一种mPEG-b-PCL二嵌段高分子聚合物及其制备应用的制作方法

本发明涉及一种聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物，特别涉及聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物的制备及其应用。
背景技术：
：水难溶性药物因其在水中溶解度小使得药物的临床应用受到限制。将水难溶性药物通过某些载体包裹，是对水难溶性药物进行增溶的一种行之有效的方法。两性分子共聚物的大小、稳定性、通用性以及生物相容性都十分的优秀，这使得它们在药物传送载体和环境保护领域具有十分巨大的潜力。在众多的两性聚合物中，尤其以具有生物相容性和生物降解性的共聚物，如PLA-PEG、PCL-PEG、PCL-PLA-PEG，表现最为突出和抢眼。众所周知，两性分子的共聚物在选择性的溶剂中能够自组装形成一个疏水核和亲水壳的胶团，这样的胶团大小通常小于200nm，具有部分纳米材料的特性。两亲性二嵌段高分子聚合物的特点当外面亲水壳达到最大生物溶解度时，并使胶团在没有额外稳定剂条件下在亲水性溶剂中保持溶解时，疏水核相互作用，从而装载一些难溶于水的药物。作为疏水药物的载体，二嵌段聚合物的胶体被广泛研究。目前，研究胶团论文和资料主要关注于聚合物的制备、表征、药物与载体之间的作用以及药物的释放特点。事实上，迄今为止对于共聚胶团的降解的研究依然非常有限。有研究表明PCL-PEG薄膜在体内和体外环境下会表现出极其不同的水解降解特性，并表明PCL-PEG薄膜水解降解过程，可能受到PEG分子含量、环境温度、酸度以及碱度的影响。研究发现PCL-PEG胶团的降解方式和散体材料的降解方式是不同的，可能具有多方面的潜在价值。技术实现要素：本发明的目的在于针对现有技术中关于二嵌段聚合物的研究不够充分，所存在的二嵌段聚合物的潜在价值开发不完全，提供一种新型的mPEG-b-PCL二嵌段高分子聚合物。同时，本发明提供制备这种二嵌段高分子化合物的方法，并对这种二嵌段高分子化合物的性质进行 了表征研究，揭示了这种高分子化合物的潜在药用价值。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：一种聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物，它的组成结构是mPEG-b-PCL，其中mPEG和PCL摩尔比例是1：0.1～1：10。本发明的聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物具有良好的载药潜力，能够负载药物在生物体内稳定运转至目标的靶点，实现难溶性药物的分散应用。而且，该二嵌段聚合物对于人体肿瘤细胞或癌细胞产生粘附抑制作用，使得肿瘤患者、癌症患者的化疗治疗效果得到显著的提升。本发明PEG-b-PCL二嵌段共聚物水解发生在聚己内酯的酯键，使得化合物的分子量分布、结晶性等发生了较大的变化。在PEG-b-PCL二嵌段共聚物的降解过程中，聚合物的分子链段的水解断裂机理完全不同于一般的聚乙二醇化合物，使得化合物的稳定性、载药能力都有极大的提升。进一步，优选mPEG和PCL质量比例为1：1～1：6。当两者的比例符合以上范围时，二嵌段聚合物能够表现出更加适宜的稳定性、降解性能，使得药物的稳定性和释放速度更佳，更好的促进药物的疗效。当两者的比例为1：1时，二嵌段聚合物对于细胞的聚集态具有良好的促进作用，同时对于肿瘤细胞、癌细胞的粘附状态具有一定的抑制作用，能够提高化疗的效果。本发明同时还提供一种制备所述的二嵌段聚合物的方法，包括以下步骤：(1)取聚乙二醇，溶于甲苯，在120-150℃下脱水1-3小时，优选在125-145℃脱水1.5-3小时。(2)加入ε-环己内酯和辛酸亚锡，氮气保护，130-160℃反应8-16小时。优选的，在135-155℃反应8-15小时。(3)反应结束后，冷却至室温，加入甲基叔丁基醚，超声5-30分钟，冰浴下，冷却重结晶10-30分钟，抽滤，收集滤渣，真空干燥，既得目标产物。通过以上方法合成得到的二嵌段聚合物即为本发明的目标产物，具有良好的稳定性和结晶性能，能够有效地应用于难溶性药物的载药。而且，以上制备方法简单易行，反应效率高，基本无杂质生成，产物易分离易纯化。上述的聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物在制备治疗癌症或肿瘤药物中的应用。本发明的聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物能够有效地抑制癌细胞、肿瘤细胞的粘附，使其保持聚集状态，防止癌细胞或肿瘤细胞的扩散，提高治疗药物对于相关疾病的治疗效果。进一步，所述的聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。研究显示本发明的二嵌段聚合物对于乳腺癌细胞系MCF-7能够起到良好的抑制聚集作用。