嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是与淡水相关的普遍存在的细菌。如果吸入这种微生物，则可导致潜在致命肺炎，即，军团病(Legionnaire's Disease)、肺炎、庞提亚克热(Pontiac fever)；并且因此对家用水系统的所有者、运营商和处理者来说是一个严重问题，包括提供用水的公共设施运营商，如旅馆和餐馆等。尽管相较于爆发与家用水系统有关的嗜肺军团菌(L.pneumophila)感染，爆发与冷却水系统相关的嗜肺军团菌感染更为罕见，所述水系统如喷泉和与HVAC相关的组成部分，但冷却塔扩散污染有嗜肺军团菌的水滴的能力可导致涵盖广泛地理区域的感染爆发。
为了向冷却系统的所有者、运营商和处理者提供指导，各种准则、操作规范和规定已在全球范围内落实到位以检测和/或控制水源中军团菌属的扩散。在北美，存在两种准则，其由工业群体所编写，不久将定案：ASHRAE 188P和CTI STD-159标准。此外，OSHA已根据家用或工业水系统中所发现的军团菌属的计数，推荐了整改和处理的行动水平。
能够从水源中的混合微生物群体中识别和/或定量识别军团菌属对确定感染可能性，以及确定目前治疗方案是否有效预防或整改任何水系统中的军团菌属来说是至关重要的。美国CDC已推荐基于培养的测试途径，其利用军团菌属的耐酸性、独特菌落形态、对甘胺酸、万古霉素(vancomycin)、多粘菌素B(polymixin B)和环己酰胺抗生素的固有抗性以及向生长培养基中添加铁和L-半胱氨酸的绝对需求以成功增浓来自混合培养的军团菌属细菌。然而，军团菌属还是一种相对生长缓慢的生物，其在理想生长条件下需要2到10天才能在生长培养基上显现。鉴于成功分离军团菌属的复杂培养基需求和每个生长步骤所需的相对冗长培育时间，这种用于检测军团菌属的方法并不理想。
其它检测技术利用独特的军团菌属外膜蛋白质。由英国Oxoid有限公司提出的乳胶凝集方法是一种用于证实军团菌属菌落实际上是嗜肺军团菌SG1(即大多与爆发军团菌属有关的菌株)的手段。其它方法，如Biotica公司的LEGIPIDTM测试和Hydrosense公司的比色抗体测试，其已作为Fastpath Duo系统由纳尔科公司(Nalco)出售，是检测水中军团菌属的相对快速的基于抗体的方法。为了使水中的军团菌属直接显像，存在通过血清组1和2到14/15/16划定军团菌属的荧光抗体，所述血清组可与荧光显微镜一起使用。这些方法和装置的限制在于，其需要蛋白质来检测军团菌属。因为在细胞死亡后蛋白质可存在于水中，所以这些方法可导致假阳性检测。
技术实现要素：
一方面，描述了一种检查供水系统微生物污染的方法，其使用新颖的对军团菌属(Legionella)微生物物种具有高度特异性的敏感试剂。这种方法使用不与除军团菌属外的微生物物种进行交叉反应或最低限度地进行交叉反应的试剂。方法包括使供水系统与试剂接触，并检测或测量供水系统中军团菌属的污染浓度。在一个实施例中，方法使用PCR或qPCR步骤，其包括在所选退火温度下，使试剂引物或引物组合退火黏接到存在于军团菌属中的靶向核酸序列上。在另一实施例中，方法使用基于杂交的步骤。方法允许确定军团菌属浓度是否在可接受的安全性界限以内。
另一方面，提供一种新颖试剂，其对军团菌属微生物物种，例如嗜肺军团菌(L.pneumophila)具有高度特异性，并且不与除军团菌属外的微生物物种进行交叉反应或最低限度地进行交叉反应。在一个实施例中，试剂包含核苷酸引物，如qPCR或PCR引物，其对多个军团菌属具有高度特异性，但对假单胞菌属(Pseudomonas)无高度特异性。在另一实施例中，试剂包括衬底，核苷酸序列中的一种或多种固定或固着在其上。在另一实施例中，试剂是含有本文中所鉴定的引物的生物传感器。
在又一实施例中，提供一种试剂盒，其包含本文所述的新颖试剂中的一种或多种和其它分析方法组成部分，所述组成部分包括标记、衬底、能够与标记相互作用并产生可检测信号的标记组分。
这些方法和组合物的其它方面和优势在以下具体实施方式中作出进一步描述。
附图说明
图1A是使用qPCR引物的qPCR结果图示。
图1B是qPCR图示，其显示除嗜肺军团菌(L.pneumophila)外的军团菌属对比嗜肺军团菌和杜莫夫军团菌(L.dumoffi)的检测结果。
图2是ompS引物位置草图。
图3A是引物327对比528GC筛查的凝胶图像，其针对识别为以下的泳道中的纯化基因组DNA：A：DNA序列梯，B：嗜肺军团菌(pneumophila，对照物)，C：假单胞菌(Pseudomonas，阴性对照物)；D：杜莫夫军团菌(L.dumoffii)；E.长滩军团菌(L.longbeachae)；F：彻氏军团菌(L.cherrii)；G：嗜肺军团菌SG6A；H：嗜肺军团菌SG6B以及I：菲利军团菌(L.feelei)。所有物种通过显示一定交叉反应性的引物来检测。
图3B是引物327 SEQ ID NO:3和引物660 GC SEQ ID NO:9筛查的凝胶图像，其针对如图3A中所识别泳道中的纯化基因组DNA。未通过引物对检测到菲利军团菌，其显示较强交叉反应性。
图3C是引物327 SEQ ID NO:3对比825 GC SEQ ID NO:10筛查的凝胶图像，其针对如图3A中所识别泳道中的纯化基因组DNA。未通过引物对检测到菲利军团菌，其显示较小交叉反应性。
图3D是引物528 SEQ ID NO:4对比825 GC SEQ ID NO:10筛查的凝胶图像，其针对如图3A中所识别泳道中的纯化基因组DNA。检测到所有物种。观测到较小交叉反应性。
图3E是引物327 SEQ ID NO:3对比660 GC SEQ ID NO:9筛查的凝胶图像，其针对如图3A中所识别泳道中的纯化基因组DNA。检测到所有物种。观测到较小军团菌属交叉反应性。未观测到或观测到最小假单胞菌检测。
图3F是引物660 SEQ ID NO:5对比825 GC SEQ ID NO:10筛查的凝胶图像，其针对如图3A中所识别泳道中的纯化基因组DNA。未检测到菲利军团菌。观测到军团菌属交叉反应性。未观测到或观测到最小假单胞菌检测。
