密码子优化的重组质粒、刺激周围神经再生的方法以及治疗人类中的神经损伤的方法与流程

背景技术：
：根据不同的资料，在3-10％的人群中存在各种病因的周围神经损伤发生[1-3]。开发可改善标准治疗的质量的其他治疗方法的理由是由于长时间的康复期(一年及更长)、工作年龄患者的生活质量明显降低和高失能率。周围神经损伤是职业失能的常见原因。周围神经完整性修复方法的选择是由于每个个体病例损伤的许多特性，即损伤机制、从损伤起到手术干预时持续的时间、周围神经缺损的程度等等。通过端-端吻合术缝合被切开的神经区域是重建治疗模式中的一种。然而，周围神经损伤经常伴有严重的缺损，因此使这种途径不适用。在这种环境下，自体神经移植是修复神经完整性的最适当的选项。可获取功能较不重要的神经作为自体移植物。不同的导管可用作代用品。这些是被指定为代替延长的组织缺损并创建周围神经再生条件的管状结构。手术修复后受周围神经支配的肢体功能的恢复程度取决于各种因素，例如从损伤直到手术时过去的时间、缺损程度、从周围神经的损伤位置到受神经支配的区域的距离等等。然而，尽管神经完整性再建技术的进步，但即使在最有利的条件下，通常只发生受神经支配的肢体功能的部分恢复。这引起了对将会改善标准重建治疗和患者一般生活质量的结果的新方法的研究。利用生长因子诱导周围神经的再生是这些途径中的一种。这种概念产生于对在周围神经再生的自然过程中发挥重要作用的生长因子的知识积累[4]。血管内皮生长因子(vegf)是被充分研究的影响周围神经恢复的生长因子之一。vegf是血管生成和血管发生的主要调节剂之一。vegf是34-42kda的二硫键结合的糖蛋白二聚体。vegf-a是特异性的内皮细胞(ec)促分裂原。vegf诱导ec增殖、它们的激活、分化和它们形成毛细小管，进一步重塑成成熟血管。它也是增加ec存活的强大因子，因为它诱导抗凋亡蛋白的表达。编码vegf的基因的缺失在心血管系统发育过程中导致致死性的严重缺陷。人类vegf的基因位于染色体位点6р21.3。编码区包含约14,000bp。有数种vegf同种型例如vegf121、vegf145、vegf148、vegf165、vegf183、vegf189、vegf206，源于由8个外显子组成的mrna的可变剪接。具体的细胞外定位与各vegf同种型对应，所述同种型基于它们在结合硫酸肝素和硫酸乙酰肝素的能力中的生化差异。例如，人类vegf-a基因的所有转录本都含有外显子1-5和8，差异在于外显子6和7的可变剪接。在发现之后，vegf长期只被认为是血管生成的诱导物和用于治疗伴有组织缺血的不同病症的潜在治疗剂。然而，随着时间过去，已经得到了它对于周围神经系统和中枢神经系统两者的神经元的神经保护性质的资料[5，6]。vegf刺激施旺细胞(schwanncells)、星形细胞、小胶质细胞和皮层神经元的增殖[7-10]。在大鼠坐骨神经挤压性损伤模型中，显示了腰椎响应损伤显著增加vegf和flt-1(vegfii型受体)的表达[11]。因此，产生了利用这种生长因子作为周围神经损伤重建治疗的附加治疗组分的前提。利用vegf作为充入导管中的基质胶的部分诱导了轴突出芽，其随着所述导管中每单位横截面面积中轴突数量增加而显现[12]。在腓和胫神经广泛缺损的创伤模型中，在自体静脉移植物中使用荷载vegf的聚乳酸微球显著改善了神经功能指标并增加了所述移植物中有髓纤维的数量[13]。在试验中，vegf诱导施旺细胞在移植物中分裂并向远端部分迁移，这与毛细管和有髓纤维数量增加相关联[14]。在大鼠海绵体神经损伤模型中，在海绵体中引入vegf与bdnf的组合引起失去的神经支配和勃起功能恢复[15]。fgf是另一种生长因子，其具有诱导神经发生的性质。fgf在周围神经损伤中诱导施旺细胞增殖和迁移[16]。在动物试验中显示，阻断fgf、fgfr1和fgfr2的受体导致无鞘感觉纤维神经病和热疼痛敏感性的明显削弱[17]。在周围神经损伤模型中的骨髓源性干细胞应用引起fgf表达增加，按作者的意见，这诱导了施旺细胞迁移和增殖[18]。