本发明属于蛋白类产品分离纯化方法，具体涉及尖尾芋凝集素分离纯化的方法。
背景技术：
凝集素是多价的、非免疫来源的糖结合蛋白。它能选择性地结合细胞表面的糖链，从而导致细胞的凝聚。虽然凝集素的生理功能尚待阐明，但由于凝集素所具有的糖结合专一性、促有丝分裂活性、凝集恶变细胞能力、细胞毒特性等，已使其在生物化学、免疫学、组织化学、临床诊断与治疗等方面发挥了广泛的作用。
尖尾芋是生长在我国南方的多年生常绿草本植物。中草药中常作狼毒使用,用于消肿散结。侯学文等从该植物中分离得到了一种凝集素AEL，发现AEL对培养人外周血白细胞的转化率高达88％，超过对照PHA的转化率，有助于增强免疫功能低下的病人的免疫功能。
侯学文等，公开了一种尖尾芋凝集素的分离提纯方法，其是采用(NH4)2SO4分段沉淀，再以Sephadex柱层析进行分离，然而该技术提供的从尖尾芋分离纯化凝集素的工艺过程较为复杂，凝集素的分离纯化效率较低，生产及使用成本较高。
技术实现要素：
本发明提供了一种尖尾芋凝集素纯化的方法，旨在解决现有技术提供的从尖尾芋分离纯化凝集素的工艺过程较为复杂，凝集素的分离纯化效率较低，生产及使用成本较高的问题。
本发明的目的在于提供一种尖尾芋凝集素纯化的方法，该方法包括以下步骤：
将尖尾芋粗粉用磷酸盐缓冲液浸泡1h，超声处理10min，滤过取滤液，并离心收集上清；
上清液中加入固体硫酸铵至饱和度达到90％，使上清液中的蛋白沉淀，离心取沉淀，透析除盐，冷冻干燥，得凝集素粗品一；
将凝集素粗品一经过DEAE-52离子交换层析柱，依次用0.05mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集第三个洗脱峰，检测凝血活性，透析除盐，冷冻干燥，得凝集素粗品二；
将凝集素粗品二经过Sephadex G-75柱，用蒸馏水洗脱，收集第一个洗脱峰，检测凝血活性，冷冻干燥，得到尖尾芋凝集素纯品。
进一步，使用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)浸泡1h，随后以240W超声处理10min，滤过取滤液，并以5000r/min离心20min，保留上清液待用。
进一步，采用90％硫酸铵饱和溶液沉淀上清液中的蛋白，静置6h，以5000r/min离心20min。
进一步，将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液溶液中，用蒸馏水透析除盐，测凝血活性，真空冷冻干燥即得凝集素粗品一。
本发明属于凝集素分离纯化技术领域，提供了一种尖尾芋凝集素纯化的方法，磷酸盐缓冲液浸泡1h，以240W超声处理10min，滤过取滤液，并离心收集上清，采用90％硫酸铵沉淀，离心取沉淀，透析除盐，冷冻干燥，将溶解的上清液经过DEAE-52离子交换层析柱，收集第三个洗脱峰，检测凝血活性，透析除盐，冷冻干燥，将溶解的上清液经过Sephadex G-75柱，收集第一个洗脱峰，检测凝血活性，冷冻干燥，尖尾芋分离纯化凝集素的工艺过程较为简便，凝集素的分离纯化效率较高，生产及使用成本较低，实用性强，具有较强的推广与应用价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的尖尾芋凝集素分离纯化的方法的实现流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所 描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的尖尾芋凝集素分离纯化的方法的实现流程。
该方法包括以下步骤：
在步骤S101中，将尖尾芋粗粉用磷酸盐缓冲液浸泡1h，超声处理10min，滤过取滤液，并离心收集上清；
在步骤S102中，上清液中加入固体硫酸铵至饱和度达到90％，使上清液中的蛋白沉淀，离心取沉淀，透析除盐，冷冻干燥，得凝集素粗品一，得率为1.202％；
在步骤S103中，将凝集素粗品一经过DEAE-52离子交换层析柱，依次用0.05mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L的氯化钠溶液洗脱，收集第三个洗脱峰，检测凝血活性，透析除盐，冷冻干燥，得凝集素粗品二，得率为0.455％；
