一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法与流程

本发明涉及植物保护技术领域，具体涉及一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法。

背景技术：

小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici，Pst)引起的，是世界范围内小麦上的主要病害之一。该病害可以造成严重的小麦产量损失，一旦爆发至少导致小麦减产10％～30％，甚至造成绝产，是我国小麦安全生产的重大威胁。20世纪50年代以来，小麦条锈病在我国多次发生大流行，严重影响了小麦生产，在1950、1964、1990和2002年分别使我国小麦减产60、30、26和14亿kg。田间小麦条锈病的一个侵染过程一般包括接触期、侵入期、潜育期和发病期4个时期。着落于小麦叶片表面的小麦条锈病菌依靠夏孢子萌发产生芽管侵入小麦，侵染初期在小麦叶片内产生大量的菌丝，但是在叶片表面难以观察到病害症状，给病害的早期监测和预测预报造成了诸多困难和不便。

小麦条锈病菌的侵染和在寄主体内的扩展是一个动态量变的过程，一旦在叶片上产生条锈病菌夏孢子堆，该病害即可通过气流进行传播。若能做到小麦条锈病菌侵染的早期检测，特别是侵染菌量的定量检测，对于该病害的及早定点防治、预测预报和防治策略的制定具有重要的意义。特别地，若能实现越夏区、越冬区小麦条锈病侵染菌量的早期定量检测，对于小麦条锈病的宏观防控尤为重要。目前，通常通过田间发病情况调查对小麦条锈病进行监测。已有一些新的技术和方法被用于植物病害监测，尤其是高光谱遥感技术、分子生物学检测技术、热红外成像技术和近红外光谱技术等为植物病害的早期检测提供了更为快速简便的手段。通过检测小麦条锈病菌的存在，在小麦条锈病潜育期利用分子生物学技术可以准确定性检测到小麦叶片受到条锈病菌的侵染。利用高光谱遥感技术可以识别健康小麦和受到小麦条锈病菌侵染但尚未表现症状的小麦。已有研究报道利用热外红外成像技术和近红外光谱技术可以在病害症状出现之前检测到小麦条锈病菌的侵染。但小麦条锈病潜育期病原菌定量早期检测方面的研究相对较少。已有研究报道主要是利用real-time PCR方法实现潜育期小麦条锈病菌DNA的定量检测。

但是，利用田间发病情况调查方法监测小麦条锈病时费时费力，而且仅能对已发病田块进行调查统计，不能对潜育期条锈病叶片进行准确、快速识别；高光谱遥感技术所用仪器比较昂贵；热外红成像技术对所用仪器成像分辨率和温度分辨率要求较高；分子生物学技术检测过程复杂，对技术和仪器要求较高，且样品易受环境污染。目前虽然已有可在野外定量分析的仪器，但是仍需使用者掌握相应的分子生物学技能，且需要获取大量待检测样品，单纯利用分子生物学技术无法快速获得大面积的分子数据为病害预警提供依据。而且，基于高光谱遥感技术、热红外成像技术和分子生物学技术的病原菌潜伏侵染的检测方法在生产上较难大规模推广应用。因此，急需探求一种简单便捷、准确、快速的小麦条锈病早期检测方法。

近红外光谱技术(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)是一种准确、无损、稳定的分析技术，该技术分析过程简单、快速，是一种便于在线分析、成本较低的快速检测技术。目前，近红外光谱技术已广泛应用于农业、食品、石油、化工、医药等行业。利用近红外光谱技术可以进行小麦条锈病菌和叶锈病菌夏孢子的定性识别和定量测定。但是，现有技术中仅是利用近红外光谱技术可对小麦条锈病和叶锈病叶片进行早期定性识别，来实现小麦条锈病严重度分级评估，并定性识别受到小麦条锈病菌侵染尚未显症、处于潜育期的小麦。但目前尚无利用近红外光谱技术进行小麦条锈病潜育期菌量定量检测的研究报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺陷，本发明提出一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，以解决现有技术存在的不能简单便捷、准确、快速的对小麦条锈病进行早期定量检测的问题。

为此目的，本发明提供一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，该方法包括：

获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；

根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型。

其中，在所述获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息之前，所述方法还包括：

构建所述测定模型，具体包括：

对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱；

计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量；

根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型。

其中，所述对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱，包括：

采用积分球漫反射法采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，得到小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱。

其中，所述计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量，包括：

分别提取健康小麦叶片DNA、条锈病菌夏孢子DNA和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA，得到所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA的含量和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量；

