全细胞催化合成L-2-哌啶甲酸的方法与流程

本发明属于生物催化
技术领域：
，具体涉及全细胞催化合成l-2-哌啶甲酸的方法。
背景技术：
：l-2-哌啶甲酸是一种天然存在的非蛋白质构型氨基酸，是重要的手性药物中间体，可用于制备雷帕霉素，抗肿瘤剂vx-710，免疫抑制剂fk506，哌啶生物碱等，具有很高的产业化应用价值。目前的主要生产方法为化学合成，存在产率低，能耗高，污染大等缺点。同时ee值难以控制。fujii等利用重组表达l-赖氨酸-6-氨基转移酶和二氢吡咯-5-羧酸酯还原酶的大肠杆菌工程菌，在159小时积累到了3.9g/l产物。后续通过添加lysp赖氨酸透性酶和yeie，在111小时最高积累到16g/l。该方案主要问题为反应时间过长，产物生成量过少，实际生产成本过高，难以放大生产。yasushitani等人通过共表达lysr，raip，dpka，gdh等共四个蛋白，实现了从dl-lysine到l-2-哌啶甲酸的转化，46小时产物转化率达到87.4％，但涉及到多个蛋白的共表达，存在菌种构建难度大，重复性差等缺点。ying等利用含有pipa基因的大肠杆菌做为全细胞催化剂，并优化nad浓度，反应温度，反应ph，金属离子以及表达活性剂添加等，最终产物可达到17.25g/l。该方案中pipa酶活不高，导致了使用全细胞量过多(od＝200)，底物浓度不高(赖氨酸25g/l)，并且需要分批次添加底物才能反应完全。这些因素会导致在放大生产时成本过高等问题。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是开发一种高效率的生物催化系统，以期提高底物投量，缩短反应时间，并能获得高ee值的产物。为了实现上述的发明目的，本发明的采用的技术方案如下：全细胞生物催化合成l-2-哌啶甲酸的方法，以l-赖氨酸盐酸盐或l-赖氨酸为底物，通过添加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及重组宿主菌，通过生物催化制备l-2-哌啶甲酸；其中重组宿主菌为含有arenimonasdonghaensisdsm18148蛋白编码基因的重组宿主菌、含有pseudomonasveroniicip104663蛋白编码基因的重组宿主菌或者含有streptomyceshirsutusatcc19091蛋白编码基因的重组宿主菌中的任意一种。其中，所述重组宿主菌为大肠杆菌。进一步地，反应在ph8.0的磷酸钾缓冲溶液中进行。优选地，反应温度为20℃-30℃。同时，我们还优选公开反应在摇床上进行，摇床转速为180rpm。最后，我们公开了其中重组宿主菌的浓度为50g/l-150g/l。采用本发明所公开的全细胞催化合成l-2-哌啶甲酸的方法，克服了目前化学合成法成本高、条件苛刻、转化率低、能耗高、污染大的问题。同时本发明所公开的生物催化系统酶活效率高，反应时间短，目标产物ee值高。附图说明图1为nypdc的表达质粒图谱图2为nypda，nypdb，nypdc，nypdd，nypde的蛋白表达上清、包涵体sds-page图谱图3为实施例8中生物转化反应的tlc图谱图4为实施例8中l-2-哌啶甲酸的hplc谱图图5为实施例8中l-2-哌啶甲酸的ms谱图图6为seqidno.10的表达质粒图谱图7为含有seqidno.10表达质粒的大肠杆菌的sds-page图谱。图8为实施例15中生物转化反应的tlc图谱图9为实施例15中l-2-哌啶甲酸的hplc谱图图10为实施例15中l-2-哌啶甲酸的ms谱图图11为seqidno.13的表达质粒图谱图12为含有seqidno.13表达质粒的大肠杆菌的sds-page图谱。图13为实施例19中生物转化反应的tlc图谱图14为实施例19中l-2-哌啶甲酸的hplc谱图图15为实施例19中l-2-哌啶甲酸的ms谱图具体实施方式为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。以下实施例中涉及到的tlc检测中：展开剂：三氯甲烷：甲醇：水＝6:5:1，混匀后放置10min左右。硅胶板规格：薄层层析硅胶板5*10。显色剂：茚三酮显色100ml乙醇加入0.1g茚三酮，500ul冰乙酸混匀。以下实例中涉及到的lc-ms检测条件为：prevailc18色谱柱(250×4.6mm，i.d.5μm)；柱温：30℃；流动相：0.4％(v/v)三氟乙酸水溶液；流速：0.5ml/min；检测器：蒸发光散射检测器(elsd)；检测器温度：120℃；载气：氮气(纯度99.9％)；载气流速：4l/min；进样体积：10μl。实施例1将arenimonasdonghaensisdsm18148置于lb培养基中，置于30℃,180rpm培养3-5天，离心收集沉淀，用dna提取纯化试剂盒qiaampkit(qiagen，germany)提取纯化arenimonasdonghaensisdsm18148dna。用pfu高保真酶对arenimonasdonghaensisdsm18148基因组dna进行pcr扩增，所用引物为nypd-f5'atgaccatgacccagctcacca3'nypd-r5'tcaggccgcctgcttgc3'由于arenimonasdonghaensisdsm18148dna片段gc含量接近70％，故在扩增时添加终浓度0.5m的甜菜碱。之后将扩增的片段用taq聚合酶72℃处理10分钟，在dna3'端添加碱基a。之后将其连接到pmd19t-simple(takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海生工生物进行测序。测序得到dna序列为seqidno.1，相应的氨基酸序列为seqidno.2。实施例2由于原dna序列gc含量过高，在宿主菌中培养时难以实现高效转录。故通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用 同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3，命名为nypda。参考图1的方式构建含有nypda的表达质粒。实施例3通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.4，命名为nypdb。参考图1的方式构建含有nypdb的表达质粒。实施例4通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增： 98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.5，命名为nypdc。按照图1的方式构建含有nypdc的表达质粒。实施例5通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.6，命名为nypdd。参考图1的方式构建含有nypdd的表达质粒。实施例6通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用 同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.7，命名为nypde。参考图1的方式构建含有nypde的表达质粒。实施例7挑取含有nypda表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行sds-page检测。