进一步，所述的聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物作为载药材料在治疗癌症或肿瘤的药物中的应用。进一步，所述的氮气保护使用的氮气纯度为99.99％以上的高纯氮。与现有技术相比，本发明的有益效果：1.本发明的聚乙二醇交联聚己内酯的二嵌段聚合物能够有效的实现对于难溶性药物的负载、转运，并确保难溶性药物的分散。2.本发明的二嵌段聚合物对于人体肿瘤细胞或癌细胞产生粘附抑制作用，使得肿瘤患者、癌症患者的化疗治疗效果得到显著的提升。3.本发明提供的制备方法简单易行，反应效率高，基本无杂质生成，产物易分离易纯化，可以推广应用与各种药物制剂。附图说明：图1是mPEG-b-PCL二嵌段共聚物的1HNMR谱图。图2是mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)二嵌段共聚物的1HNMR谱图。图3是mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：4)二嵌段共聚物的1HNMR谱图。图4是mPEG-b-PCL(MMPEG:MPCL＝1:6)二嵌段共聚物的1HNMR谱图。图5是浓度为10mg/mL的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)二嵌段共聚物在人乳腺癌细胞系MCF-7培养基上连续培养一段时间内的显微照片记录。图6是浓度为1mg/mL的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)二嵌段共聚物在人乳腺癌细胞系MCF-7培养基上连续培养一段时间内的显微照片记录。图7是浓度为0.1mg/mL的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)二嵌段共聚物在人乳腺癌细胞系MCF-7培养基上连续培养一段时间内的显微照片记录。具体实施方式试剂：聚乙二醇(mPEG，Mn＝2000，Aldrich，USA)，ε-环己内酯(ε-CL,密度1.07g/cm3AlfaAesar，USA)，辛酸亚锡(Sn(Oct)2，Sigma，USA)，甲苯，甲基叔丁基醚，人乳腺癌细胞MCF-7(ATCC)、DMEM细胞培养基(HyClone)、0.25％胰蛋白酶(HyClone)、胎牛血清(四季青)、青霉素-链霉素双抗(HyClone)、生理盐水、PBS(磷酸盐缓冲液)。仪器：甲苯共沸除水装置，油浴锅，三颈烧瓶，冷凝管，玻璃塞，抽真空装置，氮气气球，注射器，超声装置，试剂枪，冷却装置，抽滤装置，试剂管，真空干燥器，标签，记号笔，分析天平，核磁共振，96孔板、细胞培养皿、15mL离心管、EVOSFLAuto成像系统。下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明中为特别说明的百分比一般是重量百分比。实施例1合成mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)实验投料表格：使用分析天平准确称取聚乙二醇1.000g，加入到三颈烧瓶中，加入10mL甲苯，在油浴锅138℃条件下共沸除水2小时。冷却后0.94mLε-环己内酯，加入适量辛酸亚锡催化剂，加入一个磁力搅拌子，再加入10mL甲苯，将三颈烧瓶的三个口分别用玻璃塞，冷凝管(冷凝管上端套一个充满氮气的小气球)，抽真空接头封住，连接抽真空装置，打开冷凝管上端活塞，打开抽真空接头活塞，打开抽真空装置进行抽真空5分钟，关闭抽真空接头活塞，关闭冷凝管上端活塞，关闭抽真空装置，断开三颈瓶与抽真空装置连接，用一个充满氮气的气球替换之前那个气球，打开冷凝管上端活塞。将此三颈瓶固定在铁架台上，置于油浴锅中，温度调节至138℃，磁力搅拌转速调节至中速，反应12小时，反应过程中如果溶剂减少可以适当加入甲苯。反应结束后，冷却至室温，加入10mL甲基叔丁基醚，超声10分钟，冰浴冷却重结晶20分钟，然后进行抽滤，收集滤渣，放入真空干燥器中，干燥1小时，将产物装入塑料管，称重，贴上相应标签。图1是标准的聚乙二醇-聚己内酯二嵌段共聚物的1HNMR谱图。化学位移为3.65×10-6的峰归属于聚乙二醇链段中亚甲基a的质子峰，2.3×10-6的三重峰归属于c处的质子，4.1×10-6 的三重峰归属于f处的质子，1.6×10-6的多重峰归属于d处的质子，而位于最高场1.4×10-6的多重峰归属于e处的质子峰。将所得的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品装入核磁管中大概3微米，用注射器加入适量的氘代氯仿，用塞子塞住核磁管。用记号笔标记mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)。进行核磁共振。图2是mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)二嵌段共聚物的1HNMR谱图。