在胸部脊髓损伤模型中，在坐骨神经移植物中使用fgf促进了上肢运动功能的改善[19]。因此，基于所述试验数据可以推测，在周围神经修复的综合疗法结合这些生长因子可能是有效的。然而，生长因子的治疗应用已知有很多限制。在施用到损伤部位中之后，它们经历快速降解，因此不能保持它们的恒定浓度以达到期望的治疗效果[20]。因此，使用基因疗法更加合适。基于治疗剂编码基因的转移机制，有两种主要趋势，例如使用病毒和非病毒载体。然而，尽管病毒载体有高转染活性，但在临床中使用它们则因插入诱变、炎性应答和毒性的风险而受到限制。应用质粒dna是更安全的基因转移方法。在用端-端和端-侧吻合术修复肌皮神经的模型中，将有vegf基因的dna质粒在手术中施用到远侧区中引起吻合部位远侧区域的每单位横截面积的有鞘纤维数量显著增加，其与施旺细胞中vegf浓度显著增加有关联[21]。基因治疗构建物可神经旁注射。在坐骨神经损伤模型中，plvegf肌内给药并与覆盖吻合部位的透明质酸膜鞘联用以便降低瘢痕形成严重度。与它们用作单一疗法相比，所述药物肌肉注射伴有肌肉响应幅度的显著增加和所述吻合部位远侧的有髓纤维数量增加[22]。wangf等进行的研究证明了当在端-端缝合坐骨神经残端后神经内给予所述基因治疗构建物时的plvegf的剂量依赖性效果。使用较高的剂量引起最明显的神经生理参数增加和较少的小牛肌肉重量指标降低[23]。已经发现了一些因子在作用上的协同。例如，在坐骨神经损伤模型中vegf基因编码质粒和c-csf基因编码质粒联用，证明了在端-端吻合的远侧区域中有髓纤维和毛细管数量的更明显增加、在脊神经节中保持更多的神经元以及运动功能的早期恢复[24]。然而，当体内使用基因治疗剂时，只有一部分细胞被质粒dna转染。因此，细胞将同时被两种不同的基因治疗构建物转染的几率降低。因而，在一个质粒中组合具有协同作用的两种生长因子的遗传序列是合理的。这种途径的效力已在脊髓挫伤的动物模型中得到了证明。在该试验期间，已经显示，在将含有40μg的vegf和fgf2基因的质粒直接注射到脊髓中的环境下，在1.5cm的创伤核心内制作的截面中，毛细管数量有显著增加。还基于行为测试数据，与没有给予所述含vegf和fgf2基因的质粒的对照组动物相比，运动功能的恢复显著改善。基于得到的结果得出结论，应用所述双盒质粒改善了脊髓血管化并减少了脊髓灰质和白质的破坏面积[25]。然而，这些结果没有提供使用所述有vegf和fgf2基因的双盒质粒在周围神经损伤中是否有效的想法。这是由于以下事实，即挫伤的机制与伴有神经断伤的创伤在发病机理和严重程度上明显不同，后者更特定针对周围神经并在周围神经损伤的总结构中占优势。但最重要的差异是脊髓和周围神经的再生潜力不同。因此，有必要确定带有生长因子基因的质粒是否能用于有效改善周围神经再生。附图说明图1.重复途径。显现了有自体移植物的整个坐骨神经。图2.手术前的上肢图。在右上臂的下、中和上三分之一的前和后外侧表面上看到创伤后和术后凹陷的不规则疤痕。图3.这张照片显示了2-5手指的中节指骨缺乏主动运动，图4.可看出所有手指的抓握受损。图5.可看到在受正中神经和尺神经支配的区内手部肌肉的高度萎缩以及只能将手指1与手指2相对的能力。图6.照片显示了将重组质粒рbud(kan)-covegf-cofgf2注射到修复的神经中(参见正文)。图7.照片显示了应用纤维蛋白胶来防止所述重组质粒漏出。图8.照片显示了手和前臂肌肉的萎缩。c)指甲改变：发育不良；d)分泌功能(出汗)：降低。图9.钩状抓取(提袋状)。图10.拳状抓取。图11.指尖抓握(手指i-iii)。图12.指尖抓握(手指i-iii)。图13.指尖抓握(手指i-iv)。图14.显示了鱼际肌群的肌电图结果的图。图15.小鱼际肌群的肌电图发现。发明的详细说明发明的范围是医学，它优选的使用领域是神经外科、创伤学和颌面外科，周围神经损伤的治疗。本发明的目的是利用基因治疗构建物来改善重建治疗的结果。