一种高耐药性Huh-7-DN肝癌细胞株的制作方法

本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有高耐药性的人肝癌细胞株huh-7-dn及其建立方法。

背景技术：

资料显示，肝细胞癌（hcc）是第三致命的和第五常见的恶性肿瘤，全球每年有超过70万的新发病例。有研究报道，慢性乙型肝炎病毒（hbv）、丙型肝炎病毒（hcv）感染、非酒精性脂肪性肝炎及其他肝病是hcc的发病基础。据调查，我国是hcc的高发地区，每年约有30万的新发病例，占全球新发病例的一半。手术切除和肝移植是目前治疗hcc的有效手段，但是，实践显示，大部分患者发现hcc时已处于中晚期，已无手术治疗的指征；由于hcc对传统的细胞毒性化疗药物相对耐药，因此，作为备选的非手术疗法——化疗的疗效和5年生存率均不理想，其中仅有raf-1激酶抑制剂，索拉非尼能延长进展期hcc患者的中位生存期数月；但原发和继发耐药及远处转移，仍是造成进展期患者高死亡率的主要原因。hcc的高发病率和高死亡率不仅使患者承受极大的痛苦，同时治疗所产生的费用也给患者家庭带来极重的经济负担，因此研究hcc化疗耐药的机制，寻找改善化疗敏感性的治疗途径显得尤为重要，而建立稳定、可靠的高耐药性肝癌细胞株则是当务之急。

现有公开的可用于研究肝癌细胞耐药性的细胞株包括有hep3b、huh-7、hepg2、hle和hlf等，本发明的前期研究发现，根据表面分子标记cd133和epcam的表达，可将人肝癌细胞株分成双阳性和双阴性两种亚群，其中，cd133和epcam双阴性表达的肝癌细胞中豪猪信号通路异常活化。与低豪猪信号活性的肝癌细胞相比，高豪猪信号活性的肝癌细胞对于顺铂、多柔比星和索拉非尼相对耐药；研究还公开了通过检测人肝癌细胞株hep3b、hepg2、huh-7、hle、hlf和skhep1中cd133和epcam的表达谱，发现huh-7细胞中cd133和epcam双阳性和双阴性亚群的数量相近，而hepg2、hle、hlf和skhep1细胞中双阴性亚群占70%以上。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种具有高耐药性的人肝癌细胞株，尤其是一种高耐药性huh-7-dn肝癌细胞株及其建立方法。

与本发明有关的参考文献有：

[1]el-seraghb,rudolphkl.hepatocellularcarcinoma:epidemiologyandmolecularcarcinogenesis[j].gastroenterology2007;132:2557-76.

[2]tanakas,ariis.molecularlytargetedtherapyforhepatocellularcarcinoma[j].cancersci2009;100:1-8.

[3]chenx,lingalas,khoobyaris,noltaj,zernma,wuj.epithelialmesenchymaltransitionandhedgehogsignalingactivationareassociatedwithchemoresistanceandinvasionofhepatomasubpopulations[j].jhepatol2011;55:838-45.。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高耐药性人肝癌细胞株，尤其是一种高耐药性huh-7-dn肝癌细胞株及其建立方法。本发明的高耐药性人肝癌细胞株有助于肝癌耐药机理及相关药物的研究。

本发明采用日本细胞库（jcrb）的人肝癌细胞株huh-7（jcrb编号：jcrb0403，由一位57岁日本男性肝癌患者分离而得）为亲本细胞，通过对huh-7细胞株标记cd133-apc和epcam-fitc荧光抗体后进行流式细胞分选，分选得cd133^-/epcam^-huh-7细胞亚群，对其进行分离培养和再次流式分选，分离得到稳定表达cd133^-/epcam^-表面分子标记、高耐药性的人肝癌细胞株huh-7-dn。该细胞株已于2016年3月21日保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）,北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmccno.12253，分类命名：人肝癌细胞株huh-7dn（huh-7doublenegative）。

本发明所述的细胞株具有以下生物学特性：

1.流式实验鉴定huh-7-dn细胞经过多次传代仍能稳定保持cd133^-/epcam^-表面分子标记；

2.该细胞株呈现上皮细胞间质转化（emt）特征：免疫荧光染色和定量rt-pcr实验证实，huh-7-dn细胞株高表达间质标记——波形蛋白以及emt转录因子twist；

3.免疫荧光染色和定量rt-pcr实验证实，huh-7-dn细胞株高表达豪猪信号通路活性，其豪猪信号通路转录因子gli-1/2分别是其亲代huh-7细胞的6.87倍和61.04倍；

4.药物实验证实该细胞株呈现高耐药性的特点：索拉非尼、伊曲康唑和lde225这3种结构无关的化疗药物均不能抑制huh-7-dn细胞增殖，且huh-7-dn细胞高表达多药耐药相关abcc1转运蛋白。