根据所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA含量，采用多重荧光定量PCR技术，建立所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线；

根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量，利用所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA；

根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量。

其中，所述根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型，包括：

根据所述样品的近红外光谱和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型。

其中，所述根据所述样品的近红外光谱和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型，包括：

从所述小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱的波长点光谱特征中随机选取m个特征，并将主成分数设置为n，其中，m、n均为预设常数；

根据所述m个特征和所述设置为n的主成分数，依次构建k个QPLS测定模型，其中，k为预设常数；

将所述k个QPLS测定模型的预测值作为变量，构建SVR测定模型，从而获得kQPLS-SVR测定模型。

其中，所述方法还包括：

根据预设比例，将所述小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，分成训练集和测试集；

根据所述训练集和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型；

根据所述训练集、所述测试集的决定系数R²、校正标准差SEC、预测标准差SEP、平均相对误差AARD和相对预测偏差RPD，对所述kQPLS-SVR测定模型进行评价，得到评价结果；

根据所述评价结果，选择最优的kQPLS-SVR测定模型。

本发明提供的一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，通过利用近红外光谱技术采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，并利用多重荧光定量PCR技术，获得小麦条锈病潜育期叶片样品条锈病菌DNA的相对含量，并通过小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱和条锈病菌DNA的相对含量，建立小麦叶片的近红外光谱与条锈病菌DNA的相对含量的定量关系模型，并利用该定量关系模型对待检测小麦条锈病潜育期叶片内的条锈病菌量进行定量、快速、无损、准确的检测，并为其他植物病害的早期检测提供了参考。

附图说明

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些图获得其他的附图。

图1为本发明一实施例提供的小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法的流程图；

图2为本发明一实施例中的步骤S0的细分步骤的流程图；

图3为本发明一实施例中获取的小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱图；

图4为本发明一实施例中的条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线图；

图5为本发明一实施例中的健康小麦叶片DNA的标准曲线图；

图6为本发明一实施例中的小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量的逐日变化图；

图7为本发明一实施例中的小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量对数值的逐日变化图；

图8为本发明一实施例中的kQPLS-SVR测定模型的建模流程图。

具体实施方式

下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

如图1所示，本公开一实施例提供了一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，该方法包括如下步骤S0至S2：

S0、构建测定模型；

S1、获取待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息；

S2、根据所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息，应用所述测定模型确定与所述待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱信息对应的条锈病菌DNA相对含量；所述测定模型为表示近红外光谱信息和条锈病菌DNA相对含量之间的对应关系的模型。

本实施例提供的一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，通过利用近红外光谱技术采集待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱，并根据采集的待测小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱，应用测定模型，能快速、准确、定量的测量待测小麦条锈病潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量。

具体地，如图2所示，上述实施例中的步骤S0，具体包括如下细分步骤S01至S03：

S01、对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱；

S02、计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量；

具体地，小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量(Pst DNA)的计算方式为：

S03、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型。

需要说明的是，本实施例中是通过采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱、小麦条锈病潜育期叶片样品中的锈病菌DNA相对含量来构建条锈病菌DNA相对含量测定模型，但本实施例不限定具体的植物类型，本领域技术人员可利用本实施例的思想，对玉米、大豆、油菜等其他植物的病害进行检测。

本实施例提供的一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，通过利用近红外光谱技术采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，并利用多重荧光定量PCR技术，获得小麦条锈病潜育期叶片样品条锈病菌DNA的相对含量，并通过小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱和条锈病菌DNA的相对含量，建立小麦叶片的近红外光谱与条锈病菌DNA的相对含量的定量关系模型，并利用该定量关系模型对待检测小麦条锈病潜育期叶片内的条锈病菌量进行定量、快速、无损、准确的检测，并为其他植物病害的早期检测提供了参考。

需要说明的是，小麦条锈病潜育期叶片样品的获取步骤为：

(1)扩繁小麦条锈病菌：将铭贤169种子于室温下保湿催芽24h，选择饱满且发芽良好的种子均匀点播在直径为10cm的育苗盆中，每盆点播25粒(胚芽向上且朝向花盆中心)，然后转入环境参数为14/10h光暗交替、光照强度10000lux、温度11～13℃、相对湿度60％～70％的人工气候室内培育。当麦苗第一片心叶完全展开时，进行小麦条锈病菌的喷雾接种。取出液氮罐中保存的小麦条锈病菌生理小种条中33号(CYR33)夏孢子，在40～45℃温水中活化5min，然后4℃低温水化12h。将适量夏孢子与0.2％的吐温配制成孢子悬浮液。接种前先用手指蘸清水轻捋叶片以脱除表层蜡质，然后利用配制好的孢子悬浮液进行喷雾接种，接种后置于10℃的黑暗条件下保湿24h。最后置于上述条件下的人工气候室内进行培育，待接种后15d(天)发病小麦苗大量产孢，收集新鲜孢子。

