在基因沉默中具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物的制作方法

本发明涉及可由基因沉默操作的生物医药和治疗领域。更具体地，本发明涉及在基因沉默中具有降低的脱靶效应的活性剂的结构、组合物和用途。所述活性剂是可用于基因沉默，以及用于治疗转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性的方法等中的UNA寡聚物。

发明背景

基因沉默技术如RNA干扰的主要缺点是脱靶效应的发生。脱靶效应发生于，当基因沉默药剂对于非其靶向的基因产物有影响并因此是有害的时候。脱靶效应逐渐成为发展基因沉默治疗剂的主要障碍之一。

降低脱靶效应的一种方法是明智地设计基因沉默药剂的结构，以避免对除期望靶标之外的基因的影响。在一些情况中，可将基因沉默药剂混合，以使具有特定脱靶效应的药剂的浓度降低。在其它情况中，可以对基因沉默药剂进行化学修饰，以避免脱靶效应。这些常规方法已经能够降低脱靶效应，但是它们难以实施。

需要的是，具有降低的脱靶效应的基因沉默药剂。

对于避免或降低脱靶效应的通过RNA干扰操作来治疗性寡聚物的方法和组合物具有长期需求。

发明概述

本发明提供用于基因沉默的活性剂，以及使用所述活性剂治疗或预防疾病的方法。

具体而言，所述活性剂是在基因沉默中具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物。

本发明的UNA寡聚物是以下详细描述的未锁的核单体活性剂(unlocked nucleomonomer active agent)(UNA).

本发明的UNA寡聚物可有效用于针对众多基因靶标以降低的脱靶效应进行基因沉默。

在某些方面，本发明提供用于抑制ApoCIII表达的UNA寡聚物。

在一些方面，本发明提供用于淀粉样变性的治疗。更具体而言，本发明涉及用在转甲状腺素蛋白的敲低中具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物治疗转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性的方法。

在某些方面，本发明提供用于抑制TTR表达和V30M TTR表达的UNA寡聚物，其可用于以降低的脱靶效应治疗淀粉样变性。该UNA寡聚物可以含有第一链和第二链，各链长度为19-29个单体，所述单体为UNA单体和核酸单体。实施方案包括药物组合物和通过向对象施用UNA寡聚物来以降低的脱靶效应治疗或预防TTR相关淀粉样变性的方法。

在某些方面，本发明的UNA寡聚物可以用于植物中进行基因沉默。

本发明的实施方案包括下述：

用于抑制靶基因表达的UNA寡聚物，所述寡聚物包含第一链和第二链，各链长度为19-29个单体，所述单体包括UNA单体和核酸单体，其中所述寡聚物具有长度为14至29个单体的双螺旋结构，并且其中与具有相同靶标的siRNA相比，所述寡聚物具有降低的脱靶效应。

以上UNA寡聚物，其中所述第二链为用于RNA干扰的引导链(guide strand)，以及所述第一链是用于RNA干扰的过客链(passenger strand)。以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物在所述第一链1端第一位点处含有UNA单体，在所述第一链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体，以及在所述第二链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。

以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物在所述第一链1端第一位点处含有UNA单体，以及在所述第一链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物在所述第一链1端第一位点处含有UNA单体，以及在所述第二链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。

以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物在所述第一链1端第一位点处含有UNA单体。以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物在所述第一链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体，以及在所述第二链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。

以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物具有一个或两个悬突(overhang)。以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物以降低的脱靶效应抑制TTR的表达。以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物以降低的脱靶效应抑制载脂蛋白基因的表达。

