本发明涉及药物合成技术领域，具体涉及一种用于淋巴结检查的大分子显像剂及其制备方法。
背景技术：
淋巴结的变化与许多疾病的发生、发展、诊断及治疗密切相关，尤其是对肿瘤的诊断、转移及发展变化的观察起着至关重要的作用。而淋巴结分布于全身，一般检查只能发现身体各部位表浅淋巴结的变化，因此淋巴结显像检查对于监控疾病的发现、发展以及进一步的行诊断治疗具有至关重要的意义。
在众多的研究中，选取的放射性显像剂几乎都是依靠淋巴吞噬作用进行探测的放射性胶体(99mTc-硫胶体或99mTc-人血清白蛋白等)，其颗粒大小不均匀，次级淋巴系统有显影。2013年3月美国药监局(FDA)首次批准用于淋巴结定位的新药-Lyphoseek。它能够与淋巴网状内皮细胞表面甘露糖受体(Mannose receptor,CD206)特异性结合，精确检测原发肿瘤(乳腺癌、黑色素瘤)向淋巴转移情况。国外公司相关技术发展迅速，并呈现市场垄断的趋势，为满足国内市场的需求，亟需发展新型特异性的淋巴结定位显像剂，以应对临床需求。
99mTc标记的大分子化合物是淋巴结的一类重要的显像剂，为了达到更 好的显像效果，会在大分子骨架上修饰不同的基团，其所涉及的基团主要分两种，一种是用来络合99mTc的螯合基团，譬如DTPA；另一种是用来增加在淋巴结中的滞留能力的定位基团，譬如甘露糖。而在同一个大分子骨架上要修饰两种不同的功能性基团的现有技术中，以往的显像剂往往让两种不同的功能性基团随机连接到同一个位点，造成分子跟分子之间的差异性，不均一性，甚至出现某个分子上只有一种基团，从而影响药的稳定性和效果。期刊文献D.R.Vera,A.M.Wallace,C.K.Hoh and R.F.Mattrey,a synthetic macromolecule for sentinel node detection:99mTc-DTPA-Mannosyl-Dextran,J Nucl Med 2001；42:951-959.公开了一大分子化合物显像剂
该现有技术的显像剂以dextran作为骨架，无差别的修饰上DTPA和mannose基团分别用来固定99mTc和提高显像剂在淋巴系统中的滞留能力，但是正是因为其中的DTPA和mannose基团是无差别的连接到dextran骨架上，所以两种基团的比例不固定不可控，这会造成药物药性的不稳定，降低药效。
技术实现要素：
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中淋巴结显像剂中修饰基团的不可控性导致分子跟分子之间存在差异性，不均一性，甚至出现某个分子上只有一种基团，从而影响药的稳定性和效果缺陷，从而提供一种用于淋巴结检查的大分子显像剂及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种用于淋巴结检查的大分子显像剂，所述显像剂以dextran作为骨架分子，并在所述骨架分子上修饰连接上gly-gly-gly和mannose基团，gly-gly-gly用于增加dextran分子在淋巴结处的滞留能力，mannose用于络合99mTc原子；
所述骨架分子上Gly-gly-gly和Mannose的比例为1：2。
所述显像剂的直径为5-5.9nm，99mTc标记率90-95％。
所述显像剂为99mTc-Gly-Mannosyl-Dextran，并具有如下结构：
上述显像剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)Gly-gly-gly的连接：使用醋酸作为催化剂，dextran与gly-gly-gly在二甲基亚砜溶剂中反应生成具有如下分子结构的第一中间产物
再用NaBH4还原第一中间产物，分离提纯得具有如下结构式的第一产物
备用；
(2)Mannose的连接：先用Dess-Martin作为氧化剂氧化第一产物的dextran骨架上的羟基，分离提纯得具有如下分子结构的第二中间产物
再使用2-氨基-2-氧-D-甘露糖盐酸盐将mannose连接在第二中间产物的被氧化的基团上，分离提纯得具有如下结构的第二产物
备用；
(3)Gly-mannosyl-dextran的标记：将第二产物、高锝酸钠Na99mTcO4、SnCl2、NaH2PO4以及生理盐水，摇晃均匀后静置得用于淋巴结检查的大分子显像剂。
