本发明属于生物医药领域，涉及氨鲁米特的新用途，具体涉及一种氨鲁米特的药物组合物及其神经保护的医药用途。
背景技术：
：氨鲁米特为肾上腺皮质激素抑制药和抗肿瘤药。对胆固醇转变为孕烯醇酮的裂解酶系具有抑制作用，从而阻断肾上腺皮质激素的合成。对皮质激素合成和代谢的其他转变过程也有一定抑制作用。在外周组织中，它能通过阻断芳香化酶而抑制雌激素的生成，从而减少雌激素对乳腺癌的促进作用，起到抑制肿瘤生长的效果。氨鲁米特可在肾上腺皮质和腺体外组织两个不同部位阻断雄激素的生物合成，从而起到药物肾上腺切除作用。在腺体内主要阻止肾上腺中的胆固醇转变为孕烯醇酮，从而抑制肾上腺皮质中自体激素的生物合成。氨鲁米特在周围组织中具有强力的芳香化酶抑制作用，阻止雄激素转变为雌激素。绝经后妇女的雌激素主要来源是雄激素的前体雄烯二酮在脂肪、肌肉和肝脏中经芳香化转变而来。氨鲁米特抑制芳香化作用比抑制肾上腺皮质激素合成作用大10倍。垂体后叶分泌的ACTH能对抗氨鲁米特抑制肾上腺皮质激素合成的作用，所以使用氨鲁米特的同时合用氢化可的松，以阻滞ACTH的这种作用。迄今为止，尚未见氨鲁米特的药物组合物与神经保护的相关性报道。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种从薄荷叶中分离得到的结构新颖的天然产物，该天然产物具有神经保护的作用；本发明的第二目的在于提供一种氨鲁米特的药物组合物，该药物组合物中含有氨鲁米特和上述从薄荷叶中分离得到的天然产物，该组合物在氨鲁米特和上述天然产物的协同作用下能发挥更加优异的神经保护作用；本发明的第三目的在于提供上述天然产物的制备方法；本发明的第四目的在于提供上述天然产物在制备神经保护的药物中的应用；本发明的第五目的在于提供上述氨鲁米特的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：一种具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，一种氨鲁米特的药物组合物，包括氨鲁米特、如上所述的化合物(Ⅰ)和药学上可以接受的载体。如上所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将薄荷的干燥叶粉碎，用70～80％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用大孔树脂除杂，先用6～10％乙醇洗脱5～7个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。进一步地，步骤(a)中，用75％乙醇热回流提取，合并提取液。进一步地，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。进一步地，步骤(b)中的正丁醇萃取物用大孔树脂除杂时，先用8％乙醇洗脱6个柱体积。如上所述的化合物(Ⅰ)在制备神经保护的药物中的应用。如上所述的氨鲁米特的药物组合物在制备神经保护的药物中的应用。本发明的优点：本发明提供的氨鲁米特的药物组合物中含有氨鲁米特和一种从薄荷叶中分离得到的结构新颖的天然产物，氨鲁米特和该天然产物单独作用时，神经保护作用较弱；二者联合作用时，神经保护作用显著提高，可以开发成神经保护的药物。本发明与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。分离方法：(a)将薄荷的干燥叶(5kg)粉碎，用75％乙醇热回流提取(20L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(4L)，依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水饱和的正丁醇(4L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中正丁醇萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用8％乙醇洗脱6个柱体积，再用70％乙醇洗脱8个柱体积，收集70％洗脱液，减压浓缩得70％乙醇洗脱浓缩物；(c)步骤(b)中70％乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为50:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、15:1(8个柱体积)和5:1(10个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为10:1(8个柱体积)、5:1(10个柱体积)和2:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(Ⅰ)(565mg，HPLC归一化纯度大于98％)。