以上UNA寡聚物，其中所述寡聚物在体内抑制TTR的表达。

以上UNA寡聚物，其中所述UNA寡聚物以降低的脱靶效应靶向抑制植物中的基因表达。

以上UNA寡聚物，其包含碱基修饰的、糖修饰的或连接修饰的至少一个核酸单体。

以上UNA寡聚物，其中所述寡聚物包含选自SEQ ID NO：3-32的序列。

以上UNA寡聚物，其中所述寡聚物在第二链5’端的第2-8位点中任何一处或多处包含UNA单体。

药物组合物，其包含以上UNA寡聚物和药学可接受的载体。

以上药物组合物，其中所述组合物能够局部或全身施用。

以上药物组合物，其中所述组合物能够经静脉内、皮下、肺部、肌肉内、腹膜内、真皮或口服施用。

以上药物组合物，其包含脂质制剂。

以上药物组合物，其包含选自下述的一种或多种脂质：阳离子脂质、阴离子脂质、固醇、聚乙二醇化的脂质以及前述的任何组合。

以上药物组合物，其中所述组合物基本不含脂质体。

以上药物组合物，其中所述组合物含有脂质体。

治疗或预防TTR相关淀粉样变性的方法，其包括向有需要的对象施用有效量的以上UNA寡聚物。

以上方法，其中所述TTR相关淀粉样变性为ATTR。以上方法，其中所述对象为人。以上方法与对照相比，其中所述方法以降低的脱靶效应将对象中的TTR降低至少10％。

以上方法，其中所述有效量为0.001至50.0mg/kg的剂量。以上方法，其中TTR mRNA的表达降低，持续至少5天。

以上方法，其中所述方法减轻了对象中的周围神经病变或自主神经病变。

抑制TTR基因在细胞中表达的方法，其包括用以上UNA寡聚物处理所述细胞。

抑制TTR基因在哺乳动物中表达的方法，其包括向所述哺乳动物施用以上UNA寡聚物。

抑制基因在植物中表达的方法，其包括向所述植物施用长度为10至1000个碱基对的UNA寡聚物。

附图说明

图1：图1显示，用PSICHECK-2载体(Promega)，在双荧光素酶报告基因分析中，UNA寡聚物证实了出人意料地降低对ApoCIII mRNA表达的脱靶活性。具体地，与在过客链中位于5’端位点1不含有UNA单体的可比较的UNA寡聚物ATS98相比，在过客链中位于5’端的位点和位点以及在引导链中的位点含有UNA单体的UNA寡聚物ATX98大大降低了过客链(PSCM)的脱靶敲低活性。UNA寡聚物ATX98具有超过250倍降低的脱靶敲低。

图2：图2显示，利用PSICHECK-2载体，在双荧光素酶报告基因分析中，UNA寡聚物证实了出人意料地降低了对ApoCIII mRNA的表达的脱靶活性。具体地，与在过客链中位于5’端位点不含有UNA单体的可比较的UNA寡聚物ATS100相比，在过客链位于5’端的位点和位点以及在引导链的位点含有UNA单体的UNA寡聚物ATX100大大降低了过客链(PSCM)的脱靶敲低活性。UNA寡聚物ATX100具有近乎100倍降低的脱靶敲低。

图3：图3显示，对于TTR mRNA的表达，某些UNA寡聚物具有与常规siRNA至少可比较的敲低活性水平。具体地，与常规siRNA ATS-91相比，在第一链位于5’端含有UNA单体的UNA寡聚物ATX13，以及在第一链位于5’端含有UNA单体并且在第二链位于3’端从5’端数第20和第21位含有两个UNA单体的UNA寡聚物ATX15，具有至少可比较的敲低活性水平。此外，与常规siRNA ATS-91相比，在第一链位于5’端含有UNA单体，在第一链位于3’端从5’端数第20位含有一个UNA单体，并且在第二链位于3’端从5’端数第20位含有一个UNA单体的UNA寡聚物ATX21，具有至少可比较的敲低活性水平。此外，在头对头比较中，与常规siRNA ATS-92相比，在第一链位于5’端含有UNA单体，在第一链位于3’端从5’端数第20位含有一个UNA单体，并且在第二链位于3’端从5’端数第20位含有一个UNA单体的ATX25，具有至少可比较的敲低活性水平。

图4：图4显示了UNA寡聚物ATX13、ATX 15和ATX21的结构。

图5：图5显示了测量脱靶(OT)效应的方案。建立利用PSICHECK-2载体(Promega)的双荧光素酶报告基因分析，以定量脱靶效应。对于各测量，构建4种质粒：针对第二链或反义链敲低的引导链GSCM和引导链GSSM；以及针对第一链或正义链敲低的过客链PSCM和过客链PSSM。将报告基因质粒与UNA寡聚物共转染进HeLa细胞。在该系统中，如果UNA寡聚物与插入至荧光素酶3-UTR中的靶序列结合，则化学发光信号减弱或消失。

图6：图6显示了用于针对敲低水平的与常规siRNA进行头对头比较的UNA寡聚物的结构。UNA寡聚物平铺于TTR mRNA区域从625位至651位中的284位周围。制备了5种UNA寡聚物，即ATX25、ATX37、ATX21、ATX38和ATX39。与靶向同一位点的常规siRNA相比，对这些UNA寡聚物的脱靶效应进行测试。

图7：图7显示了具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物实施方案的结构。

图8：图8显示了针对在TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX25与常规siRNA ATS92进行头对头比较的结果。与常规siRNA(GSCM)相比，UNA寡聚物ATX25具有增加的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX25具有降低的脱靶敲低。

图9：图9显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX37与常规siRNA ATS104进行头对头比较的结果。与常规siRNA(GSCM)相比，UNA寡聚物ATX37具有增加的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX37具有大幅降低的脱靶敲低。

图10：图10显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX21与常规siRNA ATS91进行头对头比较的结果。UNA寡聚物ATX21具有可与常规siRNA(GSCM)相比较的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX21具有大幅降低的脱靶敲低。

图11：图11显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX38与常规siRNA ATS105进行头对头比较的结果。与常规siRNA(GSCM)相比，UNA寡聚物ATX38具有增加的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX38具有大幅降低的脱靶敲低。