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.98(t，J＝6.5Hz，7H)，3.46–3.30(m，2H)，3.32(s，5H)，3.24(s，1H)，2.27(t，J＝7.4Hz，7H)，1.61–1.45(m，15H)，1.29(qd，J＝9.6，9.0，6.0Hz，9H)，0.89–0.77(m，2H).核磁分析结果表明合成产物是目标的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)二嵌段聚合物。MmPEG：MPCL比例MmPEG(g)VPCL(mL)实施例11：11.0000.94实施例21：41.0003.74实施例31：61.0005.61实施例2合成mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：4)使用分析天平准确称取聚乙二醇1.000g，加入到三颈烧瓶中，加入10mL甲苯，在油浴锅140℃条件下共沸除水2小时。冷却后3.74mLε-环己内酯，加入适量辛酸亚锡催化剂，加入磁力搅拌子，再加入10mL甲苯，将三颈烧瓶的三个口分别用玻璃塞，冷凝管(冷凝管上端套一个充满氮气的小气球)，抽真空接头封住，连接抽真空装置，打开冷凝管上端活塞，打开抽真空接头活塞，打开抽真空装置进行抽真空5分钟，关闭抽真空接头活塞，关闭冷凝管上端活塞，关闭抽真空装置，断开三颈瓶与抽真空装置连接，用一个充满氮气的气球替换之前那个气球，打开冷凝管上端活塞。将此三颈瓶固定在铁架台上，置于油浴锅中，温度调节至140℃。磁力搅拌转速调节至中速，反应12小时，反应过程中如果溶剂减少可以适当加入甲苯。反应结束后冷却至室温，加入10mL甲基叔丁基醚，超声10分钟，在冰浴下冷却重结晶20分钟，然后进行抽滤，将滤渣装入器皿，放入真空干燥器中干燥1小时，将产物装入塑料管，称重，贴上相应标签。将所得的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：4)样品装入核磁管中大概3微米，用注射器加入适量的氘代氯仿，用塞子塞住核磁管。用记号笔标记mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：4)。进行核磁共振。图3是mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：4)二嵌段共聚物的1HNMR谱图。mPEG-b-PCL(1:4)1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ3.98(t，J＝6.5Hz，4H)，3.51(s，20H)，2.27(t，J＝7.3Hz，4H)，1.54(h，J＝7.5Hz，8H)，1.36–1.23(m，1H)，1.29(s，4H).核磁分析结果表明合成产物是目标mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：4)二嵌段聚合物。实施例3合成mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1:6)使用分析天平准确称取聚乙二醇1.000g，加入到三颈烧瓶中，加入10mL甲苯，在油浴锅140℃条件下共沸除水2小时。冷却后5.61mLε-环己内酯，加入适量辛酸亚锡催化剂，加入磁力搅拌子，再加入10mL甲苯，将三颈烧瓶的三个口分别用玻璃塞，冷凝管(冷凝管上端套一个充满氮气的小气球)，抽真空接头封住，连接抽真空装置，打开冷凝管上端活塞，打开抽真空接头活塞，打开抽真空装置进行抽真空5分钟，关闭抽真空接头活塞，关闭冷凝管上端活塞，关闭抽真空装置，断开三颈瓶与抽真空装置连接，用一个充满氮气的气球替换之前那个气球，打开冷凝管上端活塞。将此三颈瓶固定在铁架台上，置于油浴锅中，温度调节至140℃，磁力搅拌转速调节至中速，反应12小时，反应过程中如果溶剂减少可以适当加入甲苯.反应结束后冷却至室温，加入10mL甲基叔丁基醚，超声10分钟，在冰浴下冷却重结晶20分钟，然后进行抽滤，将滤渣装入器皿，放入真空干燥器中干燥1小时，将产物装入塑料管，称重，贴上相应标签。将所得的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：6)样品装入核磁管中大概3微米，用注射器加入适量的氘代氯仿，用塞子塞住核磁管。用记号笔标记mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：6)。进行核磁共振。图4是mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：6)二嵌段共聚物的1HNMR谱图。mPEG-b-PCL(1:6)1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.98(t,J＝6.5Hz,2H),3.51(s,10H),2.33–2.23(m,3H),1.52(dh,J＝14.0,7.2Hz,5H),1.28(dq,J＝13.4,7.5,6.8Hz,2H),0.89–0.79(m,1H).