用免疫捕获双重rt-pcr同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法
【专利说明】用免疫捕获双重RT-PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法，更进一步涉及一种用免疫捕获双重RT-PCR技术同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法。
【背景技术】
[0002]百合病毒自20世纪40年代被发现以来，已成为危害百合种球生产和鲜切花品质的世界性病害；至今被发现侵染百合病毒有20多种，其中百合隐症病毒(LiIy symptomlessvirus，LSV)和百合斑驳病毒(Lily mottle virus，LMoV)是发生较普遍、危害严重的2种病毒。
[0003]LSV属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，是正义单链RNA病毒;LSV基因组为不分段RNA，全长为8394 bpj,端含帽子结构，3'端有polyA尾巴，共有6个开放阅读框(ORF)，编码4个蛋白，依5'至3'分别编码:RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，三基因连锁结构(TGBpl-3)，外壳蛋白(CP)和核酸结合蛋白；LSV的ORFl为RdRp，编码一个蛋白(220kD)，与病毒在植物体内复制有关;0RF2、0RF3和0RF4分别编码TGBpKTGBp2和TGBp3(25 kD，12 kD，7 kD)，是病毒在宿主体内运动的3个基因序列互相重叠的运动蛋白(MP);0RF5为CP，编码唯一参与病毒颗粒形态构成的蛋白质(32kD); 0RF6推测是核酸结合蛋白(16kD)，该蛋白含有一个CysZ-CysZ结构的锌指结构域。
[0004]LMoV属于马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，病毒粒子为弯曲线状且呈螺旋对称，大小(650?900)nm X (11?15)nm;病毒基因组为单分子正链RNA，约9.4kb，具有potyvirus属成员的典型基因组结构特征，包括一个Poly(A)尾巴，编码一个由3095个氨基酸组成的分子量为351.0 kDa的多聚蛋白；多聚蛋白通过自我剪切后形成外壳蛋白(CP)等10个不同大小的功能蛋白；LMoV CP亚基由274 aa组成，大小为30kDa左右，组装成外壳包裹病毒RNA。
[0005]防治百合病毒病较有效的手段是采用无毒繁殖材料或进行脱毒快繁，而这有赖于灵敏、快速和可靠的检测技术;基于病毒外壳蛋白抗原抗体反应的酶联免疫吸附法(ELISA)和基于病毒核酸的RT-PCR检测是目前较为广泛的检测病毒的方法;然而，ELISA检测一个反应体系只能完成一种病毒的检测，不能实现同步检测两种或多种病毒;RT-PCR虽然可以对两种或多种病毒实现同步检测，但是检测必须提取高质量的RNA，百合以及水仙、郁金香等球茎花卉种球富含多酚和多糖，提取的RNA中残留多酚和多糖会严重影响检测的灵敏性和特异性;免疫捕获RT-PCR或IC-RT-PCR结合了ELISA和RT-PCR另种方法的优点，具有较高的灵敏度，且更加简便高效，更重要的是不用提取RNA，检测成本低，不受多糖多酚的影响，非常适合百合、水仙、郁金香种球的病毒检测；
关于免疫捕获RT-PCR，目前已有用该方法检测多种植物病毒的相关报道，但是已建立的检测体系都仅能完成一种单一病毒的检测，至今未见用该方法同步检测两种或多种病毒的相关报道。
[0006]为了进一步提高检测效率，降低试验成本，本发明对现有的免疫捕获RT-PCR反应进行了改进，实现了用该方法同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒;具体是在免疫捕获RT-PCR反应的第一部分将通常单一的免疫反应改进为复合的免疫反应，S卩PCR管壁上同时捕获LSV和LMoV粒子;第二部分将第一链cDNA的合成改进为第一链cDNAs混合物的合成;第三部分将单一的PCR反应改进为了双重PCR检测。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供一种快速、准确、简便地用免疫捕获双重RT-PCR同时检测LSV和LMoV的方法。
[0008]整个检测方法省略了RNA提取过程，利用两种病毒抗体的特异性，迅速捕获两种目的病毒，从而高效快速的获得目的片段，为球茎类作物病毒的准确检测提供了快捷特异的方法，从而完善了免疫捕获RT-PCR技术。
[0009]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种同步检测LSV和LMoV的方法，其特征在于包括以下步骤:
①LSV和LMoV的多克隆抗体被包被在同一个PCR反应管中，高效特异捕获LSV和LMoV粒子；
②利用LSV和LMoV的特异性引物进行双重反转录聚合酶链式反应RT-PCR;
③琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。
[0010]上述进行双重RT-PCR的引物为LSV和LMoV的特异性引物。
[0011]采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤②获得的反应产物，LSV和LMoV的目标电泳条带分别出现在198和395碱基对(bp)处。
[0012]本发明是将免疫学检测技术和分子生物学检测技术有机的结合起来，吸附在PCR管壁上的LSV和LMoV多克隆抗体能特异性捕获检测样品中的LSV和LMo V粒子，起到浓缩和纯化病毒的作用，又利用PCR技术放大了检测的灵敏度，可用于感病样品低浓度病毒的检测；该发明省去了普通RT-PCR中提取总RNA的繁琐步骤，大大降低了检测成本;另一方面由于抗原与抗体的结合，提高了检测的特异性;利用免疫捕获PCR还可以避免球根类花卉种球中富含的多糖和多酚对RT-PCR的干扰，因而该技术尤其适合对百合种球鳞茎LSV和LMoV进行准确的检测，从而从种源上严格控制LSV和LMoV对百合产业的危害，减少经济损失。
【附图说明】
[0013]图1为本发明实施例百合隐症病毒和斑驳病毒的电泳检测图图中:
Mj 600bp Marker；
I，阴性对照；
2，LSV+LMoV感病组织；
3，阳性对照。
【具体实施方式】
[0014]本发明的实施例技术方案如下: 1.引物设计
根据LSV和LMoV的CP基因序列，设计了LSV和LMoV的特异性正向和反向引物，引物序列为:LSV-FC5’- TATGGGCTTCCAATACAAC-3’)/ LSV-RC5’-TATTCGGTTTCCAGGTTC-3’)，LMoV-F(5，- TGGCACCTCACCAAATGTA -3’)/ LMoV_R(5 ’-CATCATCTGCTGTATGCCTCT-3 ’)，扩增产物的大小分别为198bp和395bp;
2.免疫捕获
1)取10mg复合感染LSV+LMoV的组织，加ImLPBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；
2)用pH9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV和LSV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV和LSV两种抗体的终浓度分别为lyg/mL和10yg/mL;取200yL上述稀释的混合抗体加入PCR管，37°C孵育2h；
3)弃去包被液，用I3BST洗3次，每次3min;加入200yL感病组织粗提液，37°C孵育2h;
4)弃去抗原液，用I3BST洗3次，ddH20洗I次，短暂离心，吸去残液；
3.双重RT-PCR
1)在包被过的PCR管中加入浓度均为10ymol/L的LSV和LMoV下游引物R各2yL，8μLddifeO，混合后于70°C保温lOmin，之后迅速冰浴2 min；
2)双重RT:向上述PCR管中按以下体系加入试剂，混合均匀后，42 0C水浴Ih，70 °C保温15min，得到cDNAs混合物；
M-MLV buffer (5X)4yL
dNTP混合物(各lOmmol/L )2yL
RNase 抑制剂(30UAiL)0.68yL
M-MLV反转录酶(200U /VL)0.70yL
DEPC-H2O0.62yL
3)双重PCR:取一新的PCR管，按以下体系加入各试剂进行双重PCR:
上述cDNAs混合物2.0yL
1XPCR buffer2.5yL
MgCh(25 mmol/L)2.5yL
dNTP混合物(各2.5mmol/L )2.5yL
LSV-F(10ymol/L)0.5yL
LSV-R(10ymol/L)0.5yL
LMoV-F(10ymol/L)0.5yL
LMoV-R(10ymol/L)0.5yL
Taq DNA聚合酶(5U/yL)0.3yL
CldH2O13.2yL
双重PCR的反应条件为:94°C预变性4min，94°C变性308，50°(:?58°(:退火458，72°(:延伸lmin，扩增30?35个循环，72°C延伸7min，降至常温；
4.电泳检测
双重PCR反应结束后取1yL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在I X TBE缓冲液环境中，10V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统并观察并记录结果； 5.结果分析
根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV或LMoV:
若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV;
若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV;
若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV。