图12：图12显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX39与常规siRNA ATS106进行头对头比较的结果。与常规siRNA(GSCM)相比，UNA寡聚物ATX39具有可比较的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX39具有大幅降低的脱靶敲低。

图13：图13显示，某些UNA寡聚物证实了出人意料地降低的脱靶效应。具体地，显示UNA单体的组合在UNA寡聚物的三个位点中的存在，更具体地，在过客链5’端和3’端以及在引导链的3’端的存在，提供了过客链出人意料地降低的脱靶敲低活性。

发明详述

本发明提供作为基因沉默的活性剂的UNA寡聚物，以及使用所述UNA寡聚物治疗或预防疾病的方法。本发明的UNA寡聚物在基因沉默中可以具有降低的脱靶效应。

本发明的UNA寡聚物是以下详细描述的未锁的核单体活性剂(UNA)。UNA寡聚物是包含一种或多种UNA单体的链式分子。UNA单体是基于丙烷-1,2,3-三-基-三氧基结构的小的有机分子。UNA寡聚物可以是由UNA单体以及可基于天然存在的核苷的不同核苷酸或修饰的核苷酸组成的链。

在一些方面，本发明提供淀粉样变性的治疗。更具体地，本发明涉及用UNA寡聚物治疗转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性的方法，所述UNA寡聚物在转甲状腺素蛋白的敲低中具有降低的脱靶效应。

在某些方面，可将本发明的UNA寡聚物用于植物中的基因沉默。在植物中使用的UNA寡聚物可以具有10至1000个碱基对的长度。可将本发明的UNA寡聚物用于植物中的功能基因组学，用于控制植物性状，用于提供针对病毒和病原体的抗性，或者用于提供对昆虫的防护等，同时提供降低的脱靶效应。

本发明的UNA寡聚物可以对具有降低的脱靶效应的特定基因敲低具有活性。

在一些实施方案中，UNA寡聚物靶向被确认为疾病靶标的基因靶标。

在某些实施方案中，本公开的UNA寡聚物可以靶向转甲状腺素蛋白(TTR)基因。

在其它实施方案中，本公开的UNA寡聚物可以靶向载脂蛋白基因，如ApoCIII。

转甲状腺素蛋白相关的淀粉样变性(ATTR)涉及淀粉样纤维蛋白在不同器官和组织中的沉积，包括周围神经系统、自主神经系统和中枢神经系统。转甲状腺素蛋白(TTR)是分泌的甲状腺激素结合蛋白，其结合并转运血浆和脑脊髓液中的视黄醇结合蛋白和血清甲状腺素。

ATTR的症状通常包括神经病变和/或心肌病。周围神经病变可以开始于下肢，其具有感觉神经病变和运动神经病变，并且能够发展至上肢。自主神经病变可以体现为胃肠症状和起立性低血压。

在患有ATTR的患者中，TTR基因最常见的突变为Val-30-Met。ATTR淀粉样变性的主要疗法是肝脏移植，其移除变体TTR产生的主要来源，并用正常的TTR替代。目前不存在能够消解TTR淀粉样蛋白形成的药物疗法。

在一些实施方案中，本发明提供用于以降低的脱靶效应有效地沉默基因和敲低TTR的活性剂。

在一些实施方案中，提供UNA寡聚物用于治疗转甲状腺素蛋白相关的淀粉样变性(ATTR)。本发明的UNA寡聚物可以降低淀粉样纤维蛋白在不同器官和组织中的沉积，包括周围神经系统、自主神经系统和中枢神经系统。

在某些方面，本发明提供用于ATTR和相关的淀粉样蛋白相关疾病的治疗。

本发明的方面包括可以用于治疗ATTR淀粉样变性的临床特征的UNA寡聚物，包括神经病变和/或心肌病。

在一些实施方案中，本发明的UNA寡聚物靶向一种突变Val-30-Met TTR。

本发明可以提供能够取消TTR淀粉样蛋白形成的药理学疗法。

UNA单体

UNA单体是基于以下所示的丙烷-1,2,3-三-基-三氧基结构的小的有机分子：

UNA单体

其中R¹和R²为H，并且R¹和R²可以是磷酸二酯键，碱基可以是核碱基，以及R3是以下所述的官能团。

在另一个视角，可以如下在IUPAC标记中画出UNA单体的主要原子：

UNA单体单元

链方向

其中寡聚物链的前进方向为由丙烷残基的1端至3端。

核碱基的实例包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷以及天然的和非天然的核碱基类似物。

一般而言，由于UNA单体不是核苷酸，它们在寡聚物中可以显示出至少四种形式。首先，UNA单体在寡聚物中可以是内部单体，其中所述UNA单体两侧接有其它单体。以此种形式，当寡聚物为例如双螺旋，并且所述双螺旋中存在具有核碱基的其它单体时，UNA单体可以参与碱基配对。

