]将每种构建的载体使用Qiagen Maxiprep试剂盒(目录号12662)扩增。将包含具有重链碱基序列的DNA片段的载体和包含具有轻链碱基序列的DNA片段的载体以4:l(80ug:20ug)的比率转染到添加了 360ul2M CaCl2的2.5xl07个293T细胞中。接着，将转染的细胞在包含10% FBS的DMEM培养基中于37°C在5% CO2中培养5小时，然后在不含FBS的DMEM培养基中于37°C在5% CO2中培养48小时。
[0095]将培养的细胞离心以获得100mL的上清液，并使用AKTA Prime (GE healthcare)将上清液纯化。将蛋白A柱(GE healthcare, 17-0405-03)安装于AKTA Prime中，并使培养物以5ml/分钟的流速流动从其通过,用IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific, 21004)洗脱。将缓冲液用PBS缓冲液替换，由此获得最终纯化的人源化抗体AbF46(下文中称为huAbF46)。在此方面，后面实施例中使用的人源化抗体AbF46包含H4-重链和H4-轻链。huAbF46-H4的重链可变区(VH)具有氨基酸序列’ EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSffVRQAPGKGLEffL GFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWFAYffGQGTLVTVSS' (SEQ ID NO: 83)，而 huAbF46_H4 的轻链可变区(VL)具有氨基酸序列 ’ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLASGNQNNYLAffHQQKPGKA PKMLIIWASTRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAP LTFGQGTKVEIKR’ (SEQ ID NO:84)。
[0096]实施例4:从huAbF46抗体选择亲和力成熟的Ab并鉴定其结合亲和力
[0097](I)制备 huAbF46 抗体的 scFv 库
[0098]通过使用huAbF46抗体的重链可变区和轻链可变区来设计用于制备huAbF46抗体的scFv的各个基因。每一种重链可变区和轻链可变区都设计为具有’ VH-接头-VL’形式，其中接头设计为具有氨基酸序列’GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS’(SEQ ID NO:28)。合成(Bioneer, Inc.)如上述设计的编码huAbF46抗体的scFv的多核苷酸(SEQ ID NO:29),而用于表达该多核苷酸的载体表示为SEQ ID NO: 30。然后，分析由该载体表达的所得物，并鉴定c-Met特异性结合。
[0099](2)制备用于亲和力成熟的基因库
[0100]I)靶⑶R的选择和引物的制备
[0101]为进行huAbF46抗体的亲和力成熟，通过’Kabat编号法’从制备的小鼠抗体AbF46限定出6个互补性决定区(OTR)。⑶R显示于表1中。
[0102]【表1】
[0103]
_CDRl__CDR2_CDR3_
AbF46 重链 CDR 氨 DYYMSFIRNKANGY丁Τ? DNWFAY
基酸序列(SEQ ID NO: 4) YSASVKG(SEQ ID NO: 6)
__(SEQ ID NO: 5)__
AbF46 轻链 CDR氨 KSSQSLLASGNQ WASTRVS QQSYSAPLT基酸序列 NNYLA (SEQ ID (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9)_|no: 7)___
[0104]如下制备引物以随机引入靶⑶R序列。依照随机引入序列的现有方法，使用N密码子从而可将任意碱基以相同比率(25% A、25% G、25% C和25% T)引入要突变的位点。然而，依照当前的实施方案，为了将碱基随机引入huAbF46抗体的⑶R中，85%的第一和第二核苷酸在编码每个CDR的氨基酸的3种野生型核苷酸之间为保守的，其它3种碱基中每一种的5%是引入的。另外，将引物设计为使得3种碱基能引入到第三个核苷酸中(33%G、33% C 和 33% T)。
[0105]2)huAbF46抗体库的制备和对c_Met结合力的鉴定
[0106]用上述操作(I)中制备的引物来构建抗体基因库。用编码huAbF46抗体的scFv的多核苷酸作模板。如图1所示制备两种PCR片段，通过重叠延伸PCR来构建针对6种CDR中每一种的库。
[0107]鉴定野生型抗体(huAb46的scFv)和库抗体对c_Met的结合力。当大多数库抗体对c-Met的结合力低于野生型抗体的时,鉴定出其中对c-Met的结合力未降低的突变体。
[0108](3)从所述库选择具有改进的亲和力的抗体
[0109]对具有改进的c-Met结合力的库抗体测序。获得的序列显示于下表2，并转化成IgG。在下面的克隆中，选出从L3-l、L3-2、L3-3和L3-5产生的4种类型的抗体并使用这些抗体实施后续实验。从L3-1产生的抗体的轻链可变区(VL)具有氨基酸序列’ DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLASGNQNNYLAWHQQKPGKAP KMLIIWASTRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSRPY TFGQGTKVEIKR’ (SEQ ID NO:85)。
[0110]【表2】
[0111]
【权利要求】
1.一种抗体或其抗原结合片段，其特异性结合C-Met蛋白SEMA域中的表位，其中所述表位具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其部分。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述表位由SEQID N0:2或3组成。
3.权利要求1或2的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含至少一个选自下组的重链互补性决定区氨基酸序列:SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5和SEQ ID NO:6，而所述轻链可变区包含至少一个选自下组的轻链互补性决定区氨基酸序列:SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9。
4.权利要求3的抗体或抗原结合片段，其中所述重链可变区包含SEQID NO: 10的氨基酸序列，而所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
5.权利要求1-4中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或选自下组的抗原结合片段:scFv、(scFv)2、Fab、Fab’ 和 F(ab’)2。
6.权利要 求1-5中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述c-Met蛋白是人c-Met、猴c_Met、小鼠 C-Met 和大鼠 C-Met。
7.权利要求1-6中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是c-Met蛋白的拮抗剂。
8.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-7中任一项的抗体或抗原结合片段，和药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述癌症是鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、皮肤癌、皮肤或眼球内黑素瘤、直肠癌、肛门附近的癌、食道癌、小肠肿瘤、内分泌腺的癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肝细胞瘤、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞腺瘤、乳腺癌、结肠癌、大肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺肿瘤、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、或者头或颈部的癌。
10.一种治疗癌症的方法，所述方法包括对受试者施用权利要求1-9中任一项的抗体或抗原结合片段，或包含权利要求1-9中任一项的抗体或抗原结合片段的药物组合物，以及药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
11.一种筛选c-Met拮抗剂的方法，所述方法包括: 使c-Met蛋白的SEMA域中的表位与要分析的样品接触，其中所述表位包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列；并 检测所述表位对所述样品的结合， 其中，如果所述表位和所述样品展现出从约IpM至约IOnM的结合亲和力，那么所述样品是候选的c-Met拮抗剂。
12.权利要求11的方法，其中所述表位由SEQID NO:2或3组成。
13.权利要求11或12的方法，其中所述样品包含抗体。
14.权利要求11的方法，其中所述方法用于筛选供诊断、预防或治疗癌症的候选物材料。
15.一种用于诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包含依照权利要求1-7中任一项的抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述癌症是肺癌或卵巢癌。
17.编码权利要求1-7中任一项的抗体或抗原结合片段的核酸，任选地在载体中。
18.包含权利要求17的核酸的细胞。
19.一种制备抗体或抗原结合片段的方法，包括在细胞中表达权利要求17的核酸。
【文档编号】A61P35/00GK103987730SQ201280059987
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2012年10月5日 优先权日:2011年10月5日
【发明者】郑光镐, 金敬儿, 李承炫, 宋镐英, 宋允姃, 吴永美, 郑收砚, 赵美英 申请人:三星电子株式会社