本发明所述的具有高耐药性的人肝癌细胞株huh-7-dn可作为人肝细胞癌多药耐药的研究细胞模型，其具有独特的分子生物学特性、异质性、多态性，在揭示人肝细胞癌的耐药机制和化疗药物筛选的应用中有着广阔的前景。

附图说明

图1为huh-7-dn细胞在40倍倒置显微镜下形态。

图2为huh-7-dn细胞在400倍激光共聚焦显微镜下波形蛋白染色阳性。

图3为huh-7-dn细胞的豪猪信号通路转录因子gli-1/2的荧光定量pcr结果，其中显示，huh-7-dn细胞较亲代huh-7以及分选所得cd133+/epcam+和cd133-/epcam-huh-7细胞高表达豪猪信号通路转录因子gli-1/2mrna。

图4为huh-7-dn细胞对索拉非尼的药敏实验结果，

其中显示，索拉非尼10μm对huh-7-dn细胞增殖无任何抑制作用，且其对huh-7-dn细胞的毒性显著低于cd133+/epcam+和cd133-/epcam-细胞亚群。

图5为huh-7-dn细胞的多药耐药相关abcc1转运蛋白的荧光定量pcr结果，其中显示，huh-7-dn细胞较亲代huh-7以及分选所得cd133+/epcam+和cd133-/epcam-huh-7细胞高表达多药耐药相关abcc1mrna。

具体实施方式

实施例1高耐药性肝癌细胞huh-7-dn的筛选和建系

本发明所涉及的细胞均培养于含10%胎牛血清（fbs）的dmem高糖细胞培养基中，培养温度为37°c，气体环境为5%co2/95%空气，湿度为饱和湿度，传代时，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，按1:3的比例传代，

1.高耐药性肝癌细胞huh-7-dn的首轮筛选

①将处于生长对数期的huh-7细胞用0.05%的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液；

②220g离心5分钟后予pbs重悬浮细胞，加入20%体积兔血清室温孵育30分钟，阻断非特异性结合反应；

③取200μl细胞悬液作为空白对照，剩余细胞悬液按1：100体积加入apc标记的抗人cd133/2(293c3)和fitc标记的抗人epcam(cloneber-ep4)单克隆抗体，避光室温孵育45分钟；

④予10%fbsdmem培养基重悬浮细胞后，bdfacscalibur流式细胞分选仪根据细胞所标记的cd133-apc和epcam-fitc对huh-7细胞进行分选，得到cd133^-/epcam^-细胞亚群；

⑤将分选所得cd133^-/epcam^-细胞亚群于t2510%fbsdmem继续培养。；

⑥将分选所得的cd133-/epcam-细胞培养后，再次标记cd133-apc和epcam-fitc进行流式细胞鉴定；

⑦将分选得到、经过流式鉴定的始终保持cd133^-/epcam^-表面分子标记的细胞命名为huh-7-dn（doublenegative）细胞。

实施例2药物试验（mtt实验和ldh释放实验）

1.细胞增殖抑制（mtt）实验

①将分选所得cd133⁺/epcam⁺、cd133^-/epcam^-和huh-7-dn细胞以1*10⁴/孔密度接种96孔板；

②24小时待细胞贴壁后予索拉非尼10μm干预24小时，每个药物浓度均设置3复孔；

③24小时后每孔按体积比100：1加入噻唑蓝（mtt），37℃避光继续培养4小时；

④加入formazan溶解液孵育4小时充分溶解细胞内结晶。flexstation3多功能酶标仪工作站于570nm检测各孔的吸光度；

⑤结果显示：索拉非尼10μm干预24小时可显著抑制cd133⁺/epcam⁺和cd133^-/epcam^-细胞增殖；但对huh-7-dn细胞增殖无任何抑制作用。

2.乳酸脱氢酶（ldh）释放实验

①将分选所得cd133⁺/epcam⁺、cd133^-/epcam^-和huh-7-dn细胞悬浮于1%fbs培养基，以1*10⁴/孔密度接种96孔板；

②24小时待细胞贴壁后予含终浓度为索拉非尼10μm的200μl培养基干预；

③同时设立backgroundcontrol、lowcontrol和highcontrol组。backgroundcontrol组只有培养基，不含细胞；lowcontrol组为阴性对照组，包含细胞和培养基，无药物干预；highcontol为阳性对照组，予含有终浓度为1%triton-x培养基干预细胞，每组干预均设置3复孔；

④24小时后，将96孔板250g离心10分钟，小心吸出每孔上清液100μl至新的96孔板，按照试剂盒说明书加入配制的反应液100μl，室温避光孵育30分钟后flexstation3多功能酶标仪工作站于450nm和650nm检测各孔的吸光度；

⑤结果显示：索拉非尼10μm干预24小时对huh-7-dn细胞的毒性显著低于cd133⁺/epcam⁺和cd133^-/epcam^-细胞亚群。