本发明涉及从微生物生物质进行脂质分级的方法，进一步详细而言，涉及利用液化二甲醚在萃取脂质时的分离选择性进行脂质分级的方法。
背景技术：
作为从微生物生物质萃取脂质的方法，以往已知并广泛利用的是使用己烷等有机溶剂的溶剂萃取、利用超临界二氧化碳的萃取等各种萃取技术。例如，已知涡鞭毛藻(Dinoflagellate)中的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、网粘菌(Labyrinthulea)中的海洋壶菌(Aurantiochytrium limacinum)(也称为裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum))、丝状真菌中的高山被孢霉(Mortierellaalpina)等微生物生产含有二十二碳六烯酸、花生四烯酸等有用的高度不饱和脂肪酸的脂质。由这些微生物生产的含有高度不饱和脂肪酸的脂质已经有多家企业在实际生产，广泛用于婴儿用奶粉添加用途、食品配合用途。在制造这些脂质时，已知有通过使用己烷等有机溶剂的溶剂萃取法而从细胞进行萃取的方法(非专利文献1)。此外，已知通过对作为微藻类之一的绿藻中的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)控制培养条件，从而在休眠细胞(包囊细胞)中以高浓度蓄积虾青素，这种利用藻类生产虾青素的方法也已经由多家企业实际应用，但在从细胞萃取时，进行的是使用丙酮等有机溶剂的溶剂萃取(专利文献1)、利用超临界二氧化碳的萃取(非专利文献2)。
与如上所述的现有萃取方法并行的、近年引起注目的方法是，使用液化二甲醚(以下也称为DME)作为溶剂的萃取方法。该方法具有不需要干燥生物质、不需要破碎细胞、不需要除去萃取中所使用的有机溶剂等特征(专利文献2、3)。使用液化二甲醚的萃取方法由于不经历原料的干燥、不经历从萃取物除去溶剂等需要加热的工序，因此在用于例如从微生物生物质萃取脂质时，脂质的氧化被抑制到最低限度，能够制造高品质的脂质。此外，由于省略了干燥、破碎、除溶剂所需要的能量，因此能够以更低的能耗来制造脂质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4934272号
专利文献2：日本特开2010-240609号
专利文献3：日本特开2011-031170号
非专利文献
非专利文献1：James Wynn,Paul Behrens,Anand Sundararajan,Joe Hansen,and Kirk Apt,Production of Single Cell Oils by Dinoflagellates,in Single Cell Oils,Zvi Cohen,and Colin Ratledge,eds.,AOCS Press,Champaign,Illinois,2005,pp.86-98；
非专利文献2：冈村俊宏：食品工业,Vol.50,No.6,p.56-62,光琳(2007)。
技术实现要素：
发明要解决的课题
该专利文献2的使用液化二甲醚作为溶剂的萃取方法是从对象材料萃取可萃取的全部油分的技术。
本发明人想到，能否将这种使用液化DME进行的萃取用于脂质分级中，进而发现了本发明。即，本申请发明的课题在于，提供一种使用液化DME作为溶剂的脂质分级方法。
用于解决课题的手段
本发明人发现，以微生物生物质为对象，使用迄今尚不知道具有对脂质的分离选择性的液化二甲醚作为溶剂进行萃取，将萃取物经时地分级，结果分级物的脂肪酸组成经时地发生变化，从而完成了本发明。即，本发明的目的在于，提供一种从微生物生物质进行的脂质的新的分级方法。
本发明的主旨为以下的(1)～(7)中记载的方法。
(1)一种对脂质进行分级的方法，其将微生物生物质供于使用液化二甲醚作为溶剂的萃取，利用对脂质的分离选择性将脂质分级。