vegf和fgf-2基因的遗传序列是双盒优化的重组质粒pbud(kan)-covegf-cofgf2的主要组分。本发明的物质通过利用以seqno.1示出的密码子优化的重组质粒pbud(kan)-covegf-cofgf2构成的药物以诱导周围神经再生，通过恢复受损神经的运动和灵敏度功能并明显减少治疗期、包括损伤后后期，实现了所要求的技术结果。最接近的类似情况是专利ru3459630с1“用遗传构建物的神经再生刺激技术(stimulationtechniqueforneuroregenerationwithgeneticconstructions)”，描述了当注射双盒质粒pbud(kan)-vegf-fgf2时，大鼠脊髓的创伤后再生方法。该发明是为了保护以下对象。密码子优化的重组质粒pbud(kan)-covegf-cofgf2，其含有vegf和fgf2编码基因，由核苷酸序列seqno.1示出，用于周围神经再生；周围神经再生的刺激技术，其通过在术中或术后期间在神经内、神经周和神经旁施用由序列seqno.1示出的所述密码子优化的重组质粒pbud(kan)-covegf-cofgf2来实现。受损人类神经的治疗方式，其通过将有效量的如权利要求1所述的质粒pbud(kan)-covegf-cofgf2注射到损伤区域中来实现。基于基因治疗剂开发经验，我们的研究组目的在于创建治疗周围神经损伤患者的有效产品。为此目的，我们开发了各种基因治疗构建物，它们通过被编码的转基因的数量、转基因以及相同转基因的核苷酸序列而相互不同。利用基因治疗构建物来改善周围神经恢复的经验已有描述[26]。当在分离的周围神经损伤模型中评价使用同时编码vegf和fgf2基因的质粒的效力时，所述药物均等地以45μg的总剂量直接注射到远端和近端以及注射到自体神经移植物中。大鼠用作实验动物；它们被分成三组，即未处理组、施用基因治疗构建物的试验组和注射磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液而不是研究药物的对照组。周围神经再生动力学的评价标准包括神经生理参数例如神经传导速度和肌肉响应幅度以及组织学检查结果例如有髓纤维数量和毛细管网密度。在注射所述质粒构建物后的第56天，试验组的神经生理参数优于对照组，然而，它们明显不及完好动物。基于所述组织学检查结果，实验组中每单位横截面积的有髓纤维数量明显高于对照组，然而，尽管这样，却没有观察到肢体功能的有效恢复。实验结果显示，使用含有生长因子的遗传序列的质粒基构建物发挥刺激周围神经再生的作用，然而，作用强度达不到最佳。我们认为这主要是由于用于我们研究中的质粒本身的缺点。为了改善所述基因治疗构建物的性质，对它的结构做出了很多重大改变。首先，载体被修饰：除去标签序列并以卡那霉素抗性基因代替。其次，为了增加表达效力，使用了vegf和fgf2基因的密码子优化的cdna序列(seqno.1)。其后，我们利用所述密码子优化的质粒，在周围神经损伤模型中再次进行了很多试验研究。基因治疗构建物在周围神经缝合后立即神经内施用。结果在所述手术干预和药物施用后60天内评价(图1)。在我们使用的所有质粒dna中，所述含有fgf-2和vegf遗传序列的密码子优化的双盒质粒得到了最好的结果。基于所使用的基因治疗构建物pbud(kan)-vegf-fgf2改善周围神经再生的效力的非临床数据，我们启动了一项临床研究，其结果在下面给出。患者b.，1985年出生，在2011年4月04日被收入鞑靼斯坦共和国卫生部的共和国临床医院(republicclinicalhospitalofmohoftherepublicoftatarstan)创伤中心，诊断如下：右上臂中三分之一的正中神经和尺神经损伤后遗症(图2)。根据病史：2009年，患者上臂的中间三分之一被玻璃割伤，正中神经和尺神经受损。正中神经和尺神经立即被端-端缝合，然而，在紧接手术后期间，完全缺乏运动和敏感性功能。康复治疗过程没有产生明显结果。后来，在7个月时，由于运动和敏感性功能恢复中缺乏正性改变，在2010年进行了正中神经和尺神经的神经松解术。