(2)小麦条锈病潜育期叶片样品的获得：将3mg新鲜的CYR33夏孢子与0.2％的吐温配成0.15mg/mL的孢子悬浮液均匀喷雾接种于小麦幼苗，接种50盆供试验所用。接种后每隔24h采集60片大小长势一致的小麦叶片，每两片为一个采集光谱的样品，每天共30个样品。

上述实施例中的步骤S01：“对小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱进行采集，得到样品的近红外光谱”，具体为步骤S01`：

S01`、采用积分球漫反射法采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，得到样品的近红外光谱。

具体地，采集小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱的过程为：

将每组小麦条锈病潜育期叶片样品剪成碎末状，倒入内径为20mm的样品杯中，在室温下利用MPA傅里叶近红外光谱仪进行近红外光谱采集。采集光谱方式为积分球漫反射，每次采集30条光谱。光谱采集范围为4000-12000cm^-1，光谱分辨率为8cm^-1(每条光谱共包含2100个波长点)，扫描次数32次。整个采集过程直至夏孢子突破叶片表皮(接种后第10d)，此时潜育期结束，共获得300条近红外光谱，获得的近红外光谱曲线如图3所示。

需要说明的是，采集完光谱的每组小麦条锈病潜育期叶片样品装入2mL的研磨管中，编号后立刻放入-80℃保存，用于后续的小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的提取。

上述实施例中的步骤S02：“计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA相对含量”，具体包括图中未示出的如下细分步骤S021至S024：

S021、分别提取健康小麦叶片DNA、条锈病菌夏孢子DNA和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA，得到所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA的含量和所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量；

S022、根据所述健康小麦叶片DNA含量、所述条锈病菌夏孢子DNA含量，采用多重荧光定量PCR技术，建立所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线；

S023、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的含量，利用所述健康小麦叶片DNA的标准曲线、所述条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA；

S024、根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA，计算所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量。

具体地，上述实施例中的步骤S021中，以提取健康小麦叶片DNA的过程为例，说明健康小麦叶片DNA、条锈病菌夏孢子DNA和小麦条锈病潜育期叶片样品DNA的提取过程：

(1)向装有小麦叶片的2mL研磨管中各加入0.4g石英砂、一颗研磨珠、600μL含2％十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide，CTAB)的缓冲液。

其中，600μL含2％CTAB的缓冲液的制作过程为：2g CTAB和1g聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)，分别加入10μL 1M且pH＝8.0的三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris-HCl)、2μL 0.5M且pH＝8.0乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA)、28mL 5M氯化钠(Sodium chloride，NaCl)，然后定容至100mL，再进行高温高压灭菌，冷却后加100μL β-巯基乙醇。

(2)放入FastPrep-24研磨仪上以6.0m/s的研磨速度研磨40s，研磨两次，在研磨期间冰浴5min，然后放入65℃水浴锅中水浴1h，每隔15min轻摇混匀。

(3)取出研磨管，加入600μL体积比为24:1的氯仿/异戊醇，震荡成乳状，以12000r/min的离心速度离心10min。

(4)取上清液于规格为1.5mL的无菌离心管中，加入0.6倍体积-20℃的异丙醇，轻轻摇匀放入-20℃静置1h，以12000r/min的离心速度离心10min，去掉上清部分；

(5)加入500μL 70％的乙醇洗涤，轻轻晃动，以12000r/min的离心速度离心10min，去掉上清部分，晾干。

(6)加入50μL的无菌双蒸水使DNA溶解，然后存放在-20℃环境下备用。

多重荧光定量PCR测定小麦叶片DNA时，上下游引物TAG2315F和TAG2473R采用Sandberg等(Sandberg M,Lundberg L,Ferm M,Yman,I M.Real time PCR for the detection and discrimination of cereal contamination in gluten free foods[J].European Food Research and Technology,2003,217(4):344-349.)报道的根据小麦属醇溶蛋白基因(prolamin gene)设计的引物，探针TAG-Pr1由中国农业大学植物病害流行实验室潘阳等根据该序列设计(尚未发表)；多重荧光定量PCR测定条锈病菌DNA时，上下游引物Pst-F和Pst-R及探针Pst-P采用李勇等(李勇,谷医林,吴波明,金社林,曹世勤,王晓明,孙振宇,骆勇,马占鸿.小麦条锈病菌和白粉病菌多重TaqMan Real-time PCR方法的建立[J].植物病理学报,2015,45(2):205-210.)报道的基于ITS序列设计的引物和探针，如表1所示：