(2)一种改变微生物生物质中残留的脂质的脂肪酸组成的方法，通过将微生物生物质供于使用液化二甲醚作为溶剂的萃取，利用对脂质的分离选择性将部分脂质分级，从而改变微生物生物质中残留的脂质的脂肪酸组成。
(3)一种制造脂质的方法，其特征在于，从通过(2)的方法获得的脂肪酸组成已改变的微生物生物质进一步萃取脂肪酸组成已改变的脂质。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，微生物生物质为培养属于网粘菌(Labyrinthulea)纲的微生物而获得的生物质。
(5)根据(4)所述的方法，其中，网粘菌纲为海洋壶菌(Aurantiochytrium)属的网粘菌纲。
(6)根据(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，微生物生物质为培养属于绿藻纲的微生物而获得的生物质。
(7)根据(6)所述的方法，其中，绿藻纲为红球藻(Haematococcus)属的绿藻纲。
发明的效果
根据本发明，能够提供一种以液化DME为溶剂的、从微生物生物质进行的脂质的新的分级方法。例如，仅使用液化DME进行分级，就能够将含有较多饱和脂肪酸的脂质与含有较多高度不饱和脂肪酸的脂质分离。
附图说明
图1为示出本发明中使用的装置的1个方式的示意图。
具体实施方式
本发明是在获取微生物生物质的菌体内所含的脂质时，利用液化DME对脂质的选择性的差异，将脂质分级。
本发明中使用的液化DME(IUPAC名：甲氧基甲烷)的沸点为-23.6℃，因此在常温下为气体。将其制成液体而用作本发明的溶剂。为了将DME液化，可以在压力0.25～1.14MPa、温度0～50℃左右的范围内进行适当调节。
本发明中，微生物是指其菌体内生产脂质的微生物。可以例示出例如属于隐甲藻(Crypthecodinium)属、破囊壶菌(Thraustochytrium)属、裂殖壶菌(Schizochytrium)属、吾肯氏壶菌(Ulkenia)属、Japonochytrium属、海壶菌(Haliphthoros)属、被孢霉(Mortierella)属、青霉(Penicillium)属、曲霉(Aspergillus)属、红酵母(Rhodotorula)属、镰孢(Fusarium)属的微生物。具体而言，可以例示出涡鞭毛藻中的寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、网粘菌中的海洋壶菌(Aurantiochytrium limacinum)(也称为裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum))、丝状真菌中的高山被孢霉(Mortierella alpina)等微生物，绿藻中的雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。
本发明中，脂质是指微生物所生产的脂质，主要为甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂、游离脂肪酸、甾醇类、烃等。进而，虾青素等类胡萝卜素那样的、包含于微生物生产的脂质中的色素等成分也能够与脂质一起分级。
键合于脂质的脂肪酸的组成根据微生物不同而不同，通常以各种各样的比率含有碳数为12～24、双键数为0～6的脂肪酸。有生理活性而被认为有用的脂肪酸是高度不饱和脂肪酸，高度不饱和脂肪酸是指碳数为18以上、双键数为3以上的脂肪酸，更优选碳数为20以上、双键数为3以上的脂肪酸。具体而言，可以例示出α-亚麻酸(18：3，n-3)、γ-亚麻酸(18：3，n-6)、花生四烯酸(20：4，n-6)、二均-γ-亚麻酸(20：3，n-6)、二十碳五烯酸(20：5，n-3)、二十二碳五烯酸(22：5，n-6)、二十二碳六烯酸(22：6，n-3)等。
在微生物菌体中的脂质中，这些脂肪酸是作为甘油三酯、磷脂等的构成脂肪酸而键合。