按照上述方法，分别制备nypdb，nypdc，nypdd，nypde的菌体并进行sds-page蛋白胶检测，结果见图2。sds-page蛋白胶显示，其中nypdc的表达量最高，故做为优选序列进行后续实验。实施例8加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，150g/lnypdc菌体，25g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，当反应16小时时，检测结果如图3，结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行lc-ms检测，检测结果如图4，图5所示。实施例9加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，50g/lnypdc菌体，74g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行lc-ms检测，测得最终产物浓度达到37g/l。实施例10加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，50g/lnypdc菌体，100g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行lc-ms检测，测得最终产物浓度达到 66.7g/l。实施例11加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，50g/lnypdc菌体，150g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，结果显示48小时生成大量产物，无底物残余。同时取样进行lc-ms检测，测得最终产物浓度达到76.9g/l。实施例12将pseudomonasveroniicip104663置于lb培养基中培养，控制温度为28.0℃，180rpm培养3天，离心收集沉淀，用dna提取纯化试剂盒qiaampkit(qiagen，germany)提取纯化pseudomonasveronii基因组dna。用pfu高保真酶对pseudomonasveronii基因组dna进行pcr扩增，所用引物为pve-f5'atggtggcacagcgagcaac3'pve-r5'tcatgctaattttaaggtacggtcg3'由于pseudomonasveroniicip104663的dna的gc含量接近50％，故使用pfu高保真酶直接扩增。之后将扩增的片段用taq聚合酶72℃处理10分钟，在dna3'端添加碱基a。之后将其连接到pmd19t-simple(takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至南京金斯瑞生物进行测序。测序得到dna序列为seqidno.8，相应的氨基酸序列为seqidno.9。实施例13通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整dna序列的gc含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.10。按照图6的方式构建含有seqidno.10的表达质粒。实施例14挑取含有seqidno.10表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行sds-page检测。结果见图7，其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。sds-page蛋白胶显示，含有seqidno.10表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。实施例15加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，65g/l含有seqidno.10表达质粒的菌体，60g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，当反应16小时时，检测结果如图8，结果显示28小时生成大量产物，无底物残余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为48.7g/l。同时取样进行lc-ms检测，检测结果如图9，图10所示。 实施例16将streptomyceshirsutusatcc19091置于atccmedium196培养基中培养，控制温度为26.0℃，180rpm培养2天，离心收集沉淀，用dna提取纯化试剂盒qiaampkit(qiagen，germany)提取纯化streptomyceshirsutusatcc19091基因组dna。用pfu高保真酶对streptomyceshirsutusatcc19091基因组dna进行pcr扩增，所用引物为shi-f5'atcttgcaagctgagcgcacg3'shi-r5'tcatcgtcgcgctccggc3'由于streptomyceshirsutusatcc19091的dna局部gc含量接近80％，故在扩增时添加终浓度0.5m的甜菜碱。之后将扩增的片段用taq聚合酶72℃处理10分钟，在dna3'端添加碱基a。之后将其连接到pmd19t-simple(takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至上海杰李生物进行测序。测序得到dna序列为seqidno.11，相应的氨基酸序列为seqidno.12。实施例17通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，并且调整dna序列的gc含量到40％～60％，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.13。按照图11的方式构建含有seqidno.13的表达质粒。实施例18挑取含有seqidno.13表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取少量菌体进行sds-page检测。结果见图12，其中1道为蛋白上清，2道为包涵体。sds-page蛋白胶显示，含有seqidno.13表达质粒的大肠杆菌表达量高，满足生物转化反应实验的需要。实施例19加入0.1m磷酸钾缓冲液(ph8.0)，50g/l含有seqidno.13表达质粒的菌体，55g/ll-赖氨酸盐酸盐，0.1mmnad，敞口反应，25℃，摇床转速设为180rpm。反应中不断取样进行tlc检测，当反应16小时时，检测结果如图13，结果显示16小时生成大量产物，无底物残余。对获得的产物进行定量实验，产物最终浓度为32g/l。同时取样进行lc-ms检测，检测结果如图14，图15所示。当我们在体系中加入l-赖氨酸的时候，其快速转变为l-赖氨酸盐酸盐，然后按照前述实施例的方式进行反应。通过使用本发明的新酶蛋白质，以及优化后的基因序列，配合优化后的转化工艺，能够有效地制造做为医药中间体在工业上有用的化合物l-2-哌啶甲酸，工艺简单且得率高。