以下显示了作为内部单体侧接于丙烷-1-基位点和丙烷-3-基位点的UNA单体的实例，其中R3为-OH。

第二，UNA单体可以是寡聚物双螺旋的悬突中的单体，其中所述UNA单体两侧接有其它单体。以此种形式，UNA单体不参与碱基配对。由于UNA单体是柔性有机结构，不像核苷酸，包含UNA单体的悬突将是寡聚物的柔性终止子。

UNA单体可以是寡聚物的悬突中的末端单体，其中所述UNA单体仅与位于丙烷-1-基位点或丙烷-3-基位点的一个单体相连。以此种形式，UNA单体不参与碱基配对。由于UNA单体是柔性有机结构，不像核苷酸，包含UNA单体的悬突可以是寡聚物的柔性终止子。

以下显示了作为末端单体在丙烷-3-基位点相连的UNA单体的实例。

由于UNA单体可以是柔性分子，作为末端单体的UNA单体可以呈现广泛不同的构象。以下显示了作为末端单体在丙烷-3-基位点处相连的能量最小化的UNA单体构型的实例。

UNA-A末端形态：虚线键显示了丙烷-3-基连接

因此，具有末端UNA单体的UNA寡聚物在结构上显著不同于常规的核酸药剂，如siRNA。例如，siRNA可能要求双螺旋中的末端单体或悬突是稳定的。相反地，末端UNA单体的顺应性(conformability)可以提供具有不同特性的UNA寡聚物。

除了其它方面，UNA单体的结构允许其与天然存在的核苷酸相连。UNA寡聚物可以是由UNA单体以及可以基于天然存在的核苷的不同核苷酸组成的链。

在一些实施方案中，UNA单体的官能团R³可以是-OR⁴、-SR⁴、-NR⁴₂、-NH(C＝O)R⁴、吗啉代、吗啉-l-基、哌嗪-l-基或4-烷酰基-哌嗪-l-基，其中对于各种情况，R⁴相同或不同，并且可以是H、烃基、胆固醇、脂质分子、聚胺、氨基酸或多肽。

UNA单体是有机分子。UNA单体不是核酸单体或核苷酸，也不是天然存在的核苷或修饰的天然存在的核苷。

本发明的UNA寡聚物是合成的链式分子。本发明的UNA寡聚物既不是核酸也不是寡核苷酸。

在一些实施方案中，如以上所示，UNA单体可以是UNA-A(指定的)、UNA-U(指定的)、UNA-C(指定的)以及UNA-G(指定的)。

可用于本文的指定包括mA、mG、mC和mU，其指的是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。

可用于本文的指定包括小写c和u，其指的是2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸。

可用于本文的指定包括dT，其指的是2’-脱氧T核苷酸。

UNA寡聚物的单体

如本文所使用的，在寡聚物序列的背景下，符号X表示UNA单体。

如本文所使用的，在寡聚物序列的背景下，符号N表示任何天然的核苷酸单体或修饰的核苷酸单体。

如本文所使用的，在寡聚物序列的背景下，符号Q表示非天然存在的核苷酸单体、修饰的核苷酸单体或化学修饰的核苷酸单体。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例包括：2’-O-甲基核糖核苷酸、2’-O-甲基嘌呤核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟代嘧啶核苷酸、2’-脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧嘌呤核苷酸、通用碱基核苷酸、5-C-甲基-核苷酸，以及反转的脱氧碱基单体残基。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括3’-端稳定的核苷酸、3’-甘油基核苷酸、3’-反转的无碱基核苷酸和3’-反转的胸苷。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括锁核酸核苷酸、2’-O,4’-C-亚甲基-(D-呋核亚硝脲)核苷酸、2’-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸、2’-甲基-硫代-乙基、2’-脱氧-2’-氟代核苷酸，以及2’-O-甲基核苷酸。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括2’-氨基核苷酸、2’-O-氨基核苷酸、2’-C-烯丙基核苷酸和2’-O-烯丙基核苷酸。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括N⁶-甲基腺苷核苷酸。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括含有下述修饰的碱基的核苷酸单体：5-(3-氨基)丙基尿苷、5-(2-巯基)乙基尿苷、5-溴尿苷；8-溴鸟苷或7-脱氮腺苷。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括2’-O-氨丙基取代的核苷酸。

非天然的、修饰的以及化学修饰的核苷酸单体的实例，包括用下述基团替代核苷酸的2’-OH基团：2’-R、2’-OR、2’-卤素、2’-SR或2’-氨基，其中R可以是H、烷基、烯基或炔基。

Saenger,Principles of Nucleic Acid Structure,Springer-Verlag,1984中给出了修饰的核苷酸的一些实例。

UNA寡聚物

本发明的UNA寡聚物是链式分子。UNA寡聚物可以是双螺旋对。因此，UNA寡聚物可以含有所述双螺旋的第一链和与所述第一链互补的所述双螺旋的第二链，尽管可以存在多达3个错配。UNA寡聚物双螺旋可以含有悬突。