在术后随访中观察到稍有再生变化，即，完全缺乏敏感性，同时，出现以手和手指的轻度弯曲为特征的运动功能，因此决定进行手术治疗。在手术之前，2011年4月21日时，对患者进行了检查，结果如下：营养失调a)皮肤状态：正常颜色，手指温度降低，冰冷感增加；b)手和前臂肌肉与正常手臂相比萎缩；大于2cm(图2-3)；c)指甲改变：发育不良；d)分泌功能(出汗)：降低。在患者由所述神经支配的自主区中的敏感性测试：编号敏感性种类简要说明1.疼痛无2.温度无3.触觉无4.分辨力无5.二维空间感无6.立体感无7.压力感无8.重量感无程度敏感性恢复s0神经自主区内缺乏敏感性运动功能测试程度运动功能恢复m2关节明显挛缩且没有运动手抓握模式；手不能执行任何类型的抓握(图3-4)。诊断：2年前的前臂中三分之一的正中神经和尺神经损伤持续。正中神经和尺神经缝合术和神经松解术后的状态(图5)。在2011年4月26日进行手术，包括正中神经和尺神经的神经松解术伴以神经内施用编码所述vegf和fgf-2基因的质粒dna。手术运行：在神经阻滞麻醉下，按照手术域的三重处理，在右上臂的内表面上进行拱形切开。正中神经和尺神经有技术难度地分离开。找出缝合线。没有观察到神经瘤迹象，然而，所述神经参与疤痕成形过程并与周围组织粘连。用胰岛素针注射所述含有重组vegf和fgf-2的质粒，每神经在2.5ml生理盐水溶液中250μg。所述注射给入缝合区以及向近侧和向远侧10cm(图6)。然后，在所述分离的神经上施加2ml的双组分纤维蛋白胶“tissucol”(图7)。止血。伤口缝合。放置橡皮管引流。施加无菌敷料。施加石膏绷带。在手术后一个月进行再次检查。2011年5月25日体检结果：营养失调：a)皮肤状态：正常颜色；b)手和前臂肌肉与正常手臂相比萎缩；大于2cm(图8)；c)指甲改变：发育不良；d)分泌功能(出汗)：降低。在患者由所述神经支配的自主区中的敏感性测试：程度敏感性恢复s1神经自主区内的深部痛觉敏感性恢复运动功能测试程度运动功能恢复m2关节明显挛缩且没有运动手抓握模式：手不能执行任何类型的抓握。术后6个月内进行定期检查。日期在2012年11月15日的体检结果如下：营养失调：a)皮肤状态：正常颜色；b)手和前臂肌肉与正常手臂相比萎缩-中度(1-2cm)和重度-大于2cm；c)指甲改变：在正常限度内；d)分泌功能(出汗)：正常在患者由所述神经支配的自主区中的敏感性测试：程度敏感性恢复运动功能测试程度运动功能恢复m3关节轻度运动(有效的恢复)手抓握模式：1)圆柱形抓取-是2)球形抓取-是3)钩形抓取(提袋状)-是4)拳形抓取-是5)指尖抓握a)末端相对-是b)(近末端相对-否)6)侧抓握a)捏形抓取-否b)(剪形抓取-“夹烟状”)-否。术后一年内，患者定期检查。日期为2012年4月20日的体检结果如下：营养失调：a)皮肤状态：正常颜色；b)手和前臂肌肉与正常手臂相比萎缩-中度，1-2cm；c)指甲改变：在正常限度内；d)分泌功能：在正常限度内。在患者由所述神经支配的自主区中的敏感性测试：运动功能测试程度运动功能恢复m4克服一些阻力的运动手抓握模式：1)圆柱形抓取-是2)球形抓取-是3)钩形抓取-是(图9)4)拳形抓取-是(图10)5)指尖抓握(图11-13)a)末端相对-是b)近末端相对-是6)侧抓握a)捏形抓取-是b)剪形抓取-是。因此，所述临床研究结果显示，在神经内施用所述基因治疗构建物后的一年内，肢体功能显著改善。改善的肢体功能状态表现为营养失调严重性降低、在正中神经和尺神经的神经支配区域内所有类型的敏感性发生、以及运动功能显著改善。基于肌电图学结果，在这一年里鱼际肌响应幅度从0mv增加到5mv并且几乎达到对侧肢体的值(图14和15)。所述双盒质粒使用效力是由于同时传递两种基因vegf和fgf2的可行性，促进了更有效地诱导周围神经再生。被引入所述密码子优化的质粒结构的改变使得能够显著增加所编码的基因的表达，确保了这些生长因子在创伤核心所需要的治疗浓度，这提高了周围神经恢复效力。