转化所使用的底物为工业上大量生产的l－赖氨酸，且价格低廉，根据2016年1月份的国内赖氨酸市场行情，98％含量赖氨酸报价为8.5-8.6元/公斤左右，仅国内的产量可达120吨，保证了底物的充足供应。技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如氨基酸、维生素生产车间)即可进行投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。对比目前国内生产主要依赖于化学拆分法，有50％的原料被拆分浪费掉，同时生成大量无用的副产物，并且产物的ee值偏低。故本发明具有较强的实用性和推广价值。sequencelisting<110>南京诺云生物科技有限公司<120>全细胞催化合成l-2-哌啶甲酸的方法<130>2016<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>1053<212>dna<213>arenimonasdonghaensis<400>1atgaccatgacccagctcaccacccaggacctgacccagatcgtcgcgacccacggcctg60ccgaccctgctcggccgcctggtggactacctggaggccgacttccggcgctgggaggac120ttcgacaagagcccgcgttcggcggcccactccccgggcggcgtgatcgaactgatgccg180gtcgccgataccaaggaatacagcttcaagtacgtcaacggccacccgggcaacaccaag240ctgggcctgtccaccgtggtggccttcggcgtgctcgccgacgtcgataccggcatgccg300accctgatcagcgaactgaccctgaccaccgcgctgcgcaccgccgccacctcggtgatg360gcggccaagctgctggcgcgcaaggattccaggaccatggcgctgatcggcaacggcgcc420cagagcgagttccaggcgctggccttccaccacctgctgggcatccaggaagtgcgtgtg480tacgacgtcgacccggccgccaccgacaagctggtgcgcaacctggccgcggccgcgccg540gaactgcgcgtggtgcgcagcaccggcgtcgcccaggccgtgcgcggcgccgacatcgtc600accaccgtcaccgcggacaaggccaatgccgacatcctgacgccggaaatgatcgagccg660ggcatgcacctcaacgccgtcggcggcgactgcccgggcaagaccgaactggccacggag720gtggtcgccaacgcctcggtgttcgtcgagttcgagccgcagtcgcgcatcgaaggcgag780gtgcagcagatgcccgccaactccccggtcaccgaactgtggcgcgtgctgaccatgcag840gccgccggccgccgcaacatcgccgaggtcaccctgttcgactcggtcggtttcgcgctg900gaggattattcggcgctgcgcctggtgcgcgattgcgccaaggaaatgggcctgggccgc960gaagccagcctcatccccgccctggccgacccgaagaacctgttcggcgagctggccgcg1020gcaccccaggccgcgcgcaagcaggcggcctga1053<210>2<211>350<212>prt<213>arenimonasdonghaensis<400>2metthrmetthrglnleuthrthrglnaspleuthrglnilevalala151015thrhisglyleuprothrleuleuglyargleuvalasptyrleuglu202530alaasppheargargtrpgluasppheasplysserproargserala354045alahisserproglyglyvalilegluleumetprovalalaaspthr505560lysglutyrserphelystyrvalasnglyhisproglyasnthrlys65707580leuglyleuserthrvalvalalapheglyvalleualaaspvalasp859095thrglymetprothrleuilesergluleuthrleuthrthralaleu100105110argthralaalathrservalmetalaalalysleuleualaarglys115120125aspserargthrmetalaleuileglyasnglyalaglnsergluphe130135140glnalaleualaphehishisleuleuglyileglngluvalargval145150155160tyraspvalaspproalaalathrasplysleuvalargasnleuala165170175alaalaalaprogluleuargvalvalargserthrglyvalalagln180185190alavalargglyalaaspilevalthrthrvalthralaasplysala195200205asnalaaspileleuthrproglumetilegluproglymethisleu210215220asnalavalglyglyaspcysproglylysthrgluleualathrglu225230235240valvalalaasnalaservalphevalgluphegluproglnserarg245250255ilegluglygluvalglnglnmetproalaasnserprovalthrglu260265270leutrpargvalleuthrmetglnalaalaglyargargasnileala275280285gluvalthrleupheaspservalglyphealaleugluasptyrser290295300alaleuargleuvalargaspcysalalysglumetglyleuglyarg305310315320glualaserleuileproalaleualaaspprolysasnleuphegly325330335gluleualaalaalaproglnalaalaarglysglnalaala340345350<210>3<211>1053<212>dna<213>人工序列<400>3atgaccatgacccagctgaccacccaggacctgacccagatcgttgctacccacggtctg60ccgaccctgctgggtcgtctggttgactacctggaagctgacttccgtcgttgggaagac120ttcgacaaatctccgcgttctgctgctcactctccgggtggtgttatcgaactgatgccg180gttgctgacaccaaagaatactctttcaaatacgttaacggtcacccgggtaacacca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