在美国专利第8,314,227号，以及美国专利申请第20110313020号Al中，讨论了一些UNA寡聚物。

UNA寡聚物的靶标可以是靶核酸。在一些实施方案中，靶标可以是对象的任何mRNA。UNA寡聚物可以对RNA干扰中的基因沉默具有活性。

UNA寡聚物可以包含一起提供双螺旋的两条链。双螺旋可以由第一链和第二链组成，所述第一链也可被称为过客链或正义链，所述第二链也可被称为引导链或反义链。

在一些方面，本发明的UNA寡聚物可以在双螺旋结构的任何链或两条链的任何位点含有任何数目的硫代磷酸酯单体间连接。

本发明的UNA寡聚物的实例包括双螺旋对，其通常是互补的。因此，例如SEQ ID NO:1可以表示双螺旋的第一链，以及SEQ ID NO:2可以表示双螺旋的第二链，所述第二链与所述第一链互补。

例如，第一链中的符号“N”可以表示与在第二链中相应位点的单体互补的任何核苷酸。显示的本公开的示例性UNA寡聚物具有2个单体长度的悬突，尽管可以使用至8个单体或更长的悬突。

链或寡聚物中的“X”表示UNA单体。

此外，当寡聚物终止于UNA单体时，对于核苷酸，根据以上所示的位置编号，该末端位点具有1端而非5’端，或者对于核苷酸，根据以上所示的位置编号，该末端位点具有3端而非3’端。例如，UNA寡聚物在第一链的1端具有UNA单体，在第一链的3端具有UNA单体，在第二链的3端具有UNA单体，以及在第二链的5’端具有核苷酸。

SEQ ID NO：1

1-X·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·X·X-3

3一X·X·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·N·X·X·X·X·X·X·X·N-5′

SEQ ID NO：2

在一些实施方案中，本发明的UNA寡聚物在第一链的1端可以含有一个或多个UNA单体，以及在第一链的3端可以含有一个或多个UNA单体。

在其它实施方案中，本发明的UNA寡聚物在第二链的3端可以含有一个或多个UNA单体。

在某些实施方案中，本发明的双螺旋UNA寡聚物在第一链的1端，在第一链的3端，以及在第二链的3端，可以含有一个或多个UNA单体。

本发明的UNA寡聚物，所述寡聚物可以含有第一链和第二链，各链的长度独立为19-23个单体。

在某些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为19-23个单体的第一链。

在某些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为19-21个单体的双螺旋区域。

在其它实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为19-23个单体的第二链。

在某些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为19个单体的第一链，以及长度为21个单体的第二链。

在某些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为20个单体的第一链，以及长度为21个单体的第二链。

在某些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为21个单体的第一链，以及长度为21个单体的第二链。

在某些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有长度为22个单体的第一链，以及长度为21个单体的第二链。

用于抑制基因表达的本发明的UNA寡聚物，可以含有第一链和第二链，各链长度为19-29个单体。单体可以是UNA单体和核酸单体。寡聚物可以具有长度为14至29个单体的双螺旋结构。UNA寡聚物可以靶向靶基因，并且与常规的siRNA相比，可以显示出降低的脱靶效应。在一些实施方案中，本发明的UNA寡聚物可以含有第一链和第二链，各链长度为19-23个单体。

在另一方面，UNA寡聚物可以具有平末端，或者可以含有一个或多个悬突。在一些实施方案中，第一链和第二链可以与两条链之间的连接寡聚物相连，并形成在一端具有连接环的双螺旋区域。

在某些实施方案中，悬突的长度可以是一个或两个单体。

UNA寡聚物可以介导细胞中靶核酸的剪切。在一些过程中，UNA寡聚物的第二链(其至少一部分可与靶核酸互补)，可以作为能够与靶核酸杂交的引导链发挥作用。

第二链可以并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中。

本公开的UNA寡聚物可以包含天然存在的核酸核苷酸，以及与基因沉默活性兼容的其修饰物。

在一些方面，UNA寡聚物是能够抑制基因表达的双链构建体分子。

本文使用的术语链指单体的单一连续链，所述链含有任何数目的内部单体和两个末端单体，其中各末端单体与一侧的内部单体相连并且不与另一侧的单体相连，因此所述末端单体将链终止。

UNA寡聚物的单体可以通过磷酸二酯连接、硫代磷酸酯连接、有缺口的连接以及其它变型相连。

在一些实施方案中，UNA寡聚物在第一链与第二链之间的互补中可以包含错配。在其它实施方案中，UNA寡聚物可以含有1个、或2个、或3个错配。错配可以发生于双螺旋区域中的任何位点。