图4是测试使用引物528 SEQ ID NO:4/825 GC SEQ ID NO:10从CDC-ELITE测试样品中分离的DNA的凝胶图像。泳道中的DNA识别为A：DNA标记物，B：CDC-ELITE样品1，C：CDC-ELITE样品1-浓；D：CDC-ELITE样品2，E：CDC-ELITE样品2-浓；F：CDC-ELITE样品3，G：CDC-ELITE样品3-浓；H：CDC-ELITE样品4，I：CDC-ELITE样品4-浓；J：CDC-ELITE样品5，K：CDC-ELITE样品5-浓；L：CDC-ELITE样品6，M：CDC-ELITE样品6-浓。使用未过滤的样品获得有前景的结果。背景以约200倍样品浓度增加。528/825GC ompS引物SEQ ID NO:4和10的CDC测试结论分别通过箭头来指示，从左到右阅读：
箭头1.纯嗜肺军团菌样品基因组3，2.6×103cfu/ml；
箭头2.纯嗜肺军团菌样品基因组14，3.3×101cfu/ml；
箭头3.对于嗜肺军团菌为阴性；
箭头4.对于嗜肺军团菌为阴性；
箭头5.混合嗜肺军团菌样品基因组6，1.3×103cfu/ml；
箭头6.混合嗜肺军团菌样品基因组6，6.0×101cfu/ml。
图5是显示对使用本发明的引物(DMC)以及已知的引物SEQ ID NO:15和16从CDC-ELITE测试样品中分离的DNA进行对比测试的凝胶图像。泳道中的DNA识别为A：DNA标记物，B：CDC-ELITE样品1DMC，C：CDC-ELITE样品1-已知；D：CDC-ELITE样品2DMC，E：CDC-ELITE样品2-已知；F：CDC-ELITE样品3DMC，G：CDC-ELITE样品3-已知；H：CDC-ELITE样品4DMC，I：CDC-ELITE样品4-已知；J：CDC-ELITE样品5DMC，K：CDC-ELITE样品5-已知；L：CDC-ELITE样品6DMC，M：CDC-ELITE样品6-已知。这些结果显示测试样品无有意义的差异。DMC引物和已知的引物(衍生自美国专利公开案第20120171661号；SEQ ID NO:15和16)都在混合模拟环境样品中检测到嗜肺军团菌。未观测到改良。
图6A是显示使用铜绿假单胞菌作为阴性对照物，使用DMC引物SEQ ID NO:4和10以及SEQ ID NO:15和16引物从单培养基因组DNA分离株中分离的DNA的对比测试结果的凝胶。DMC引物以及引物SEQ ID NO:15和16都检测到各种军团菌属。DMC引物针对与铜绿假单胞菌有关的高水平污染性DNA具有较小交叉反应性。在凝胶上识别凝胶泳道。
图6B是显示使用脱氮假单胞菌作为阴性对照物，使用DMC引物SEQ ID NO:4和10以及已知引物SEQ ID NO:15和16从单培养基因组DNA分离株中分离的DNA的对比测试的凝胶。将2μl PCR产物载入到2.2％龙沙FLASHGELTM系统(Lonza FLASHGELTM system)上。凝胶的泳道A到K如下：A：DNA序列梯，B：嗜肺军团菌(DMC)，C：嗜肺军团菌(已知)；D：脱氮假单胞菌(DMC)；E：脱氮假单胞菌(已知)；F：杜莫夫军团菌(DMC)；G：杜莫夫军团菌(已知)；H：长滩军团菌(DMC)；I：长滩军团菌(已知)；J：菲利军团菌(DMC)；和K：菲利军团菌(已知)。SEQ ID NO:4和10PCR引物展示相比于已知引物的改良。本文所述的序列在各种条件下提供军团菌属的较小交叉反应性检测。
图7是嗜肺军团菌ompS基因序列SEQ ID NO:17的绘图，其指示本文所论述的新颖引物SEQ ID NO:1到10和其它已知引物SEQ ID NO:15和16的核苷酸位置。
图8A是Omp528/825GC SEQ ID NO:4/10引物的凝胶图像，其显示针对铜绿假单胞菌ATCC 15442的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M如下：
A：DNA序列梯，
B：1×105cfu/ml非标靶DNA，
C：1×105cfu/ml非标靶DNA、1×101cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
D：1×105cfu/ml非标靶DNA、1×102cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
E：1×105cfu/ml非标靶DNA、1×103cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
F：1×105cfu/ml非标靶DNA、1×104cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
G：1×105cfu/ml非标靶DNA、1×105cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
H：1×104cfu/ml非标靶DNA、1×106cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
I：1×103cfu/ml非标靶DNA、1×107cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
J：1×102cfu/ml非标靶DNA、1×107cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
K：1×101cfu/ml非标靶DNA、1×105cfu/ml嗜肺军团菌BAA74 DNA；
L：1×105cfu/ml嗜肺军团菌BAA74DNA；
M：无DNA对照物。