步骤(1)中dextran：gly-gly-gly：醋酸：NaBH4的重量份配比为 dextran 20份：gly-gly-gly1份：醋酸0.1份：NaBH40.5份。
步骤(1)中，dextran与gly-gly-gly反应的条件为80℃下反应2小时；NaBH4还原第一中间产物的条件是：室温加入NaBH4并搅拌过夜，然后再向还原溶液中加入去离子水摇匀。
步骤(2)中氧化剂氧化第一产物的dextran骨架上的羟基后，需用饱和NaHCO3和过量的Na2S2O3洗去固体物，再分离提纯干燥得第二中间产物；将mannose连接在第二中间产物上后需将反应冷却至室温，加入去离子水。
步骤(2)中氧化剂Dess-Martin与第一产物的重量份配比为6.2：1；
第二中间产物与2-氨基-2-氧-D-甘露糖盐酸盐的重量份配比为1：3。
步骤(1)和步骤(2)中反应所使用的溶剂都是DMSO；所述的分离提纯是指先用0.45μm的薄膜过滤，然后用10倍的去离子水渗析，再浓缩渗析液并冻干。
步骤(3)中第二产物、高锝酸钠Na99mTcO4、SnCl2、NaH2PO4以及生理盐水的配比为第二产物10mg：高锝酸钠Na99mTcO4 1ml 0.5mCi：SnCl2 50mg：NaH2PO4 34mg：生理盐水1ml。
上述显像剂的应用。
大量的文献研究表明淋巴显像剂的粒径小于1nm的时候会逃逸出淋巴系统，而粒径大于10nm迁移速度就太慢了，所以最理想的粒径大小是稍微大于5nm。因此99mTc标记率93％这个是在标记药物里面一般标记率要达到90％才算合格。
本发明中Dextran为右旋糖酐，在本发明中作为骨架分子；gly-gly-gly基团为三聚甘氨酸|H-Gly-Gly-Gly-OH分子去末端氢后的基团，在本发明中用作99mTc的络合剂；mannose分子为甘露糖mannose分子去末端氢后的基团，在本发明中用来提高显像剂在淋巴结中的滞留能力。
Dess-Martin氧化剂，即戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin periodinane)，又称戴斯-马丁试剂，分子式是C13H13IO8，分子量424.142，CAS登记号为87413-09-0，催化剂及助剂一种。
本发明提供用于淋巴结检查的大分子显像剂与现有技术相比具有如下优点：
1、本发明提供用于淋巴结检查的大分子显像剂以dextran作为骨架分子，并在骨架分子上修饰连接上gly-gly-gly和mannose基团，gly-gly-gly用于增加dextran分子在淋巴结处的滞留能力，mannose用于络合99mTc原子；所述骨架分子上Gly-gly-gly和Mannose的比例为1：2。提高了药物分子的均一性，进而提高药物的有效性。
2、本发明提供用于淋巴结检查的大分子显像剂的直径为5-5.9nm，99mTc标记率90-95％。能保证迁移速度的快慢的合适度。
3、本发明提供用于淋巴结检查的大分子显像剂的制备方法中Gly-gly-gly和Mannose是针对dextran骨架上不同反应位点连接上去的，所以确保了每一个dextran骨架分子上都有这两种分子，而现有技术中的的这类大分子显像药物分子都是针对同一位点连接两种功能性基团，两种功能团竞争同一位点，没有选择性，不能确保每个分子上都连接有两种功能性基团，从而药物的均一性和有效性受到影响。
4、本发明提供用于淋巴结检查的大分子显像剂的制备方法针对骨架上不同的反应位点，连接两种基团，从而把每个骨架分子上的每种基团的数量固定下来，从而保证药物的均一性和有效性。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
试剂来源说明：
高锝酸盐商购于北京原子高科；31ET色谱纸商购于whatman；所有的其他试剂都是商购于sigma Aldrich。
本发明中，第一中间产物具有如下结构式：
第二中间产物具有如下结构式：
第一产物具有如下结构式：
第二产物具有如下结构式：
实施例1大分子化合物显像剂1
(1)Gly-gly-gly的连接：
在100ml圆底烧瓶中加入5g dextran，0.21g gly-gly-gly and 50ml DMSO。一滴醋酸作为催化剂，80℃下反应两小时得第一中间产物。冷却至室温后，加入0.084g NaBH4并搅拌过夜。之后加入20ml去离子水摇晃均匀。最后混合液先用0.45μm的薄膜过滤，然后用10倍的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩冻干得第一产物。