因此，我们推测得到当利用所述质粒pbud(kan)-covegf-cofgf2时达到的临床效果是由于这两种生长因子的组合和它们密码子序列的优化。令人遗憾的是，在现阶段，我们不能依靠上述基因治疗构建物来明确地确定诱导周围神经再生的机制，这需要进一步研究。然而，在试验和临床观察中，已经确定了它们用于改善周围神经损伤的手术治疗结果的效力。参考文献1.hudso，a.r.周围神经修复时程：重要的局部和神经病理因素(timingofperipheralnerverepair：importantlocalandneuropathologicalfactors)/a.r.hudson//clinicalneurosurgery.-1977.-24卷.-c.391-405.2.deitch，e.a.112例肢体猎枪伤的经验(experiencewith112shotgunwoundsoftheextremities)/e.a.deitch，w.r.grimes//jtrauma.-1984.-24卷.-600-603页.3.在有多发性损伤的患者群体中上下肢周围神经损伤分析(analysisofupperandlowerextremityperipheralnerveinjuriesinapopulationofpatientswithmultipleinjuries)/c.a.munro//j.trauma.-1998.-45卷.-116-122页.4.terenghi，g.周围神经再生和神经营养因子(peripheralnerveregenerationandneurotrophicfactors)/g.terenghi//j.anat.1999.-194卷.-页.5.血管内皮生长因子具有神经营养活性和刺激轴突长出，在周围神经系统中提高细胞存活和施旺细胞增殖(vascularendothelialgrowthfactorhasneurotrophicactivityandstimulatesaxonaloutgrowth，enhancingcellsurvivalandschwanncellproliferationintheperipheralnervoussystem)/m.sondell，m.kanje.g.lundborg//jneurosci.-1999.-19卷，№14-5731-40页.6.vegf-a165b是体内和体外血管内皮生长因子a的内源性神经保护性剪接同种型(vegf-a165bisanendogenousneuroprotectivespliceisoformofvascularendothelialgrowthfactorainvivoandinvitro)/n.beazley-long[等]//jpathol.-2013.-183卷，№3-918-29页.7.sondell，m.血管内皮生长因子刺激去细胞神经移植物的施旺细胞侵入和新生血管化(vascularendothelialgrowthfactorstimulatesschwanncellinvasionandneovascularisationofacelularnervegrafts)/m.sondell，g.lundborg，m.kanje//brainres.-1999.-846卷-219-228页.8.中脑外植体培养物中血管内皮生长因子的血管、神经胶质和神经元作用(vascular，glialandneuronaleffectsofvascularendothelialgrowthfactorinmesencephalicexpiantscultures)/w.f.silverman[等]//neuroscience.-1999.-90卷-1529-1541页.9.forstreuter，f.