表1

上述实施例中的多重荧光定量PCR技术中采用的Real-time PCR反应体系为：20μL反应体系中包含Mg²⁺(25μM)3.20μL，脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)(2500μM)2.00μL，10×Buffer 2.00μL，Taq酶(5U/μL)0.60μL，引物(10μM的Pst-F、Pst-R、TAGF和TAGR)各0.30μL，探针(10μM的Pst-P和TAG-Pr1)各0.25μL，模板DNA 2.00μL，加入适量ddH2O，使得Real-time PCR反应体系达到20μL。

上述实施例中的多重荧光定量PCR技术中采用的Real-time PCR扩增反应程序为：在95℃条件下进行预变性3min，一个循环；在94℃条件下进行变性20s；在56℃时退火30s；在72℃条件下延伸30s，并在该条件下检测荧光信号，40个循环。

上述实施例中的步骤S022中的建立DNA的标准曲线的过程为：

(1)将在步骤S021中提取的已知浓度的条锈病菌DNA依次梯度稀释为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4ng/μL；已知浓度的小麦叶片DNA依次梯度稀释为10、1、10^-1、10^-2ng/μL，采用多重荧光定量PCR技术定量分析并记录Ct值。

(2)分别以条锈病菌夏孢子DNA和健康小麦叶片DNA浓度对数值为纵坐标，Ct值为横坐标，获得各自标准曲线及线性回归方程，如图4和图5所示。其中，条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线方程为y＝-0.3019x+7.4752(R²＝0.9926)，其中，y为条锈病菌DNA浓度常用对数(log10)值，x为Ct值；健康小麦叶片DNA的标准曲线方程为y＝-0.3008x+9.2660(R²＝0.9989)，其中，y为小麦叶片DNA浓度常用对数(log10)值，x为Ct值。

在本实施例中的条锈病菌夏孢子DNA和健康小麦叶片DNA的扩增效率分别为99.7％和100.1％，扩增效率均良好。

上述实施例中的步骤S023中的计算小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA和小麦叶片DNA的过程为：

利用上述实施例中的Real-time PCR反应体系对从至少一组小麦条锈病潜育期叶片样品中提取得到的DNA进行定量检测，并记录Ct值，利用上述实施例中建立的小麦叶片DNA的标准曲线、条锈病菌夏孢子DNA的标准曲线，计算样品中条锈病菌DNA和小麦叶片DNA的含量。

上述实施例中的步骤S024中的Pst DNA利用上述实施例中的Pst DNA的计算公式进行计算得到。得到的Pst DNA逐日变化图如图6所示，可以看出Pst DNA随着时间增加，呈指数增长。

建立Pst DNA逐日变化的拟合方程为y＝0.0096e^0.9287x，其中，y为叶片中小麦条锈病菌DNA相对含量，x为接种后天数，决定系数为R²＝0.8784。利用偏最小二乘法建立一个多元线性回归模型，但由于实测条锈病菌DNA相对含量范围为0.00385％～90.09％，前6天均在0.2％范围内，为使数据尽可能呈正态分布，对小麦叶片中条锈病菌DNA相对含量值进行对数转换处理。得到小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌相对含量对数值逐日变化图如图7所示，可以看出样品中的条锈病菌相对含量值经对数转换处理前后与天数(d)建立线性方程的决定系数R²分别为0.8784和0.8750，未发生较大变化，因此，在模型建立过程中采用如下公式对样品中的条锈病菌相对含量值转换后作为化学值和近红外光谱数据建立定量检测模型：

需要说明的是，在对小麦条锈病菌DNA相对含量进行对数转换处理之前，需要乘以10⁵以保证化学值为正。

上述实施例中的步骤S03：“根据所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量和所述样品的近红外光谱，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型”具体包括步骤S03`：