(2)Mannose的连接：Mannose的连接分两步。
第一步是dextran骨架上羟基的氧化。在50ml圆底烧瓶中加入上一步 连接完gly-gly-gly的产物1g、Dess-Martin氧化剂7.06g以及30ml DMSO室温搅拌一小时。然后加入饱和NaHCO3和过量的Na2S2O3，过滤掉固体，然后先用0.45μm的薄膜过滤，再用十倍体积的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩并冻干得第二中间产物。
第二步是mannose的连接。在50ml圆底烧瓶中加入200mg上一步的氧化产物、617mg 2-氨基-2-氧-D-甘露糖盐酸盐以及20ml DMSO 80℃下反应两小时。反应冷却至室温后，加入20ml去离子水，摇晃均匀后先用0.45μm薄膜过滤，再用十倍的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩冻干得第二产物。
(3)Gly-mannosyl-dextran的标记：
在2ml的西林瓶中加入上一步的冻干产物1.5mg、0.5ml(约0.5mCi)高锝酸钠Na99mTcO4、5mg SnCl2、30mg NaH2PO4以及1ml生理盐水，摇晃均匀后静置10min。用丙酮作展开剂，31ET色谱纸作层析条展开得标记率93％左右。
(4)大分子化合物显像剂1的性能验证
大分子化合物显像剂1大分子直径为5.4nm；
99mTc标记率为93％；
大分子骨架上Gly-gly-gly和Mannose的比例为1：2；分别测量合成的大分子显像化合物中Gly-Gly-Gly和Mannose基团的确切含量，两种基团的测定方法如下：
含gly-gly-gly基团的大分子显像化合物先跟Mn原子络合，再用原子吸收光谱法测定Mn的含量
含Mannose基团的大分子显像化合物用硫酸苯酚法测定葡萄糖单元的含量
对于本发明的骨架分子来说，每一个dextran骨架分子上都有这两种分子，gly-gly-gly和mannose基团都存在在骨架上。每个骨架分子上的只有一个反应位点可以用来连接相应的化合物，所以只要连上去了肯定有。
实施例2大分子化合物显像剂2
(1)Gly-gly-gly的连接：
在100ml圆底烧瓶中加入20g dextran，1g gly-gly-gly and 50ml DMSO。4滴醋酸作为催化剂，80℃下反应两小时得第一中间产物。冷却至室温后，加入0.5g NaBH4并搅拌过夜。之后加入80ml去离子水摇晃均匀。最后混合液先用0.45μm的薄膜过滤，然后用10倍的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩冻干得第一产物。
(2)Mannose的连接：Mannose的连接分两步。
第一步是dextran骨架上羟基的氧化。在50ml圆底烧瓶中加入上一步连接完gly-gly-gly的产物1g、Dess-Martin氧化剂6.2g以及30ml DMSO室温搅拌一小时。然后加入饱和NaHCO3和过量的Na2S2O3，过滤掉固体，然后先用0.45μm的薄膜过滤，再用十倍体积的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩并冻干得第二中间产物。
第二步是mannose的连接。在50ml圆底烧瓶中加入200mg上一步的氧化产物、600mg 2-氨基-2-氧-D-甘露糖盐酸盐以及20ml DMSO 80℃下反应两小时。反应冷却至室温后，加入20ml去离子水，摇晃均匀后先用0.45μm薄膜过滤，再用十倍的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。 最后将渗析液浓缩冻干得第二产物。
(3)Gly-mannosyl-dextran的标记：
在2ml的西林瓶中加入上一步的第二产物10mg、1ml高锝酸钠Na99mTcO4、50mg SnCl2、34mg NaH2PO4以及1ml生理盐水，摇晃均匀后静置10min。用丙酮作展开剂，31ET色谱纸作层析条展开得标记率90％左右。
(4)大分子化合物显像剂1的性能验证
大分子化合物显像剂1大分子直径在为5.5nm；
99mTc标记率为90％；