核磁分析结果表明合成产物是目标的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：6)二嵌段聚合物。图2-4分别与图1进行对比，核磁图谱中出峰位置和磁积分都与图1一致，说明实施例1-3合成的三种不同聚己内酯含量比例(MMPEG:MPCL＝1:1，MMPEG:MPCL＝1:4，MMPEG:MPCL＝1:6)的聚乙二醇-聚己内酯两嵌段共聚物都是预期的目标产物，而且产物的纯净很高，与预期的合成目的相一致。试验例1mPEG-b-PCL二嵌段共聚物的细胞实验1.ATCC购买的人乳腺癌细胞系MCF-7迅速用37℃水浴融化后用DMEM培养基洗一次，1200rpm离心3min，弃上清液，加入新鲜的培养基，将细胞吹散成细胞悬液，转移到加有新鲜培养基的培养皿中在37℃、5％CO2条件孵箱中进行培养。2.将实验准备的1:1比例的mPEG-b-PCL材料用配制成0.1mg/mL、1mg/mL和10mg/mL三个浓度的溶液，(配制方法：使用分析天平准确称取mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品10mg，加入1.5mL的样品管，使用吸液枪吸取去离子水，滴入样品管，定容至1mL刻度线，将此样品管进行超声大约20分钟，然后在40℃水浴条件下加热大约5分钟，样品完全溶解，即得到C1＝10mg/mLmPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品溶液；使用吸液枪吸取C1＝10mg/mLmPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品溶液0.1mL，加入另一同样大小的样品管，吸液枪吸取去离子水，定容至1mL刻度线，即得到C2＝1mg/mLmPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品溶液；使用吸液枪吸取C2＝1mg/mLmPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品溶液0.1mL，加入另一同样大小的样品管，吸液枪吸取去离子水，定容至1mL刻度线，即得到C3＝0.1mg/mLmPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)样品溶液。然后分别将3个浓度的溶液按50μL/孔加入到96孔板中，每个浓度设置3个复孔。待溶液自然挥发后每孔分别用生理盐水100μL洗3次，再次自然晾干备用。3.细胞长至铺满皿底时吸去旧的培养基，用2mLPBS淌洗一次，再加入2mL0.25％胰蛋白酶进行消化，待细胞失去原有形态变圆时加入完全培养基终止消化，收集细胞，1200rpm离心3min，弃上清液，用新培养基吹打细胞成单细胞悬液，通过血细胞计数板计数调整细胞浓度为105个/mL，按100μL/孔密度接种到96孔板上，继续在孵箱进行培养，每隔24h在显微镜下观察并进行拍照。细胞在培养基上的传播系数S＝Wcs-Wcc(Wcs:表示细胞与培养基之间的表面能，Wcc：表示细胞与细胞之间的表面能)。当Wcs<Wcc(S<0)时，细胞倾向于聚集状态；当Wcs>Wcc(S>0)时，细胞倾向于粘附状态。在体内细胞与细胞之间的表面能减少，就会使癌细胞脱离原来的肿瘤，这就导致了癌细胞的转移与扩散。虽然癌细胞与癌细胞之间的表面能很大，但是癌细胞聚集体表面的细胞活性很强，致使它们能够脱离原来的肿瘤，从而导致癌细胞的转移与扩散。三种浓度的共聚物溶液与人乳腺癌细胞系MCF-7实验，每隔24小时拍一次，一共拍4次，拍照结果如图5-7所示。其中，图5-7分别对应于浓度为10mg/mL(图5)、1mg/mL(图6)、0.1mg/mL(图7)的mPEG-b-PCL(MmPEG：MPCL＝1：1)嵌段共聚物在人乳腺癌细胞系MCF-7培养基上连续培养一段时间内的显微照片记录。从图5-7可见，三种不同浓度样品溶液对人乳腺癌细胞系MCF-7的影响大致趋势是：第一天，细胞没有出现聚集，第二天细胞逐渐聚集，第三天细胞聚集达到最大值，第四天细胞开始凋亡。表明三种不同浓度的嵌段聚合物，在最初的一段时间内均能够有效的抑制细胞的粘附。但是，各种浓度又有一定的差别，C2＝1mg/mL样品溶液的效果最理想，C1＝10mg/mL，C3＝0.1mg/mL的样品溶液的效果不太理想。三种浓度的样品溶液对应的细胞在第四天都出现凋亡，原因就是培养皿的营养成分在第四天被消耗完了，细胞无营养继续生长，于是开始了凋亡。结果表明，本发明制备的自组装mPEG-b-PCL能够有效抑制癌细胞的粘附，相应的mPEG-b-PCL胶束是新颖的、可靠的、安全的，能够做为难溶于水药物的载体，并在癌症的靶向药物载体中起到良好的载体作用和辅助治疗作用，具有巨大的临床应用价值。当前第1页1 2 3