血管内皮生长因子诱导小胶质细胞的趋化性和增殖(vascularendothelialgrowthfactorinduceschemotaxisandproliferationofmicroglialcells)/f.forstreuter，r.lucius，r.mentlein//j.neuroimmunol.-2002.-132卷-93-98页.10.zhu，y.血管内皮生长因子通过调节e2f表达促进皮层神经元前体增殖(vascularendothelialgrowthfactorpromotesproliferationofcorticalneuronprecursorsbyregulatinge2fexpression)/y.zhu[等]//jfaseb.-2003.17卷-186-193页.11.坐骨神经压轧伤后vegf及其flt-1受体的诱导(inductionofvegfanditsflt-1receptoraftersciaticnervecrushinjur)/r.r.islamov[等]//neuroreport.-2004.15卷，№13-2117-21页.12.血管内皮生长因子对去细胞神经移植物中神经再生的作用(effectsofvascularendothelialgrowthfactoronnerveregenerationinacellularnervegrafts)/j.m.rovak[等]//jreconstrmicrosurg.-2004.20卷，№1-53-58页.13.荷载血管内皮生长因子的聚(乳酸-共-乙醇酸)微球诱导的侧向轴突出芽到桥接两根健康神经的静脉移植物中：神经移植物利用控释系统预先制造(vascularendothelialgrowthfactor-loadedpoly(lactic-co-glycolicacid)microspheres-inducedlateralaxonalsproutingintotheveingraftbridgingtwohealthynerves：nervegraftpréfabricationusingcontrolledreleasesystem)/h.karagoz[等]//jmicrosurgery.-2012.32卷，№8-635-41页.14.sondell，m.血管内皮生长因子刺激去细胞神经移植物的施旺细胞侵入和新生血管化(vascularendothelialgrowthfactorstimulatesschwanncellinvasionandneovascularizationofacellularnervegrafts)//m.sondell，g.lundborg，m.kanje//brainres.-1999.846卷，№2-219-28页.15.血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子对神经夹挫伤大鼠模型中海绵体神经再生的作用(theeffectofvascularendothelialgrowthfactorandbrain-derivedneurotrophicfactoroncavernosalnerveregenerationinanerve-crushratmodel)/ps.hsieh[等]//bjuint.-2003.92卷，№4-470-5页.16.grothe，c.fgf-2系统在周围神经再生中的生理功能和推测的治疗效果-根据小鼠和大鼠体内研究的课程(physiologicalfunctionandputativetherapeuticimpactofthefgf-2systeminperipheralnerveregeneration-lessonsfrominvivostudiesinmiceandrats)/k.haastert，j.jungnickel，c.grothe//brainresrev.-2006.51卷-293-299页.17.furushol，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