[0015]依据上述方法，经检测兰州地区食用百合和切花百合样品上的LSV和LMoV，电泳检测结果中如含有198bp的片段，说明样品中含有百合隐症病毒;如含有395bp的片段，说明样品中含有百合斑驳病毒。
【主权项】
1.一种用免疫捕获双重RT-PCR同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤: ①引物设计 根据LSV和LMoV的CP基因序列，设计LSV和LMoV的特异性正向和反向引物； ②免疫捕获 1)取10mg复合感染LSV+LMoV的组织，加ImLPBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液； 2)用pH9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV和LSV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV和LSV两种抗体的终浓度分别为lyg/mL和10yg/mL;取200yL上述稀释的混合抗体加入PCR管，37°C孵育2h； 3)弃去包被液，用PBST洗3次，每次3min;加入200yL感病组织粗提液，37°C孵育3h; 4)弃去抗原液，用PBST洗3次，ddH20洗I次，短暂离心，吸去残液； ③双重RT-PCR 1)在包被过的PCR管中分别加入10ymol/L的LSV特异性反向引物LSV-R 2yL、10 μmol/L的LMoV特异性反向引物LMoV-R 2yL以及ddH20 8yL，混合后于70°C保温lOmin，之后迅速冰浴2 min； 2)双重RT:向上述PCR管中分别加入5XM-MLV buffer 4yL、10mmol/L的dNTP混合物2μL、30U/yL的RNase抑制剂0.68yL、200U /yL 的M-MLV反转录酶0.70yL以及DEPC-H2O 0.62μL，混合均匀后，42 0C水浴Ih，70 0C保温15 min，得到cDNAs混合物； 3)双重PCR:取一新的PCR管，分别加入上述cDNAs混合物2.0yLUOX PCR buffer 2.5μL、25 mmol/L 的MgCl2 2.5yL、2.5mmol/L 的dNTP混合物2.5yL、10ymol/L 的LSV特异性正向和反向引物LSV-F和LSV-R各0.5口1^、1(^11101/1的LMoV特异性正向和反向引物LMoV-F和LMoV-R各0.5yL、5U/yL的Taq DNA聚合酶0.3yL以及ddH20 13.2yL，混合均匀后进行双重PCR;上述双重PCR的反应条件为:94°(:预变性4!1^11，94°(:变性308，50°(:?58°(:退火458，72°C延伸lmin，扩增30?35个循环，72 °C延伸7min，降至常温； ④双重PCR反应结束后取1yL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在IXTBE缓冲液环境中，10V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统并观察并记录结果； ⑤根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV或LMoV，若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV;若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV;若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV。2.根据权利要求1所述的同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法，所述LSV和LMoV分别为百合隐症病毒和百合斑驳病毒。
【专利摘要】本发明提供了一种免疫捕获双重RT?PCR同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV和LMoV的多克隆抗体特异性捕获LSV和LMoV粒子、利用LSV和LMoV的特异性引物进行双重反转录聚合酶链式反应RT?PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT?PCR结合，对现有的免疫捕获RT?PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT?PCR同步检测两种百合病毒LSV和LMoV，从而完善了免疫捕获RT?PCR技术。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/94, C12Q1/70
【公开号】CN105713994
【申请号】CN201610210126
【发明人】张玉宝, 王亚军, 谢忠奎, 王若愚, 杨果, 郭志鸿, 王乐
【申请人】中国科学院寒区旱区环境与工程研究所