图8B是Omp528/825GC SEQ ID NO:4/10引物的凝胶图像，其显示针对洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图8C是针对少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)BAA 1092的Omp528/825GC SEQ ID NO:4/10引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图8D是针对产气肠杆菌(Enterobacteria aerogenes)ATCC 13048的Omp528/825GC SEQ ID NO:4/10引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图8E是针对肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ATCC 8308的Omp528/825GC SEQ ID NO:4/10引物的第一低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图8F是针对肺炎克雷伯氏菌ATCC 8308的Omp528/825GC SEQ ID NO:4/10引物的重复低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图9A是针对铜绿假单胞菌ATCC 15442的已知1116R/492 SEQ ID NO:12/11引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。1μM引物的PCR条件，3分钟95C；35X(94C在30秒，50C在30秒，72C 30秒以及10分钟72C。
图9B是针对洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416的1116R/492 SEQ ID NO:12/11引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。PCR条件与图9A中的一样。
图9C是针对少动鞘氨醇单胞菌BAA 1092的1116R/492 SEQ ID NO:12/11引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图9D是针对产气肠杆菌ATCC 13048的1116R/492 SEQ ID NO:12/11引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图9E是针对肺炎克雷伯氏菌ATCC 8308的1116R/492 SEQ ID NO:12/11引物的重复低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图10A是针对铜绿假单胞菌ATCC 15442的1126R/450 SEQ ID NO:14/13引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图10B是1126R/450 SEQ ID NO:14/13引物的凝胶图像，其显示针对洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图10C是针对少动鞘氨醇单胞菌BAA 1092的1126R/450 SEQ ID NO:14/13引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。参见表2的循环条件。
图10D是针对产气肠杆菌ATCC 13048的1126R/450 SEQ ID NO:14/13引物的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图11A是针对铜绿假单胞菌ATCC 15442的US20120171661引物SEQ ID NO:15和16的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。PCR条件在表2中列出。
图11B是F和R已知引物SEQ ID NO:15和16的凝胶图像，其显示针对洋葱伯克霍尔德菌ATCC 25416的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图11C是针对少动鞘氨醇单胞菌BAA 1092的US20120171661 F和R引物SEQ ID NO:15和16的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。参见表2的循环条件。
图11D是针对产气肠杆菌ATCC 13048的US20120171661 F和R引物SEQ ID NO:15和16的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
图11E是针对肺炎克雷伯氏菌ATCC 8308的US20120171661 F和R引物SEQ ID NO:15和16的低浓度梯度测试。凝胶的泳道A到M与图8A中的一样。
具体实施方式
如本文所述，提供例如试剂的新颖组合物和方法，其能够快速并精确检测水样品或供水系统中军团菌属(Legionella)，例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)的微生物污染。如下文实例中所展示，本文所述的组合物(试剂和引物)和方法改良已用于检测军团菌属的检测方法和组合物。本文所述的试剂和引物对军团菌属具有高度特异性，并且使用与更常见检测基因(如mip或dot/icm)有关的很大程度上忽略的标靶序列。这些引物用于检测污染的方法中，所述方法使用基于qPCR的检测来检测军团菌属，优选为嗜肺军团菌军团菌属，使用PCR以及基于杂交的方法。其中所用方法和引物允许在引物退火中使用低温，其在执行方法期间在能量使用中提供效率。另外，本文所述的试剂和方法针对高水平污染性DNA，例如常见于水系统中的假单胞菌，具有较低交叉反应性，并且这些方法和组合物由此实现具有较少假阳性结果的军团菌属污染检测。
A.定义以及方法和组合物的组成部分