在步骤S104中，将凝集素粗品二经过Sephadex G-75柱，用蒸馏水洗脱，收集第一个洗脱峰，检测凝血活性，冷冻干燥，得到尖尾芋凝集素纯品，得率为0.142％。
作为本发明实施例的优化方案，使用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)浸泡1h，随后以240W超声处理10min，滤过取滤液，并以5000r/min离心20min，保留上清液待用。
作为本发明实施例的优化方案，采用90％硫酸铵饱和溶液沉淀上清液中的蛋白，静置6h，5000r/min离心20min。
作为本发明实施例的优化方案，将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液溶液中，用蒸馏水透析除盐，测凝血活性，真空冷冻干燥即得凝集素粗品。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
尖尾芋凝集素提取分离：磷酸盐缓冲液浸泡1h，以240W超声处理10min，滤过取滤液，并离心收集上清，采用90％硫酸铵沉淀，离心取沉淀，透析除盐，冷冻干燥，将溶解的上清液经过DEAE-52离子交换层析柱，收集第三个洗脱峰，检测凝血活性，透析除盐，冷冻干燥，将溶解的上清液经过Sephadex G-75柱，收集第一个洗脱峰，检测凝血活性，冷冻干燥。
本发明的具体实施步骤为：
取适量的成熟的尖尾芋根茎，去皮，晒干，用粉碎机打成粗粉，使用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH值7.4)浸泡1h，随后以240W超声处理10min，滤过取滤液，并以5000r/min离心20min，保留上清液待用；在上清液中加入固体硫酸铵至溶液饱和度为90％，以沉淀上清液中的蛋白；静置6h，以5000r/min离心20min，收集沉淀弃去上清液；将沉淀溶解于磷酸盐缓冲液溶液中，用蒸馏水透析除盐，测凝血活性，真空冷冻干燥即得凝集素粗品一，得率为1.202％。
(1)离子交换层析
将凝集素粗品装柱于1.0cm×30cm的层析柱，填料DEAE-cellulose52进行分离纯化，以NaCl溶液进行洗脱，浓度分别为0.05mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L，流速为1ml/5min，收集洗脱液各18管，每管2ml，280nm处测定紫外吸收，绘制紫外吸收曲线，收集第三吸收峰下的管将其合并，蒸馏水透析除盐，冷冻干燥后得到粗品二，得率为0.455％。
(2)凝胶过滤层析
将粗品二装柱于1.0cm×30cm的层析柱，填料Sephadex G-75进行进一步的分离纯化，用蒸馏水洗脱，流速为1ml/5min，以每2ml/管收集洗脱液，280nm处测定紫外吸收，绘制紫外吸收曲线，收集第一吸收峰下的管将其合并，冷冻干燥后得到尖尾芋凝集素纯品，得率为0.142％。
仪器设备
Q/TEDLC台式高速离心机：力康发展有限公司；FD8508真空冷冻干燥机：韩国ilsin公司；UV-2401PC紫外分光光度仪：日本岛津公司；XL-400B高速万能粉碎机：浙江永康市小宝电器有限公司；KH-400KDE型数控超声波清洗器：昆山禾创超声仪器有限公司。
本发明实施例提供的尖尾芋凝集素纯化的方法，磷酸盐缓冲液浸泡1h，以240W超声处理10min，滤过取滤液，并离心收集上清，采用90％硫酸铵沉淀，离心取沉淀，透析除盐，冷冻干燥，将溶解的上清液经过DEAE-52离子交换层析柱，收集洗脱峰，冷冻干燥，将溶解的上清液经过Sephadex G-75柱，收集洗脱峰，检测凝血活性，冷冻干燥。
尖尾芋分离纯化凝集素的工艺过程较为简便，凝集素的分离纯化效率较高，生产及使用成本较低，实用性强，具有较强的推广与应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。