结构确证：黄色固体；HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z525.3178，结合核磁特征可得分子式为C32H44O6，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，600MHz)：H-1(5.96，d，J＝12.9Hz)，H-2(5.82，d，J＝12.9Hz)，H-4(4.57，dt，J＝12.1，6.5Hz)，H-5(2.17，m)，H-6(4.44，t，J＝4.2Hz)，H-7(1.43，m)，H-7(1.48，m)，H-8(2.28，dd，J＝13.0，4.8Hz)，H-11(1.38，m)，H-11(2.22，dd，J＝11.1，6.8Hz)，H-12(1.70，m，2H)，H-15(1.31，dd，J＝14.1，4.2Hz)，H-15(2.32，dd，J＝14.1，7.8Hz)，H-16(5.32，td，J＝7.3，4.2Hz)，H-16b(2.05，s)，H-17(2.46，m)，H-18(1.18，s)，H-19(0.99，d，J＝4.1Hz)，H-19(1.87，d，J＝4.1Hz)，H-21(1.82，s)，H-22(6.63，s)，H-24a(5.87，s)，H-24a(6.03，s)，H-25(2.89，m)，H-26(1.05，d，J＝6.7Hz)，H-27(1.12，d，J＝6.7Hz)，H-28(1.67，d，J＝6.5Hz)，H-30(1.01，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，150MHz)：151.2(CH，1-C)，118.6(CH，2-C)，168.5(C，3-C)，79.3(CH，4-C)，48.2(CH，5-C)，67.4(CH，6-C)，34.0(CH2，7-C)，40.2(CH，8-C)，30.0(C，9-C)，35.1(C，10-C)，28.5(CH2，11-C)，32.6(CH2，12-C)，45.9(C，13-C)，47.3(C，14-C)，47.5(CH2，15-C)，77.5(CH，16-C)，170.2(C，16a-C)，22.1(CH3，16b-C)，59.4(CH，17-C)，19.5(CH3，18-C)，36.5(CH2，19-C)，162.8(C，20-C)，16.8(CH3，21-C)，126.5(CH，22-C)，195.0(C，23-C)，154.8(C，24-C)，119.6(CH2，24a-C)，29.8(CH，25-C)，22.3(CH3，26-C)，21.7(CH3，27-C)，18.6(CH3，28-C)，20.4(CH3，30-C)。IR谱图中的3455cm-1、1715cm-1与1694cm-1吸收带表明该化合物结构中存在羟基、羰基与共轭羰基；UV谱图中的最大吸收207nm与251nm说明结构中存在共轭双键。氢谱核磁数据表明该结构中不饱和度是由三个C-C双键结构，三个羰基结构以及五个环状骨架组成。碳谱核磁数据与DEPT谱数据表明该化合物结构中含有32个碳，其中有七个甲基(δC22.1、19.5、16.8、22.3、21.7、18.6与20.4)，六个亚甲基(δC34.0、28.5、32.6、47.5、36.5与119.6)，十个次甲基(δC151.2、118.6、79.3、48.2、67.4、40.2、77.5、59.4、126.5与29.8)，九个季碳(δC168.5、30.0、35.1、45.9、47.3、170.2、162.8、195.0与154.8)，一个酮基(δC195.0)，两个酯羰基(δC168.5与170.2)，三个连氧叔碳(δC79.3、67.4与77.5)，六个烯碳(δC151.2与118.6、162.8与126.5；154.8与119.6)。核磁数据表明该化合物含有一个α,β-不饱和内酯结构[δH5.96(d，J＝12.9Hz，H-1)，5.82(d，J＝12.9Hz，H-2)；δC151.2(CH，C-1)，118.6(CH，C-2)，168.5(C，C-3)]，一个环丙烷结构[δH0.99(d，J＝4.1Hz，H-19)，1.87(d，J＝4.1Hz，H-19)；δC30.0(C，C-9)，35.1(C，C-10)，36.5(CH2，C-19)]，一个乙酰氧基[δH2.05(s，H-16b，3H)；δC170.2(C，C-16a)，22.1(CH3，C-16b)]。HMBC谱中H-6(δH4.44)与C-8(δC40.2)和C-10(δC35.1)的相关性，以及COSY谱中H-6和H-5(δH2.17)的相关性表明C-6(δC67.4)位连有一个羟基。通过HMBC解析可知H-16(δH5.32)与C-16a(δC170.2)存在相关性，表明了乙酰基连在C-16(δC77.5)位上。通过NOESY谱数据解析δH4.57的H-4、δH1.67的H3-28与δH2.17的H-5及δH4.44的H-6关系可以说明28-甲基相对立体构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致；实施例2：神经保护作用一、材料和仪器PC12细胞株，安徽中医学院实验中心赠与。Aβ1-40蛋白购于Sigma公司。化合物(Ⅰ)为自制，HPLC归一化纯度大于98％。DMEM/F12培养基(进口分装购于北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司。NewbomCalfSerum购于BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.，Ltd。