S03`、根据所述样品的近红外光谱和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型。

具体地，本实施例中的步骤S03`具体包括图中未示出的如下细分步骤S03`1至S03`3：

S03`1、从所述样品的近红外光谱的波长点光谱特征中随机选取m个特征，并将主成分数设置为n，其中，m、n均为预设常数；

S03`2、根据所述m个特征和所述设置为n的主成分数，依次构建k个QPLS测定模型；

S03`3、将所述k个QPLS测定模型的预测值作为变量，构建SVR测定模型，从而获得kQPLS-SVR测定模型。

具体地，本实施例中还包括对条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型的效果进行评价，包括图中未示出的步骤A1至A4：

A1、根据预设比例，将所述小麦条锈病潜育期叶片样品的近红外光谱，分成训练集和测试集；

A2、根据所述训练集和所述小麦条锈病潜育期叶片样品中的条锈病菌DNA的相对含量，组合采用定量偏最小二乘法QPLS和支持向量回归机SVR，构建kQPLS-SVR测定模型；

A3、根据所述训练集、所述测试集的决定系数R²、校正标准差SEC、预测标准差SEP、平均相对误差AARD和相对预测偏差SEP，对所述kQPLS-SVR测定模型进行评价，得到评价结果；

A4、根据所述评价结果，选择最优的kQPLS-SVR测定模型。

如图8所示，小麦条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型建立的算法流程为：首先，从2100个波长点光谱特征中随机选择m个特征，将主成分数设置为n，构建一个QPLS模型，按照这种方法共构建k个QPLS模型；其次，将上述所构建的k个QPLS模型预测值作为变量，用于构建SVR模型，从而获得kQPLS-SVR测定模型。在构建SVR模型时，以径向基函数(radial basis function，RBF)作为核函数建立SVR模型，利用网格搜索算法(grid search algorithm)，在2^-8～2⁸范围内以0.8为步距搜索优化惩罚参数C和核函数参数g，选择模型的均方误差(mean squared error，MSE)最小时的参数搜索结果作为模型最优参数。随机选择的波长点特征数m分别设置为700和1400，构建QPLS模型时的主成分数n分别设置为4、8和12，所构建的QPLS模型数k分别设置为5、10和15。以上计算过程均在软件MATLAB 7.8.0(R2009a)中进行。

需要说明的是，所建小麦条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型的建模效果利用训练集和测试集的决定系数R²、校正标准差SEC、预测标准差SEP、平均相对误差AARD和相对预测偏差RPD进行评价。其中，R²>0.5表明构建的测定模型可用于实际筛选，R²越接近1表明构建的测定模型的精确度越高；构建的测定模型的精确度也与RPD相关，其值为2.0～3.0是可用于实际筛选的最低要求，3.0～5.0表明模型具有可预测性，RPD>5.0表明测定模型较优；SEC、SEP和AARD越小，表明测定模型准确度越高。SEC、SECV、SEP、AARD值越小，说明测定模型的准确性和预测性越好。根据上述指标选择最优kQPLS-SVR测定模型。

本实施例提供的一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，通过组合采用QPLS和SVR，构建条锈病菌DNA相对含量的kQPLS-SVR测定模型。而且，通过利用近红外光谱训练集和测试集决定系数R²、校正标准差SEC、预测标准差SEP、平均相对误差AARD和相对预测偏差RPD对构建的条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型的效果进行评价，并根据评价结果选择最好的条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型，进一步地提高了条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型的准确度。

需要说明的是，本实施例中按照3:1的比例，将样品的近红外光谱分成训练集和测试集，但本实施例不限定具体的划分比例，本领域技术人员可根据实际情况，设定样品的近红外光谱的划分比例。

需要说明的是，本实施例中是根据采集的小麦条锈病潜育期叶片样品的原始近红外光谱和条锈病菌DNA的相对含量，构建条锈病菌DNA相对含量测定模型，所构建的测定模型的测量效果优于根据处理后的近红外光谱构建的测定模型。

下面对根据小麦条锈病潜育期叶片的原始近红外光谱构建的kQPLS-SVR测定模型和根据处理后的近红外光谱构建的kQPLS-SVR测定模型的效果进行比较如表2、表3、表4、表5所示：

其中，表2为根据小麦条锈病潜育期叶片的原始光谱所构建的kQPLS-SVR测定模型的效果数据：

表2

表3是采用附加散射校正方法(multiplication scatter correction，MSC)对原始近红外光谱进行预处理所构建的kQPLS-SVR测定模型的效果数据：

表3

表4是采用标准正态变量变换方法(standard normalized variate，SNV)对原始近红外光谱进行预处理所构建的kQPLS-SVR测定模型的效果数据：