UNA寡聚物的靶标可以是靶基因的靶核酸。

UNA寡聚物在双螺旋区域外可以含有一个或两个悬突。所述悬突可以是位于第一链或第二链末端的非配对部分。第一链和第二链的悬突部分的长度可以相同或不同。

UNA寡聚物可以具有至少一个平末端。平末端不具有悬突部分，并且位于平末端的双螺旋区域在第一链和第二链的相同位点处终止。

UNA寡聚物可以是RISC长度，这意味着其具有长度小于25个碱基对的双螺旋。

在某些实施方案中，UNA寡聚物可以是单链，所述单链自身折叠并自身杂交以形成具有连接环的双链区域。

具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物结构的实例显示于表1中。

表1：具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物

在一些实施方案中，具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物可以在第一链(也称为过客链)1端第一位点处，和在第一链3端最后两个位点中的一处或两处，以及在第二链(也称为引导链)3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。例如，表1中的SEQ ID NO：3和4，其中第一链3端最后两个位点处以及第二链3端最后两个位点处均为UNA单体。

在一些实施方案中，具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物可以在第一链1端第一位点处以及在第一链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。例如，表1中的SEQ ID NO：5和6，其中第一链3端最后两个位点处均为UNA单体。

在一些实施方案中，具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物，可以在第一链(也称为过客链)1端第一位点处以及在第二链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。例如，表1中的SEQ ID NO：7和8，其中第二链3端最后两个位点均为UNA单体。

在一些实施方案中，具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物，可以在第一链1端第一位点处含有UNA单体。例如，表1中的SEQ ID NO：9和10。

在一些实施方案中，具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物，可以在第一链3端最后两个位点中的一处或两处以及在第二链3端最后两个位点中的一处或两处含有UNA单体。例如，表1中的SEQ ID NO：11和12，其中第一链3端最后两个位点以及第二链3端最后两个位点均为UNA单体。

在一些实施方案中，除了在以上所述的任何位点处含有一个或多个UNA单体之外，具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物可以在第二链5’端的第2-8位点中任何一个或多个的种子区含有UNA单体。

具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物结构的实例显示于表2中。

表2：具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物

治疗淀粉样变性的方法

本发明的方法包括以降低的脱靶效应治疗和预防哺乳动物对象中TTR相关淀粉样变性。

在本发明的方法中，可以向需要治疗或预防的对象施用有效量的UNA寡聚物。对象可以是人或哺乳动物。

对象可以患有TTR相关淀粉样变性，也被称为ATTR。

特别地，对象可以含有V30M基因。本发明的方法可以以降低的脱靶效应降低对象中的V30M TTR。

在一些实施方案中，与对照相比，本发明的方法可以以降低的脱靶效应将对象中的TTR或V30M TTR降低至少10％。在某些实施方案中，与对照相比，可以以降低的脱靶效应将对象中的TTR或V30M TTR降低至少20％、或30％、或50％。

本发明的UNA寡聚物的有效量可以是0.001mg/kg至50.0mg/kg的剂量范围。

在本发明的方法中，对象中TTR mRNA的表达可以降低至少5天。在某些实施方案中，对象中TTR mRNA的表达可以降低至少10天或15天。

在本发明的方法中，可以减轻对象中的周围神经病变或自主神经病变。

在本发明的方法中，可以减轻对象中的周围神经病变或自主神经病变。在一些实施方案中，对象可能经受减轻的下肢衰弱、减轻的疼痛或改善的感觉。本发明的方法可以降低对象中玻璃体浑浊的发生。

在本公开的方法中，UNA寡聚物的施用可能不导致炎症应答。

在其它实施方案中，本发明包括通过用UNA寡聚物处理细胞来抑制细胞中TTR基因表达的方法。

在其它实施方案中，本发明包括通过向哺乳动物施用包含UNA寡聚物的组合物而抑制哺乳动物中TTR基因表达的方法。

药物组合物

在一些方面，本发明提供包含UNA寡聚物和药学可接受的载体的药物组合物。

药物组合物可以能够局部施用或全身施用。在一些方面，药物组合物可以能够以任何形式施用。在某些方面，施用可以是经静脉内、皮下、肺部、肌肉内、腹膜内、真皮、口服或鼻部施用。

本发明的实施方案包括脂质制剂形式的包含UNA寡聚物的药物组合物。

在一些实施方案中，药物组合物可以包含选自下述的一种或多种脂质：阳离子脂质、阴离子脂质、固醇、聚乙二醇化的脂质以及前述的任何组合。

在某些实施方案中，药物组合物可以基本不包含脂质体。

在其它实施方案中，药物组合物可以包含脂质体。

在其它实施方案中，药物组合物可以包含病毒或细菌载体内的UNA寡聚物。

本公开的药物组合物可以包含本领域已知的载体、稀释剂或赋形剂。药物组合物的实例描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro ed.1985)。

药物组合物的赋形剂的实例包括抗氧化剂、悬浮剂、分散剂、防腐剂、缓冲剂、张度剂以及表面活性剂。

实施例

实施例1：本实施例显示，UNA寡聚物显著降低了通过RNA干扰进行基因沉默中过客链的脱靶活性。过客链脱靶活性的降低可以取决于不同UNA单体在寡聚物中的定位。在该实施例中，显示UNA单体的组合在UNA寡聚物中三个位点的存在，更具体地在过客链5’端和3’端以及在引导链3’端的存在，大大降低了过客链的脱靶敲低活性。