MTT购于美国Amresco公司。凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司。多聚甲醛购于中国医药集团化学试剂有限公司。Bcl-2多克隆抗体购于武汉博士德生物技术有限公司。Bax多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。Cyt-c多克隆抗体购于武汉博士德生物技术有限公司。羊抗兔IgG/FITC购于北京博奥森生物技术有限公司。羊抗鼠IgG/(H+L)购于江苏碧云天生物公司。正常山羊血清购于武汉博士德生物技术有限公司。SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。电子分析天平(FA2004型，上海雷磁精密科学仪器公司)，酶标仪(ELx-800型，美国Bio-Tek)，流式细胞仪(EPICXL-MCL型，美国BeckmanCouiter公司)，高速冷冻离心机(3K30型，美国Sigma公司，二氧化碳培养箱(CO-150型，美国NBS有限公司)，OLYMPUS荧光显微镜(BX41型，带DP70摄像系统，日本Olympus公司产品)。二、试验方法1、Aβ1-40孵育Aβ1-40用去离子水配制成1000μmol/L储存液并分装，放置于冰箱-20℃储存，临用用前一周取出在37℃培养箱孵育7d，使之聚集老化。2、细胞的培养PC12细胞株用含10％胎牛血清、100U/而青霉素、100U/mL链霉素的DMEM/F12培养基在玻璃培养瓶中培养，CO2细胞培养箱的培养条件为37℃，5％CO2浓度，饱和湿度，待细胞长至80％丰度后用0.25％的胰酶消化传代1次(约2-3d)，倒置显微镜观察细胞生长状况，实验时取对数生长期细胞进行实验。进行MTT实验前将细胞接种到96孔培养板用无血清培养基培养；流式细胞仪检测前将细胞接种至6孔培养板用无血清培养既培养；免疫组化实验均用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。3、细胞给药处理及分组细胞共分为五组，无血清培养基接种24h后进行药物干预：①正常对照组：正常PC12细胞；②模型对照组：25μmol/LAβ1-40；③氨鲁米特组：25μmol/LAβ1-40+50mg/L氨鲁米特；④化合物(Ⅰ)组：25μmol/LAβ1-40+50mg/L化合物(Ⅰ)；⑤氨鲁米特与化合物(Ⅰ)组合物组：25μmol/LAβ1-40+25mg/L氨鲁米特+250mg/L化合物(Ⅰ)。药物处理24h后进行检测各项指标。氨鲁米特和化合物(Ⅰ)可以先用少量DMSO超声溶解。4、MTT检测各组细胞活力取对数生长期的细胞，胰酶消化后以1×105个/mL的细胞密度，每孔100μL接种于96孔板中无血清培养24h，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设置6个复孔，24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL继续在CO2细胞培养箱中孵育4h，然后取出96孔培养板，弃去上清液，每孔加入150μL的DMSO，放在摇床上振荡10min，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪在490nm波长处检测各孔的吸光值。以只加培养液的孔为调零参照，细胞活力用百分比表达，视对照组的细胞活性为100％。结果计算：细胞存活率＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)×100％。5、统计分析采用SPSS17.0分析软件对统计结果进行处理，数据采用单因素方差分析，用均数士标准差表示，组间采用LSD比较，P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为极其显著性差异，图表由Excel2003绘制。三、结果及结论MTT测试结果显示，与正常组细胞比较，模型对照组细胞活性明显降低(P<0.01)。与模型对照组比较，氨鲁米特与化合物(Ⅰ)组合物组的细胞活性显著提高，差异具有统计学意义(P＜0.01)；与模型对照组比较，氨鲁米特组、化合物(Ⅰ)组细胞活性有所提高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果见表1。表1对Aβ1-40诱导PC12细胞活性的影响(x±s，n＝6)组别细胞活性(％)正常对照组100±0.0模型对照组52.11±7.98氨鲁米特组64.79±7.84化合物(Ⅰ)组65.86±8.06氨鲁米特与化合物(Ⅰ)组合物组95.56±7.58结论：本研究证实Aβ1-40的毒性损害神经细胞，引起PC12大量凋亡，细胞活性下降；氨鲁米特、化合物(Ⅰ)、氨鲁米特与化合物(Ⅰ)组合物干预后凋亡情况得到改善，且氨鲁米特与化合物(Ⅰ)组合物的改善效果显著高于氨鲁米特或化合物(Ⅰ)单独作用的改善效果。氨鲁米特与化合物(Ⅰ)之间存在协同作用。上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。当前第1页1 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