大分子骨架上Gly-gly-gly和Mannose的比例为1：2；合成的大分子显像化合物中Gly-Gly-Gly和Mannose基团的确切含量的测定方法如下：
含gly-gly-gly基团的大分子显像化合物先跟Mn原子络合，再用原子吸收光谱法测定Mn的含量
含Mannose基团的大分子显像化合物用硫酸苯酚法测定葡萄糖单元的含量
实施例3大分子化合物显像剂3
(1)Gly-gly-gly的连接：
在100ml圆底烧瓶中加入5g dextran，0.21g gly-gly-gly and 50ml DMSO。一滴醋酸作为催化剂，80℃下反应两小时得第一中间产物。冷却至室温后，加入0.084g NaBH4并搅拌过夜。之后加入20ml去离子水摇晃均匀。最后混合液先用0.45μm的薄膜过滤，然后用10倍的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩冻干得第一产物。
(2)Mannose的连接：Mannose的连接分两步。
第一步是dextran骨架上羟基的氧化。在50ml圆底烧瓶中加入上一步连接完gly-gly-gly的产物1g、Dess-Martin氧化剂7.06g以及30ml DMSO室温搅拌一小时。然后加入饱和NaHCO3和过量的Na2S2O3，过滤掉固体，然后先用0.45μm的薄膜过滤，再用十倍体积的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩并冻干得第二中间产物。
第二步是mannose的连接。在50ml圆底烧瓶中加入200mg上一步的氧化产物、617mg 2-氨基-2-氧-D-甘露糖盐酸盐以及20ml DMSO 80℃下反应两小时。反应冷却至室温后，加入20ml去离子水，摇晃均匀后先用0.45μm薄膜过滤，再用十倍的去离子水渗析，半透膜的截留分子量为3000。最后将渗析液浓缩冻干得第二产物。
(3)Gly-mannosyl-dextran的标记：
在2ml的西林瓶中加入上一步的第二产物1.5mg、0.5ml(约0.5mCi)高锝酸钠Na99mTcO4、5mg SnCl2、30mg NaH2PO4以及1ml生理盐水，摇晃均匀后静置10min。用丙酮作展开剂，31ET色谱纸作层析条展开得标记率95％左右。
(4)大分子化合物显像剂1的性能验证
大分子化合物显像剂1大分子直径在为5.0nm；
99mTc标记率为95％；
大分子骨架上Gly-gly-gly和Mannose的比例为1：2；
Gly-Gly-Gly和Mannose基团的确切含量的测定方法如下：
含gly-gly-gly基团的大分子显像化合物先跟Mn原子络合，再用原子 吸收光谱法测定Mn的含量
含Mannose基团的大分子显像化合物用硫酸苯酚法测定葡萄糖单元的含量
对比例1现有技术的大分子化合物显像剂Y
(1)现有技术的大分子化合物显像剂Y的制备：
参考文献：D.R.Vera,A.M.Wallace,C.K.Hoh and R.F.Mattrey,a synthetic macromolecule for sentinel node detection:99mTc-DTPA-Mannosyl-Dextran,J Nucl Med 2001；42:951-959.公开一种大分子化合物显像剂，本发明发明人根据该文献所公开的方法制备出大分子化合物显像剂Y，制备过程大致如下：
第一步，dextran骨架分子的活化，连接上脂肪族链条，引进胺基作为活性位点
第二步，在活化后的骨架分子上随机的连上修饰分子DTPA和mannose，所得大分子显像剂结构如下:
或
(2)现有的大分子化合物显像剂Y的性能验证
大分子化合物显像剂Y大分子直径在为5.1nm；
99mTc标记率为超过98％；
大分子骨架上dtpa和Mannose的比例随机；
测定所有大分子显像剂骨架上dtpa和Mannose基团的平均数方法如下Dtpa先和Gd络合，测定Gd离子的含量，测定每个骨架上的平均数Mannose通过硫酸苯酚法测定葡萄糖基团的含量，测定每个骨架上的平 均数
本发明把dextran骨架上修饰的两种功能的官能团分子比例固定下来相对于现有的大分子化合物显像剂Y的随机比例来说，提高了药物的性能稳定性，理论上也提高了药效。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。