具有降低的脱靶效应并靶向ApoCIII的UNA寡聚物显示于表3中。如本文所使用的，用上方的过客链和下方的引导链表示双螺旋寡聚物。如以上所述，末端基团编号将取决于末端单体的特性。

表3：UNA寡聚物ATX98和ATX100

图1显示，用PSICHECK-2载体(Promega)，在双荧光素酶报告基因分析中，UNA寡聚物证实了出人意料地降低对ApoCIII mRNA表达的脱靶活性。具体地，与在过客链中位于5’端位点不含有UNA单体的可比较的UNA寡聚物ATS98相比，在过客链中位于5’端的位点和位点以及在引导链中的位点含有UNA单体的UNA寡聚物ATX98大大降低了过客链(PSCM)的脱靶敲低活性。

ATS98的过客链的IC50为1.57，以及ATX98的过客链的IC50为397。因此，如通过IC50的比值所测定的，UNA寡聚物ATX98具有超过250倍的降低的脱靶敲低。该脱靶敲低的显著降低可以归因于UNA单体的组合在UNA寡聚物三个位点中的存在：在过客链的5’端和3’端以及在引导链的3’端。

图2显示，利用PSICHECK-2载体，在双荧光素酶报告基因分析中，UNA寡聚物ATX100证实了出人意料地降低了对ApoCIII mRNA的表达的脱靶活性。ATX100在过客链位于5’端的位点和位点以及在引导链的位点含有UNA单体，并且与在过客链位于5’端位点处不含有UNA单体的可比较的UNA寡聚物ATS100相比，ATX100大大降低了过客链(PSCM)的脱靶敲低活性。

ATS100的过客链的IC50为23.5，以及ATX100的过客链的IC50为2239。因此，如通过IC50的比值所测定的，UNA寡聚物ATX100具有几乎降低100倍的脱靶敲低。该脱靶敲低的显著降低可以归因于UNA单体的组合在UNA寡聚物三个位点中的存在：在过客链的5’端和3’端以及在引导链的3’端。

实施例2：图3显示，对于TTR mRNA的表达，某些UNA寡聚物具有与常规siRNA至少可比较的敲低活性水平。ATX13、ATX14、ATX15、ATX16、ATX17、ATX21和ATX25靶向人TTR的3'-UTR，并因此既靶向野生型V30V TTR又靶向V30M突变的TTR。

具体地，与常规siRNA ATS-91相比，在第一链位于1(5’)端含有UNA单体的UNA寡聚物ATX13，以及在第一链位于1(5’)端含有UNA单体并且在第二链位于3(3’)端从5’端数第20和第21位含有两个UNA单体的UNA寡聚物ATX15，具有至少可比较的敲低活性水平。

此外，与常规siRNA ATS-91相比，在第一链位于1(5’)端含有UNA单体，在第一链位于3(3’)端从5’端数第20位含有一个UNA单体，并且在第二链位于3(3’)端从5’端数第20位含有一个UNA单体的UNA寡聚物ATX21，具有至少可比较的敲低活性水平。

此外，在头对头比较中，与常规siRNA ATS-92相比，在第一链位于1(5’)端含有UNA单体，在第一链位于3(3’)端从1端数第20位含有一个UNA单体，并且在第二链位于3(3’)端从5’端数第20位含有一个UNA单体的ATX25，具有至少可比较的敲低活性水平。

图4显示了UNA寡聚物ATX13、ATX15和ATX21的结构。

实施例3：图5显示了测量脱靶(OT)效应的方案。建立利用PSICHECK载体的荧光素酶报告基因分析。对于各测量，构建4种质粒：针对第二链或反义链敲低的引导链GSCM和引导链GSSM；以及针对第一链或正义链敲低的过客链PSCM和过客链PSSM。将报告基因质粒与UNA寡聚物共转染进HeLa细胞。在该系统中，如果UNA寡聚物与插入至荧光素酶3-UTR中的靶序列结合，则化学发光信号减弱或消失。

实施例4：图6显示了用于针对敲低水平与常规siRNA进行头对头比较的UNA寡聚物的结构。UNA寡聚物平铺于TTR mRNA区域从625位至651位中的628位周围。制备了5种UNA寡聚物，即ATX25、ATX37、ATX21、ATX38和ATX39。与靶向同一位点的常规siRNA相比，对这些UNA寡聚物的脱靶效应进行测试。

实施例5：图7显示了具有降低的脱靶效应的UNA寡聚物的一些实施方案的结构。

图8显示了针对在TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX25与常规siRNA ATS92进行头对头比较的结果。UNA寡聚物ATX25具有超过常规siRNA(GSCM)的增加的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX25具有降低的脱靶敲低。