如本文所使用，术语“供水系统”或“样品”意指任何天然存在的水体，例如湖、溪流、河；或工业或家用人造载水容器或物体，例如水库、池、喷泉、可饮用水或饮用水、含有或携载水的HVAC系统、瓶装水、工业供水系统或容器、废水容器等。这些供水系统或水样品可能仅含有军团菌属、具有高军团菌属水平的微生物有机体的混合群体、具有低军团菌属水平的微生物有机体的混合群体、无军团菌属的微生物有机体的混合群体或无微生物污染。这类样品或供水系统可能含有来自所指示微生物的标靶序列的未浓缩的或浓缩的DNA样品。
“标靶”意指在一个或多个军团菌属中所发现并且具有某些所要特征的核酸序列。相较于其它军团菌属基因序列，这类特征包括处于相对高水平的相对稳定表达。另一特征在于，核苷酸序列表达对生长条件不敏感且对于军团菌属来说是十分独特的，从而防止非军团菌属微生物的检测。标靶序列可在来自军团菌属微生物的核酸物质中发现，所述军团菌属微生物感染例如人类的哺乳动物个体并且污染水或供水系统。在一个实施例中，标靶是对军团菌属主外膜蛋白质的部分进行编码的序列蛋白质。标靶是来自军团菌属的单链核糖核酸序列或单链脱氧核糖核酸序列。这种定义包括来自军团菌属基因的RNA、mRNA、微RNA、单链DNA、cDNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、肽核酸(PNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)和DNA。在一个实施例中，所选标靶基因已知为军团菌属的主外膜蛋白质基因或ompS、omp28、lpg1974或lpnomp28。在一个实施例中，ompS标靶是无论生长条件如何似乎都受到稳定表达的基因，并且其大量保留在军团菌属内，使其成为用于检测供水系统污染的吸引人的标靶。ompS基因的核苷酸序列可在基因银行(Genbank)数据库中找到，其入藏登记号为M76178。另外参见SEQ ID NO:17。这种标靶基因还包括mompS或主外膜蛋白质前体基因，其序列在基因银行数据库中公开可用，入藏登记号为AF078147。
更确切地说，ompS序列标靶可能是SEQ ID NO:17的核酸区域或SEQ ID NO:17的同源物或天然存在的直系同源物，其为通过基于核酸的检测手段，如qPCR引物、PCR引物或杂交探针的检测提供适合“标靶”。为了在识别ompS标靶区域中易于使用，本说明书将参考SEQ ID NO:17的区域。然而，本领域中的普通技术人员应了解，具有来自SEQ ID NO:17序列或来自其它军团菌属ompS的修饰或突变的军团菌属ompS基因的同源序列同样包括在本文试剂和方法的描述中。
“军团菌属”意指军团菌属的任何物种，尤其是那些通常在水体或供水系统中发现的种类。军团菌属包括(但不限于)嗜肺军团菌、杜莫夫军团菌(L.dumoffii)、长滩军团菌(L.longbeachae)、彻氏军团菌(L.cherrii)、嗜肺军团菌SG6A、嗜肺军团菌SG6B、菲利军团菌(L.feelei)或其组合。因为嗜肺军团菌导致人类疾病，所以本文所述的试剂和方法的一个目标为在其它物种中检测污染性嗜肺军团菌。
如本文所使用，术语“试剂”可指代用于检测各种供水系统中军团菌属污染的单引物、一组或多组正向和反向引物、标记引物、固定于衬底上或阵列或微阵列中的引物，或并入上述中任一者的装置。
如本文所使用，术语“引物”打算意指在执行PCR或qPCR时可结合到标靶序列并扩增标靶序列的寡核苷酸序列。在一个实施例中，引物组包含沿5'到3'方向结合到标靶的编码链上的正向引物。在另一实施例中，引物组包含沿3'到5'方向结合到标靶序列的互补序列上的反向引物。如本文所使用，引物长度可为约15到约50个核苷酸，其包括这之间的任何中间长度，包括至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的长度。这类引物可以溶液形式，例如以缓冲液形式使用，或固定于衬底或微阵列上。在其它实施例中，引物可例如根据方法标记有例如可检测荧光、标记，因此标靶特异性寡核苷酸仅当标靶DNA在qPCR期间得到扩增时产生荧光信号，或使用荧光或其它标记，如绿I染料。
术语“微阵列”指的是可杂交阵列元素的有序排列。在一个实施例中，微阵列包含在衬底上杂交到特定标靶序列上的多核苷酸探针。在另一实施例中，微阵列包含多个引物(反向和正向)，其任选地固定于衬底上。
术语“PCR”指的是在每个微孔中含有基因特异性正向和反向引物以及经荧光标记的探针的有序排列的微流体板卡或多孔板。这种阵列在实时PCR反应中用于来自供水系统的样品或由其衍生的产物(例如，衍生自RNA的cDNA或cRNA)，所述反应使用荧光染料，例如SYBR绿，或使用报导基团荧光染料的Taqman技术来监测。每一组引物经设计以扩增所关注的标靶序列，如本文所述的那些标靶序列。鉴于本说明书中所描述的引物标识上的指示，这类引物可易于由本领域中的普通技术人员使用已知技术而设计。参见例如参考文献13。引物还可制得或可购自例如英杰公司(Invitrogen)：http://bioinfo.invitrogen.com/genome-database/browse/gene-expression/keyword/Taqman％20primers？ICID＝uc-gex-Taqman。
术语“实时定量PCR”或“qPCR”指的是将PCR扩增和检测组合成单个步骤的技术。对于qPCR，荧光染料用于在热循环期间标记PCR产物。实时PCR仪器在反应的指数期期间测量荧光信号的累积，以快速、精确地量化PCR产物和分析客观数据。qPCR反应产物使用两种主要策略中的一种进行荧光标记：反应在具有热循环和荧光检测能力的实时PCR仪器上进行。通过使用用于扩增的高效PCR引物和理想条件，各标靶分子在每次循环中复制一次，并且在热循环中采集到数据。因为qPCR反应使用较大摩尔过量PCR引物和耐热DNA聚合酶来发起，所以在热循环的早期回合中，标靶-模板是反应的限制因素，因此荧光信号与输入样品中标靶的量成正比。
B.本发明的试剂