表4

表5是采用矢量归一化方法(vector normalization,VN)对原始近红外光谱进行预处理所构建的kQPLS-SVR测定模型的效果数据：

表5

由上述表2、表3、表4和表5中的数据，可以看出采用原始近红外光谱以及MSC和SNV预处理近红外光谱所建kQPLS-SVR测定模型结果均较好。采用VN预处理近红外光谱所建kQPLS-SVR测定模型训练集和测试集的决定系数R²较小，且RPD值也较小。采用SNV预处理近红外光谱所建kQPLS-SVR测定模型选取主成分数为4，与其他方法相比较小，可能存在不充分拟合(Underfit)的情况，使模型预测准确度降低。采用MSC预处理近红外光谱所建kQPLS-SVR测定模型的测试集R²为0.8730，小于采用原始近红外光谱所建模型。因此，将采用原始近红外光谱所建kQPLS-SVR测定模型(选取特征数为700、主成分数为8、建立5个QPLS模型)作为最优kQPLS-SVR测定模型。

本实施例提供的一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，通过组合采用QPLS和SVR，构建获得的条锈病菌DNA相对含量的最优kQPLS-SVR测定模型，对小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量的测量效果优于其他的测定模型的测量效果。由于选定的最优kQPLS-SVR测定模型使用的是原始近红外光谱数据，因此，基于原始近红外光谱数据，分别利用QPLS和SVR方法建立小麦条锈病菌DNA相对含量测定模型，模型结果列于表6。

表6

需要说明的是，分别利用QPLS和SVR建立小麦条锈病菌DNA相对含量测定模型，并与利用kQPLS-SVR方法的建立的最优kQPLS-SVR测定模型进行比较，具体地，利用决定系数R²、校正标准差SEC、预测标准差SEP、平均相对误差AARD和相对预测偏差RPD对最优kQPLS-SVR测定模型、QPLS测定模型和SVR测定模型等三种测定模型的效果进行评价。由表6中的数据可以看出，本实施例中构建的最优kQPLS-SVR测定模型(采用原始近红外光谱、选取特征数为700、主成分数为8、建立5个QPLS模型)，对小麦条锈病潜育期叶片内条锈病菌DNA的相对含量的测量效果优于QPLS测定模型和SVR测定模型的测量效果。因此，选择kQPLS-SVR测定模型作为小麦条锈病潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量测定模型。

需要说明的是，利用QPLS和SVR方法建立小麦条锈病菌DNA相对含量测定模型时，所使用主成分数是通过计算预测残差平方和PRESS(prediction residual error sum of square,Press)确定的。一般地，PRESS值最小时，可能对应主成分数最佳，但也有可能造成过度拟合。故采用F统计法确定最佳主成分数，F统计法如下(f*为最小PRESS值对应的主成分数)：F(f)＝PRESS(f)/PRESS(f*)，最佳的f比f*小，尽可能小且满足F(f)<Fα,m,m(α＝0.25,m为自由度)条件(陆婉珍，袁洪福，徐广通，强冬梅.现代近红外光谱分析技术[M].北京:中国石化出版社.2000)。

本实施例提供的一种小麦叶片内条锈病菌DNA相对含量测量方法，通过采用小麦条锈病潜育期叶片样品的原始近红外光谱信息和条锈病菌DNA的相对含量，构建条锈病菌DNA相对含量kQPLS-SVR测定模型，该模型的效果较好，进一步地，测量得到的结果的准确度较高。

本发明实现了根据采集获得的小麦条锈病潜育期叶片的近红外光谱，利用建立的小麦条锈病潜育期叶片内条锈病菌DNA相对含量测定模型，可进行小麦条锈病潜育期侵染菌量的定量快速自动检测，从而实现了小麦条锈病的定量、无损、快速、自动早期检测，也可利用本发明建立其他病害的潜育期侵染菌量测定模型，提供了一种定量、无损、快速病害早期检测技术，实现病害侵染菌量和病害的定量快速早期测定，便于尽早掌握田间病害发生情况和菌量，为抑制菌量积累、减少病原传播体数量、病害的及早定点防治、预测预警和宏观防控策略的制定提供依据，可为病害治理中减药增效提供强力支撑。本发明亦为研发便携式植物病害定量检测近红外光谱仪和植物病害定量检测传感器提供了依据。

本领域普通技术人员可以理解：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明权利要求所限定的范围。