实施例6：图9显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX37与常规siRNA ATS104进行头对头比较的结果。UNA寡聚物ATX37具有超过常规siRNA(GSCM)的增加的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX37具有大幅降低的脱靶敲低。

实施例7：图10显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX21与常规siRNAATS91进行头对头比较的结果。UNA寡聚物ATX21具有可与常规siRNA(GSCM)相比较的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX21具有大幅降低的脱靶敲低。

实施例8：图11显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX38与常规siRNAATS105进行头对头比较的结果。与常规siRNA(GSCM)相比，UNA寡聚物ATX38具有增加的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX38具有大幅降低的脱靶敲低。

实施例9：图12显示了针对TTR表达的敲低中的脱靶效应，UNA寡聚物ATX39与常规siRNAATS106进行头对头比较的结果。与常规siRNA(GSCM)相比，UNA寡聚物ATX39具有可比较的敲低。出人意料地，与常规siRNA(PSCM)相比，UNA寡聚物ATX39具有大幅降低的脱靶敲低。

实施例10：该实施例显示了UNA寡聚物的脱靶活性意想不到的降低。过客链的脱靶活性的降低取决于不同UNA单体在寡聚物中的定位。在该实施例中，显示UNA单体的组合在UNA寡聚物三个位点中的存在，更具体地在过客链的1端和3(3’)端以及在引导链的3(3’)端的存在，提供了过客链的出人意料地降低的脱靶敲低活性。

图13的UNA寡聚物显示于表4中，其基于ATX25并靶向TTR，具有降低的脱靶效应。

表4：基于ATX25的UNA寡聚物

图13显示，基于ATX25并靶向TTR的某些UNA寡聚物，证实了出人意料地降低的脱靶效应。使用利用PSICHECK-2载体(Promega)的双荧光素酶报告基因分析。具体地，在过客链位于5’端位点和位点处以及在引导链的位点含有UNA单体的UNA寡聚物1U-ATX25，具有降低的过客链(PSCM)的脱靶敲低活性。出人意料地，对于12U-ATX25，向位于5’端位点的寡聚物结构添加UNA单体，提供了过客链(PSCM)的4倍降低的脱靶敲低活性。而且，对于13U-ATX25，向位于5’端位点的寡聚物结构添加UNA单体，提供了过客链(PSCM)的6倍降低的脱靶敲低活性。此外，向位于5’端位点和位点的寡聚物结构添加UNA单体，提供了过客链(PSCM)的7倍降低的脱靶敲低活性。来自图13的结果概括于表5中。

表5：基于ATX25的UNA寡聚物的脱靶活性

实施例11：该实施例涉及能够降低V30M TTR在体内沉积的UNA寡聚物，并因此其适合用于治疗或预防诸如转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性的病况或疾病。使用人TTR V30M过表达的6月龄转基因小鼠。使用TTR野生型小鼠和TTR敲除的小鼠作为对照。在受控的环境中饲养动物，并用克他命和美托咪定使之安乐死。

对于TTR基因沉默，以脂质体制剂的形式递送TTR UNA寡聚物和对照。小鼠尾静脉注射浓度为1mg/kg的TTR UNA寡聚物(n＝6)。用空白制剂处理未处理的年龄匹配的对照。每周给予一次注射，持续4周，并在最后一次注射48h后杀死动物。移出肝脏和结肠并收集至10％的福尔马林中并冷冻。

使用酚提取(Invitrogen)分离肝脏和结肠mRNA。从其它组织解剖来自V30M小鼠的坐骨神经，并用RNeasy迷你柱(Qiagen)提取mRNA。用Superscript双链cDNA试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。用Experion RNA StdSens分析试剂盒(Bio-Rad)验证提取的RNA。用引物和iQ Syber Green Super Mix(Bio-Rad)进行qPCR。用如以上所述移出并处理的来自V30M动物的坐骨神经、背根神经节和结肠进行双免疫荧光分析。用学生T检验或单因素方差分析进行比较。将数据表示为平均值±标准误(SEM)。P值小于0.05被认为是显著的。

在V30M小鼠中注射UNA寡聚物ATX13、ATX15、ATX21、1U-ATX25、12U-ATX25、13U-ATX25、123U-ATX25、ATX37、ATX38或ATX39中的任何一种，或者这些UNA寡聚物的任何组合，相对于对照，将坐骨神经、背根神经节和结肠中V30M TTR的沉积降低了至少90％。

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应当理解，本发明不限于所述的具体方法学、方案、材料和试剂，因为它们可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅是出于描述具体实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围，本发明的范围将由所附的权利要求所涵盖。

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无需进一步细化，相信本领域技术人员能够基于以上描述最大程度利用本发明。因此，所述具体实施方案应被理解为仅是说明性的，并且无论如何不以任何方式限制本公开的其余内容。

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合形式组合。可以用服务于相同、等同或类似目的的替代性特征来替代本说明书中公开的各特征。