在一个实施例中，用于检查供水系统微生物污染的试剂对军团菌属微生物物种具有高度特异性，并且不与除军团菌属外的微生物物种进行交叉反应或最低限度地进行交叉反应。在一个实施例中，这种试剂包含至少一种扩增军团菌属中的标靶序列或杂交到其上的核苷酸序列引物(DNA或RNA)。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸528与844之间并包括二者。在一个实施例中，ompS标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸327与491之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸327与844之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸327与491之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸327与550之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸327与680之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸528与550之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸528与680之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸660与844之间并包括二者。在另一实施例中，标靶序列存在于SEQ ID NO:17的核苷酸660与680之间并包括二者。在其它实施例中，标靶区域可包括上文所识别的那些区域，包括所识别序列的任一端上的约5到约15个额外核苷酸。
这些试剂可以是如上文所定义的引物，其选自下文表1中罗列为SEQ ID No:1、3、4、5和6的正向引物序列。应了解，这些序列可能因某些修饰而不同于表1的那些序列。在一个实施例中，修饰由表1中所显示和定义的所指示的摆动碱基的存在来指示。表中引物序列的其它修饰包括通过包括邻接到SEQ ID NO:17中每个正向引物位置的5'核苷酸碱基的1到约5个额外核苷酸5'而不同于表1中那些引物序列的引物序列。在另一实施例中，额外经修饰的引物序列可通过包括邻接到位于SEQ ID NO:17中的每个正向引物的3'核苷酸碱基的1到约5个额外核苷酸3'而不同于表1中那些引物序列。通过使用图7，可看出所识别的引物是如何通过向所识别引物的任一端添加相邻碱基、或从引物的任一端删除一个或多个碱基、或两种修饰类型的组合而得到修饰的。在又一实施例中，引物可通过以下而不同于表1中的序列：从表1中相关序列的从5'或3'端删除1、2、3、4或5个碱基，并向引物的相对端添加1、2、3、4或5个额外相邻碱基，由此移动引物序列。举例来说，一个引物序列可以是SEQ ID NO:4的修饰，并且覆盖SEQ ID NO:17的核苷酸526到550或SEQ ID NO:17的526到547等。
这些试剂可以是如上文所定义的引物，其选自下文表1中罗列为SEQ ID No:2、7、8、9、10的反向引物序列。应了解，这些序列可能因修饰，如所述表中所指示的摆动碱基，而不同于表1中的那些序列。如上文所述，额外修饰可产生经修饰的反向引物序列，其通过包括邻接到SEQ ID NO:17中每个反向引物的5'核苷酸碱基的1到约5个额外核苷酸5'而不同于表1中的那些序列。在另一实施例中，额外反向引物序列可通过包括邻接到SEQ ID NO:17中每个反向引物的3'核苷酸碱基的1到约5个额外核苷酸3'而不同于表1中的那些序列。以类似于上文对于正向引物所述的方式，表1的反向引物可通过从SEQ ID NO:17上的引物位置转移引物序列1到5碱基5'或3'来进行修饰。
因此，在一个实施例中，试剂包含含有选自表1的正向核苷酸序列引物和反向核苷酸序列引物的一组引物。在一个实施例中，试剂含有包含SEQ ID NO:1、3、4、5或6中的至少一者的正向引物，并且反向引物包含SEQ ID NO:2、7、8、9或10中的至少一者。在另一实施例中，试剂含有包含SEQ ID NO:4的正向引物和包含SEQ ID NO:8、9或10中的一者的反向引物。在另一实施例中，试剂含有包含SEQ ID NO:4的正向引物和包含SEQ ID NO:10的反向引物。在另一实施例中，试剂含有包含SEQ ID NO:4的正向引物和包含SEQ ID NO:8中的一者的反向引物。在另一实施例中，试剂含有包含SEQ ID NO:4的正向引物和包含SEQ ID NO:9中的一者的反向引物。以类似方式，试剂可包含表1中的正向和反向引物SEQ ID No:1到10的其它组合。在再一实施例中，试剂包含选自包含SEQ ID No:1到10或3到10的引物的多组试剂。在再一实施例中，试剂包含选自包含SEQ ID NO:1到10的引物序列的所有核苷酸序列引物或如上文所述在5'或3'端上具有其修饰的序列。
在再一实施例中，试剂包含衬底，核苷酸序列中的一种或多种固定或固着在其上。这种衬底是阵列、微阵列、微芯片、塑料表面或玻璃表面。将引物缔合在衬底上以及用于实现缔合的方法是此项技术中所熟知的。或者，视使用试剂的方法的类型而定，可提供内含引物序列的适合缓冲液。
在再一实施例中，试剂包括引物，可检测标记或标记组分与其缔合。适合可检测标记包括荧光标记，如那些由TAQMAN试剂所使用的荧光标记，或其它已知荧光分子。鉴于本说明书的教示内容，适合标记可由本领域中的普通技术人员从许多已知的标记类型中选择。
在又一实施例中，本发明的试剂可呈试剂盒形式，其含有以下中的一种或多种：引物；反向和正向引物组或所标记的引物-探针；适合标记和标记方法；适合衬底；和/或标记组分，例如酶类，其能够与缔合在引物上的标记进行相互作用并产生可检测信号。
在又一实施例中，试剂被配置为包含本文所述引物的水监测装置。
C.检测污染的方法
试剂，例如本文所述的引物，理想地用于检测军团菌属的方法，所述方法包括聚合酶链反应(PCR)、定量PCR(qPCR)技术或基于寡核苷酸杂交的方法。