利用液化DME的分离选择性的最简单的方法如下：将微生物菌体填充到柱中，使液化DME以一定速度流过该柱而将流出液分级的方法。如实施例所示，液化DME在从微生物菌体溶出脂质时具有选择性。
含有饱和脂肪酸的脂质溶出快，含有高度不饱和脂肪酸的脂质溶出慢。利用该差异能够提高全部脂肪酸中包含的高度不饱和脂肪酸的浓度。不使用柱，而是通过分批处理，反复用少量的液化DME萃取也能够实现同样效果。此外，还可以使用发挥同样效果的任意装置。
以往，从微生物菌体进行溶剂萃取时，例如利用己烷进行高效萃取，但由于己烷对脂质的分离选择性低，因此所萃取的中性脂质的脂肪酸组成与微生物生物质中的中性脂质的脂肪酸组成基本相同。如果要对所萃取的脂质中的高度不饱和脂肪酸进行浓缩，则是在萃取后另外进行纯化工序。作为改变脂肪酸组成的纯化方法，已知有脲加成法、冬化(wintering)法、精密蒸馏法、利用脂肪酶的浓缩法等，均为基于分子量、不饱和键数这样的脂肪酸性状差异来改变脂肪酸组成的方法。
根据本发明的方法，能够在从微生物菌体进行萃取的阶段进行一定程度的浓缩。在进行本发明的分离后，还可以进一步使用上述的以往纯化方法。
利用上述分离选择性，还能够利用液化DME从微生物菌体选择性地萃取除去饱和脂肪酸等不需要的脂肪酸，然后用己烷等萃取残存的全部脂质。
通过利用液化DME进行分级，虾青素那样的包含于脂质中的色素也与含有较多该色素的脂质一起被浓缩，能够直接以浓缩色素形式使用，或者，还可以进一步应用利用超临界二氧化碳进行萃取等的虾青素纯化方法进行纯化。
以下记载本发明的实施例，但本发明不限于此。
将实施例中使用的萃取装置的构成示于图1。将填充微生物的萃取柱(HPG-10-5，耐压硝子工业株式会社制，180mm×26mm(内径))的出口侧与储藏容器(HPG-96-3，耐压硝子工业株式会社制，容量96cm3)用不锈钢管连接。萃取柱和储藏容器包含使用了玻璃和聚碳酸酯的耐压容器。将液化二甲醚由二甲醚储槽输送到填充有微生物菌体的萃取柱，来自萃取柱的萃取液被回收到储藏容器内。进行规定时间的萃取后，打开储藏容器的减压阀，使二甲醚气化而将其除去，将残留的萃取物与水的混合物回收。
实施例1
从网粘菌萃取脂质
用GY培养基(将30g葡萄糖、10g酵母萃取物溶解于50％浓度的人工海水1L中，调节为pH 7.0)培养属于网粘菌纲的微生物海洋壶菌(Aurantiochytrium limacinum)的种菌。培养中使用50mL的三角烧瓶，在其中加入30mL的GY培养基，一边以100rpm振荡一边在28℃培养3天。通过离心分离从该培养液回收菌体，将回收的菌体用蒸馏水洗涤而除去培养基成分后，进一步通过离心分离回收菌体。将回收的菌体进行冷冻干燥，获得微生物生物质。获得的微生物生物质用-20℃的冰箱保存直至进行萃取。
在冷冻干燥的微生物生物质0.33g中加入蒸馏水1.263g并充分搅拌，将由此得到的样品用图1的萃取装置一边分级一边萃取。此时，将液化二甲醚的流量设为5mL/min。萃取柱的温度设为20℃，压力为0.51MPa。需要说明的是，之所以在微生物生物质中加入蒸馏水而使其呈含水状态，目的在于再现与从培养液回收的菌体相近的状态。期间不进行以破碎细胞为目的的操作。
关于萃取液，按照表1中记载的各时间而进行分级。将通入液化二甲醚而获得的各级分恢复到常温、常压，从而使二甲醚气化，由此从各级分中的萃取物除去二甲醚。进而，通过使干燥气体(本实施例中使用二甲醚)与萃取物充分接触而从各级分中的萃取物除去水分，获得表1中记载的量的油。
[表1]
注)级分编号为1～6的油的重量为实测值，合计重量为计算值。
利用如上获得的各油制备脂肪酸甲酯，供于利用气相色谱的脂肪酸组成分析。分析中，使用气相色谱：Agilent Technologies 7890A GC System，柱：J&W DB-WAX(内径0.25mm×长度30m，膜厚0.25μm)，在下述条件下进行分析：柱温度(升温条件)为140℃→240℃(4℃/分钟)，在240℃保持10分钟，载气为He(1.05ml/min)。将其结果示于表2。获得了各油的脂肪酸组成差异较大的结果，由此可知，以液化二甲醚为溶剂的萃取方法具有对脂质的分离选择性。