一方面，提供检查供水系统微生物污染，尤其是受军团菌属污染的方法。这种方法包括使供水系统与对军团菌属微生物物种具有高度特异性的试剂接触，其中试剂不与除军团菌属外的微生物物种进行交叉反应或最低限度地进行交叉反应。其后，方法包括检测或测量供水系统中军团菌属的污染浓度。
在一个实施例中，方法中所使用的试剂是本文所述的试剂之一。举例来说，方法可使用包含选自以下的至少一种核苷酸序列引物的试剂：
(a)正向引物序列327，其包含SEQ ID NO:3
(b)正向引物序列528，其包含SEQ ID NO:4
(c)正向引物序列660，其包含SEQ ID NO:5；
(d)正向引物序列825，其包含SEQ ID NO:6
(e)反向引物序列GC-327，其包含SEQ ID NO:7；
(f)反向引物序列GC-528，其包含SEQ ID NO:8
(g)反向引物序列GC-660，其包含SEQ ID NO:9；
(h)反向引物序列GC-825，其包含SEQ ID NO:10；或
(i)引物序列的组合，其包含(a)到(h)或
(j)用摆动碱基，或通过添加或删除一个或多个5'或3'碱基，或通过沿引物1到5碱基在SEQ ID NO:17中的位置移动其位置来修饰这类引物序列。
在另一实施例中，方法使用选自(a)到(j)引物的多组试剂，或包括在适合方法中使用引物或反向/正向引物对中的一些或全部的多个步骤。相信上文所述试剂中的任一者适用于下文和实例中所描述的方法。
因此，在一个实施例中，方法包括进行PCR或qPCR步骤以扩增标靶序列，其通过在所选退火温度下，使引物或引物组合退火黏接到存在于军团菌属中的所标靶的核酸序列上。在一个实施例中，退火温度小于58℃。在另一实施例中，退火温度为约40℃。在另一实施例中，退火温度为约41℃。在另一实施例中，退火温度为至少40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50℃。在其它实施例中，本文所述试剂的退火温度低于使用其它已知ompS引物所用的退火温度。举例来说，如表2中显示，方法可包括在95℃下使样品与1μM引物接触3分钟；并且进行在94℃下变性30秒；在40℃或45℃下退火30秒；和在72℃下延长30秒的35次循环；以及10分钟72℃延伸步骤。其它条件详细地描述于下文的实例中。
在另一实施例中，测量包含将引物杂交到存在于军团菌属中的所标靶的核酸序列上，并且进行聚合酶链反应(PCR)或定量聚合酶链反应(qPCR)。这些方法使用扩增所标靶的序列并测定所述军团菌属浓度是否在可接受的安全性界限以内。
一旦引物已扩增标靶序列或通过杂交被识别到序列中，各种测量或检测污染量的方法即为本领域中已知的。检测方法可包括使用用于显像的琼脂糖凝胶使扩增的或杂交的标靶序列泳动。使电流流过凝胶会导致带负电的DNA转移到凝胶带正电的一侧。凝胶用结合到双链DNA的染料染色，由此允许显像。DNA越大，其移动通过凝胶的速度越慢。测量PCR结果以及杂交方法的其它方法可由本领域中的普通技术人员来选择。
因此，在一个实施例中，方法仅使用对多种嗜肺军团菌具有高度特异性的试剂。因此，在一个实施例中，方法和试剂可区分由军团菌属导致的供水系统污染以及由假单胞菌属，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)所导致的污染。
如下文实例中所展示，本文所述的引物在qPCR和PCR方法中提供较高程度的标靶特异性。实例显示针对来自各种菌株的纯化DNA的测试以及针对从六个CDC ELITE测试样品中提取的DNA的测试。如下文所论述，相较于描述于美国专利公开案第20120171661号中的已知SEQ ID NO:15和16引物序列，引物528/825gc更佳，这是因为其与其它微生物物种的交叉反应性较低。这些qPCR引物，例如SEQ ID NO:1和2或4以及10，相较于揭示于其它已知分析中的引物(如美国专利公开案第2012071661号中的引物)，能够更快地检测军团菌属。
为了进一步理解上述装置并且为了展示如何在实践中进行所述方法，某些实施例现将参考上文附图和下文所述的实例来描述。提供以下实例以用于说明并且不限制权利要求书和说明书的揭示内容或范畴。
实例1：标靶DNA的识别和所使用的分析
本发明人军团菌属基因识别为lpg1974(Weissenmayer,Prendergast等人，2011)作为用于新颖军团菌属检测试剂的适合标靶的来源。发现这种基因，又称为ompS(NCBI基因银行入藏登记号M76178.1)相比于其它军团菌属基因以相对高水平受到极其稳定地表达。因此，这种基因和其编码外膜蛋白质满足本发明的核苷酸序列双目标，所述核苷酸序列的表达将对生长条件不敏感且对于军团菌属来说是独特的，从而防止非标靶有机体的检测。
A.发展和测试qPCR引物
因为ompS的5'端相对于基因的其它区域似乎可变性较小，并且似乎对嗜肺军团菌有机体具有较高特异性，所以对其进行标靶以用于生成qPCR引物。本发明人使用一种工具，即IDT引物设计网站(http://www.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/)来建构具有特定解链温度、长度和均二聚体/杂二聚体特征的qPCR引物(表1)。
标靶DNA的扩增在以下条件下进行：
在95℃下持续3分钟；随后进行41次以下循环：在95℃下持续10秒，在58℃下持续10秒，在72℃下持续30秒；随后在95℃下持续10秒，随后使用软件默认条件绘制解链曲线。qPCR扩增在用于进行校验的具有商购军团菌属基因组标准物的CFX96伯乐系统(CFX96Bio-Rad System)中进行。qPCR条件根据所推荐的指示而改变，但因为效率和R^2值在标准参数内，所以所述变化不大可能产生任何影响。这些条件包括使用每反应孔12.5μl伯乐iQ SYBR Master Mix、0.15μl正向和反向引物(储备引物浓度为50μM)和4.7μl分子生物学级别H2O(而非适当的7.2μl H2O)。向所述容量中添加5μl 1/100稀释的纯化基因组DNA。
B.发展PCR引物
可用于传统PCR途径或基于杂交的途径的DNA区域同样经过分析以用于更广泛的检测，例如检测多种军团菌属。为了做到这一点，来自嗜肺军团菌的ompS基因和来自长滩军团菌的ompS基因的DNA序列经过排列并直接比较，以识别完全相似或具有足够高的序列相似性的区域，从而允许识别具有1至2个摆动碱基的引物。“摆动碱基”指的是基于反应中所使用的引物池，位于引物序列中的某些核苷酸碱基，替代性碱基选项对其来说是可能的。举例来说，在给定引物池中，“R”摆动碱基应是50％鸟嘌呤和50％胞嘧啶。这种途径使引物反应性变宽，从而包括DNA的高度相关区域而非100％相同区域。
以肉眼检查ompS排列以识别可用于引物的4个DNA区域，同时生成互补引物，因此关键区域可用于不同测试。使用传统PCR 2X Master Mix(普洛麦格公司(Promega))在以下条件下测试下文表1中所识别的引物：12.5μl Master Mix、0.5μl正向和反向引物以及9.5μl dH2O。向这其中添加2μl使用MolBio Ultraclean DNA分离试剂盒(MolBio Ultraclean DNA Isolation Kit)分离的纯化基因组DNA。初始筛检中的PCR条件如下：在95℃下持续2分钟，35次以下循环：在95℃下持续30秒、在45℃下持续30秒(由于引物解链温度需求，对于引物528SEQ ID NO:4和825Gc SEQ ID NO:10为40℃)以及在72℃下持续30秒；随后在72℃下持续10分钟以用于最终延伸步骤。
表1中所识别的引物序列SEQ ID NO:1到10和已知序列SEQ ID NO:15和16位于如图7中所示的ompS基因上。
表1：引物序列和名称
1来源是参考文献第11号。
2来源是参考文献第10号。
3来源是参考文献第8号。
4核酸“摆动碱基”缩写包括S，其代表C或G；M，其代表A或C；Y，其代表C或T；R，其代表A或G；和K，其代表G或T。
5引物名称上的“gc”指的是“所生成的互补序列”，其中引物制造商(IDT)生成位于DNA相对链上相同位置上的引物，因此DNA的相同区域可使用5'和3'都相对于其位置的引物进行测试。
C.初始引物比较
进行已知引物的一系列标竿分析，以确认新颖ompS引物当与其它已知ompS引物进行比较时，是否展示出改良。在最适于引物配置的条件下(比引物解链温度(TM)低2℃)进行的一个比较中，反应条件为12.5μl Master Mix、0.5μl正向和反向引物以及10.5μl dH2O，其中添加1μl使用MolBio Ultraclean DNA分离试剂盒分离的纯化基因组DNA。分析来自所定义的菌株和来自从CDC ELITE测试板所分离核酸的DNA。
D.改进的引物比较
从所定义的细菌物种(嗜肺军团菌ATCC BAA74、P.铜绿假单胞菌ATCC 15442、洋葱伯克霍尔德菌(Burkolderia cepacia)ATCC 25416、少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)BAA1092、气味黄杆菌(Flavobacterium odoratum，又名气味类香菌(Myroides odoratus))NCIMB 13294、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)ATCC 13048和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)ATCC 8308)中获得细胞悬浮液并分成两份等分试样。电镀一份等分试样以获得cfu/ml计数作为生物体浓度的测量值，并且经由MolBio Ultraclean DNA试剂盒对另一等分试样进行DNA分离。一旦确定每种起始菌落的cfu/ml，即根据细胞计数向每个DNA小瓶分配相等基因组单元/毫升浓度。稀释范围产生于其中以模拟标靶生物体的缺失，随后与高水平非标靶生物体DNA相关的军团菌属的量增加(参见表2中所指定的条件)。
表2：引物实验条件
以所述DNA浓度制造主块，因此相同DNA物质将用于每一反应。为了证实从反应开始到结束DNA样品中无有意义的变化或假阳性出现自交叉污染，从实验开始直到结束对引物SEQ ID NO:1到10进行测试。引物在其它公开案中所提议的条件下进行测试。
E.DNA凝胶方案
为了使PCR片段显像，出于凝胶灌制、缓冲液和安全性考虑，遵循龙沙公司(Lonza)的Flashgel基于盒的系统或标准操作流程。根据SOP，将5μl PCR产物/载入染料添加到每个孔中，同时将5份100bp DNA序列梯(普洛麦格公司)/载入染料添加到最左边的孔中(对于Lonza Flashgel系统为2μl)。在100V下在1x TBE缓冲液中操作1.5％琼脂糖凝胶达30分钟。随后，将其放置到空塑料吸头盒中并暴露于50ml 1X SYBR绿(英杰公司)下持续大约60分钟，随后在伯乐凝胶XR成像器(Bio-Rad Gel XR Imager)上显像。使用制造商的指示来操作龙沙Flashgel，并且用内置式成像相机进行显像。
实例2：用于广泛军团菌属检测的基于qPCR的方法
生成qPCR引物SEQ ID NO.1和2以确定ompS基因是否可在用于广泛军团菌属检测的基于qPCR的方法中使用。来自液体培养基所生长的铜绿假单胞菌和脱氮假单胞菌的DNA用作阴性对照物。来自嗜肺军团菌BAA74的DNA充当阳性对照物，同时从分离自CDC ELITE测试样品(杜莫夫军团菌、长滩军团菌、菲利军团菌和彻氏军团菌)的菌株中所提取的DNA用作实验样品。为了获得军团菌属DNA，在生物安全柜中，使用MoBio Ultraclean DNA提取试剂盒从细菌培养基板上抹拭采集菌落并搅拌到水中用于提取。在dH2O中对DNA进行1/100稀释随后分析，并且将来自伯乐的塑料试剂用于qPCR操作。商购的嗜肺军团菌基因组标准物充当用于5-对数标准稀释的物质。
操作效率为95.7％，同时R^2为0.999，表明尽管混合物和引物的浓度略高，但操作充分介于可接受的qPCR规范内。如图1A和1B中所见，相对于其它军团菌属细菌样品，嗜肺军团菌和杜莫夫军团菌似乎优先扩增。阴性对照物脱氮假单胞菌和无模板添加的对照物未能具有有意义的扩增，其中铜绿假单胞菌扩增范围为1×101cfu/ml。鉴于提取所用的细胞直接来自后期指数/稳定期细胞，这种计数可能不是铜绿假单胞菌细胞存在的精确测量，而是低等级交叉污染的指示。备受关注的是杜莫夫军团菌与qPCR ompS引物的高度反应性。