关于表2的级分编号为1和2的油，脂肪酸组成中的棕榈酸(C16:0)的值为约80％，极高。这是比本实施例的全部级分的油相加时的棕榈酸的脂肪酸组成还要高的值。因此可知，以液化二甲醚为溶剂的萃取方法是能够使含有被期待作为生物燃料的棕榈酸的脂质的比例提高的分级方法。
此外显示，表2的级分编号3、4、5的油的DHA的脂肪酸组成是比本实施例的全部级分的油相加时的DHA的脂肪酸组成还要高的值。因此可知，以液化二甲醚为溶剂的萃取方法是能够使含有DHA的脂质的比例提高的分级方法。
[表2]
注)级分编号为1～6的油的脂肪酸组成为实测值，
合计的脂肪酸组成为基于重量比的计算值。
实施例2
通过使用二甲醚进行选择性萃取而获得DHA浓度已浓缩的微生物油的方法
根据实施例1的结果，认为能够从微生物生物质选择性萃取除去C16：0等，使DHA等残留在生物质中。
实施例1中使用的微生物生物质中含有表3的“原料”一栏中记载的油。对该生物质仅进行萃取至表2的级分编号2为止。这样一来，在计算时，生物质中残留有表3的“萃取后生物质”所示组成的油脂。
如表3所示，可知通过利用以液化二甲醚为溶剂的萃取方法来萃取含有棕榈酸的脂质的比例高的脂质，能够提高含有微生物生物质中的其它脂肪酸例如DHA的脂质的比例。
使用该微生物生物质作为进一步萃取的原料，用己烷那样的对脂质的分离选择性低的溶剂进行萃取，从而能够高效地萃取含有DHA的脂质的比例已提高的脂质。
[表3]
实施例3
从红球藻萃取脂质
将购自BIOGENIC株式会社的红球藻干燥生物质(雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，BM070828，未破碎品)作为微生物生物质供于萃取。在微生物生物质0.403g中加入蒸馏水2.317g并充分搅拌，将由此得到的样品供于使用图1的萃取装置的萃取。此时，将液化二甲醚的流量设为10mL/min。萃取柱的温度设为20℃，压力为0.51MPa。期间不进行以细胞的破碎为目的的操作。将进行与实施例1同样的操作而获得的油的量示于表4，此外将对这些油进行脂肪酸组成分析而得到的结果示于表5。获得了各油的脂肪酸组成差异较大的结果，与实施例1同样地，可知以液化二甲醚为溶剂的萃取方法具有对脂质的分离选择性。
由实施例1及本实施例的结果可知，以液化二甲醚为溶剂、利用对脂质的分离选择性将脂质分级的方法能够不依赖于微生物种类而进行应用。
[表4]
[表5]
通过HPLC法测定实施例3中获得的各油中的虾青素的重量。虾青素标准品及各油溶解于丙酮：氯仿＝2：1，供于分析。分析条件如下(柱：COSMOSIL 250×4.6mm(i.d.),5C18-MS-PAQ类型(Nacalai Tesque株式会社制)；检测器：智能紫外可见检测器UV-2075plus(日本分光株式会社制)；流动相：甲醇:四氢呋喃＝9:1；流速：1.5mL/min；检测：470nm)。将结果示于表6。此外，表6中还记载了目视确认的各油的色调。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是属于绿藻纲的微藻类，含有脂溶性色素即叶绿素(绿色)作为光合成色素。此外知道：其包囊细胞中确实高浓度地蓄积作为脂溶性色素的虾青素(橙红色)。通过以液化二甲醚为溶剂的萃取而获得的各油的色调明显不同，由此确认液化二甲醚对这些脂溶性色素也具有分离选择性。利用该性质，能够降低例如叶绿素，其结果是能够提供一种制造呈更鲜艳的橙红色的含有虾青素的油的方法。
[表6]
产业上的利用可能性
根据本发明，能够从含有有用的高度不饱和脂肪酸的微生物生物质萃取脂质，同时能够将含有较多饱和脂肪酸的脂质与含有较多高度不饱和脂肪酸的脂质分级。提供一种将液化二甲醚并非单纯地作为萃取溶剂、而是作为一边分级一边萃取的溶剂来使用的方法。