重复这一实验涉及根据活细胞计数而使DNA输入归一化，以获得大致相等的基因组单位/毫升并有助于证实这种高度相似性是精确的。
实例3：用于广泛军团菌属检测的杂交方法
在经观测为高度选择性军团菌属引物设计并且确定引物(表1)应被进一步隔开以用于所提议的杂交途径之后，新颖引物选自更向ompS基因的3'端集中的位置(参见图2和7)。根据与长滩军团菌的高度序列同源性来分离特异性区域。引物名称上的“gc”指的是“所生成的互补序列”，其中引物制造商(IDT)生成位于DNA相对链上相同位置上的引物，因此DNA的相同区域可使用相对于其位置的5'和3'引物进行测试。每种引物组的适用性随后使用在表2中所列出的条件进行测试。
为了测试这些引物，来自所抹拭的军团菌属菌株(或在铜绿假单胞菌和脱氮假单胞菌情况下的液体培养基)的基因组DNA使用ompS引物327、528、660和825沿着其“gc”对应部分(分别为SEQ ID NO:3到10)进行分析。视引物解链温度需求而定，每一反应的解链温度为45℃或40℃。对于此初始测试，反应条件如下：1μM引物，在95℃下持续3分钟，进行在94℃下变性30秒；在40℃或45℃下退火30秒；和在72℃下延长30秒的35次循环，最后进行10分钟72℃延伸步骤。结果显示于图3A到3F中。鉴于反应的明确性，选择引物对528/825gc SEQ ID NO:4和10以用于额外分析。
一旦已进行这些反应，即进行将这些引物与其它已知序列(例如引物SEQ ID NO:15和16(参考文献8))进行比较的额外操作，以确定引物SEQ ID NO:4和10是否改良军团菌属检测。测试落在两种途径内-测试针对纯化基因组DNA的引物以及测试由用于ELITE认证测试的US CDC提供的模拟样品。这些测试的结果显示于图4和5中。当分析CDC ELITE样品时，本发明引物的改良并不明确。然而，当针对纯化DNA进行相同测试时，在交叉反应性中观测到改良。引物528和825gc显示与非军团菌属微生物污染(例如铜绿假单胞菌)的较小交叉反应性，其它本领域中已知的序列(参见图6A和6B)。
根据这种初始筛检，修改测试方案。具有所定义基因组DNA的DNA的测试浓度可能过高，以致无法精确确定相对于引物SEQ ID No.15和16，本发明的引物是否存在改良。根据与冷却水服务公司的互动和场测经历，这些样品中典型的细菌负荷倾向于在约1×105cfu/ml。其次，扩大引物池以包括来自参考文献10和11的另外两组已知引物，即表1的SEQ ID NO:11到14。特定微生物物种根据公开案(参见例如参考文献1到3)和与水处理应用专家的讨论以及这些污染性微生物菌株的可用性进行测试。
如实例1中所述，生成具有与所计数的cfu/ml相等基因组单元/毫升的所分离的DNA的主块并用于PCR分析。随后观测到达到在全部非标靶样品中或对嗜肺军团菌DNA具有高非标靶比率的样品中观测到交叉反应性的程度。参见图8A到8F。528F和825gc反向引物在实验开始和结束时进行测试，以确保用其它引物所观测到的任何交叉反应性是真实的并且不是因物质的无意交叉污染而导致的。第一轮引物测试导致凝胶过淡以至于不能清楚地读取。图8E和8F显示实验的两个复制物。当重复这些测试时，预期结果将与图8E和8F一致。
有趣的是，使用这些针对洋葱伯克霍尔德菌(图9A和9B)和产气肠杆菌(图9C和9D)的引物时，观测到非特异性扩增，已用方框使其突出显示。这些结果紧接着表明528F和825gc引物相比于已知引物形成改良。类似改良未在肺炎克雷伯氏菌测试中观测到。
已知的1126R/450引物SEQ ID No.14和13根据在表2中所列出的条件进行分析。尽管不存在针对克雷伯氏菌的1126R/450引物效能的数据，但在关于交叉反应性测试物种时，与528F/825gc引物相关的效能未明显降低。引物似乎具有较高军团菌属检测阈值(1×102到1×103)。一些孔未能扩增；因此当重复这一实验时，其预期证实检测敏感性改良。
最后，引物SEQ ID NO:15和16在表2中的每一条件下进行测试，以确定其相对于本发明引物的效能。
综上所述，尽管凝胶品质一开始较差并且将重复使用，但针对洋葱伯克霍尔德菌观测到明显交叉反应性(图11A和11B)。此外，这表明DMC引物相对于US20120171661引物得到改良。
然而，这些引物的当前数据提供证据指示，本发明人所识别的引物对其它ompS或聚焦于mompS的引物形成改良以用于检测复杂样品中的军团菌属。
本文所用的技术和科学术语具有本发明所属领域的一般技术者所通常理解相同的含义并参考公开的文本，其为本领域的普通技术人员提供本申请案中所用的许多术语的一般指导。仅出于清楚起见提供任何定义并且不打算限制所要求的发明。
应了解，尽管本说明书中的各种实施例使用术语“包含”而呈现，但在各种环境下，相关实施例同样使用术语“由……组成”或“主要由……组成”来进行描述。应注意，术语“一(a)”或“一(an)”指的是一个或多个(一种或多种)，举例来说，“一测试化合物”理解为表示一种或多种测试化合物。因此，术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多个(一种或多种)”和“至少一个(至少一种)”在本文中可互换地使用。
许多上文所说明的实施例的修改和变化包括于本说明书中并且预计对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。相信这类针对本文所描述的组合物和方法的修改和改变包含于随附在此的权利要求书的范畴中。所有文献，包括专利、专利申请案和公开案、和上文所列或提及的非专利公开案、以及随附图式和/或序列表，皆以全文引用的方式并入本文中，其并入程度为其与本说明书的明确教示内容一致。
参考文献
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