一种类病变基因UAP1的催化特性及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种类病变基因UAP1的催化特性及其应用。

背景技术：

植物类病变(lesion mimic,LM)又称类病斑，指在没有明显机械损伤、逆境和外界病原菌侵染，植物的局部(如叶片、叶鞘等)或整株上自发产生坏死斑点。这种现象普遍存在于植物界，玉米中最早报道了该表型的突变体，随后在大麦、拟南芥、水稻等植物中相继发现。突变体的表型与植物过敏反应中无毒病原菌侵染形成的病斑非常类似，都是通过局部细胞死亡诱发叶片发生肉眼可见的形态变异，属于程序性细胞死亡(PCD)。某些类病变突变体可以对不同的病菌表现出一定抗性，因此类病变突变体及其相关基因是阐释植物抗病性和PCD调控机制的理想材料。类病变发生的机制相当复杂，许多研究发现，植物代谢过程中某些关键酶发生突变，会直接或间接诱导植物类病变的发生。这些代谢途径主要涉及脂肪酸、氨基酸以及卟啉等。例如，中科院遗传与发育研究所李家洋课题组发现拟南芥MOD编码脂酰基载体蛋白还原酶(脂肪酸合成途径的关键酶之一)，该酶的点突变会导致催化活性显著下降，脂肪酸不能正常生物合成，造成总 脂生成量减少，造成拟南芥生长发育受到严重影响。此外，催化色胺羟基化的蛋白CYP71P1参与水稻类病变的发生。目前发现水稻尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(OsUAP1)突变导致叶片上出现褐色斑点并过早衰老坏死。

UAPase属于UDPGP(UDP-glucosepyrophosphorylase；PF01704)基因家族，在自然界中普遍存在，在将糖转化成核苷酸糖的代谢过程中发挥着关键性的作用，对维持生物体生长发育至关重要。UAPase具有较广泛的底物特异性，能催化UDP-GlcNAc合成及分解反应。但OsUAP1蛋白是否具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性以及它与水稻叶片细胞坏死产生类病斑并早衰之间存在怎样的关系，目前还鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种类病变基因UAP1的催化特性及其应用，旨在解决OsUAP1蛋白是否具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性以及它与植物叶片细胞坏死形成类病斑存在怎样的关系属于技术空白的问题。

本发明是这样实现的，一种类病变基因UAP1，所述类病变基因UAP1的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

进一步，所述类病变基因UAP1的催化特性为OsUAP1催化UDPG单向分解，不催化UDPG合成；OsUAP1点突变G280E使得酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一。

本发明的另一目的在于提供一种所述的类病变基因UAP1在培育和改良抗早衰水稻品种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的类病变基因UAP1的在防治水稻叶片细胞坏死中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种所述的类病变基因UAP1的在延缓稻株衰老中的应用。

本发明提供的类病变基因UAP1的催化特性及其应用，本发明中发现类病变基因OsUAP1具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，能催化UDPG分解；氨基酸点突变OsUAP1^G280E导致酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一，且UDPG积累是诱发水稻叶片坏死斑点形成类病变的一个重要因素，解决了OsUAP1蛋白除具有尿苷二磷酸乙酰葡糖胺焦磷酸化酶活性外，是否还具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，在尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)代谢中是否发挥催化功能以及其代谢中间物UDPG与水稻叶片细胞程序性死亡导致的类病变存在怎样的关系属于技术空白的问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的OsUAP1酶活性及点突变对酶活性的影响示意图。

图2是本发明实施例提供的OsUAP1突变导致UDPG代谢失调示意图。

图3是本发明实施例提供的UDPG促进突变体类病变的发生示 意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明通过体外酶活测定以及植物体内代谢中间物尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的含量分析，发现OsUAP1只能催化UDPG单向分解，而不催化其合成；OsUAP1点突变(G280E)使得酶活性显著降低；体内分析表明，OsUAP1knock down突变体中UDPG含量显著升高，萄糖焦磷酸化酶(UGPases)活性下降，而过表达OsUAP1则可明显降低UDPG含量，表明OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一。此外，还发现施加外源UDPG会加速突变体植株坏死斑发生，推测UDPG积累是诱发水稻类病变产生的一个重要因素。本发明的结果有助于解析植物类病变发生以及PCD调控的分子机制，为明确糖类代谢在高等植物生长发育中的重要作用提供依据；由于类病变发生通常导致植物抗病反应的组成性表达以及对病原菌抗性的增强，结果具有应用于水稻育种实践的潜在价值；UAP1的基因序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

1.材料与方法

1.1重组蛋白的诱导表达与纯化

将重组载体转化原核表达菌株BL21，进行重组蛋白的原核诱导表达和体外纯化。

1.1.1重组蛋白的原核诱导表达：

(1)将阳性克隆接种到3mLLB培养基(含50μg/mLkanamycin，34μg/mL

chloramphenicol)，37℃，220rpm摇菌6～8h；

(2)将上述菌液全部接种到50mL LB培养基，220rpm摇菌，使菌液达到饱和状态；

(3)取上述菌液20mL，接种到1LLB液体培养基(含34μg/mL chloramphenicol)，37℃，220rpm摇菌；

(4)待菌液A₆₀₀＝0.4～0.6，将摇床温度降至16℃；

(5)加入0.2mM IPTG诱导8h；

(6)4℃，6000rpm，离心5min，收集菌体。

1.1.2His-tag重组蛋白体外纯化

所需溶液：

pH＝8.0平衡液(A液)：磷酸钠缓冲液(50mM)、NaCl(0.3M)以及咪唑(10mM)

pH＝8.0洗脱液(B液)：磷酸钠缓冲液(50mM)、NaCl(0.3M)以及咪唑(250mM)

(1)往重组载体转化的BL21菌体中加入10mL A液，悬浮菌体，用超声破碎仪破碎菌体(置于冰上操作)；

(2)4℃，12000rpm，离心30min，取上清；

(3)Bio-Rad蛋白低压层析系统进行纯化。先用超纯水冲洗柱床至紫外检测器的吸收值靠近基线水平；再用3-5倍柱体积A液冲洗；按A液:细菌裂解上清＝1:1上样，流速1mL/min。上样完成后，用A液冲洗柱床，尽量冲去没有结合的蛋白质和杂质，直至紫外检测器的吸收值靠近基线水平。用B液进行洗脱，流速1mL/min，2mL收集管分步收集紫外检测到的重组蛋白。以上纯化步骤均在低温层析柜(4℃)中完成。

(4)重组蛋白SDS-PAGE电泳。

1.2酶促反应过程：反应缓冲液：

MgCl₂ 5mM

UDPG或Glc-1-P 0.8mM

Tris-HCl(pH7.5) 10mM

反应体系为1mL：在新鲜配制的反应缓冲液中加入5μg原核表达蛋白，再加入100mM焦磷酸钾盐10μL(用于UDPG分解反应)或20mM UTP 10μL(用于UDPG合成反应)，迅速混匀，37℃反应，置于沸水中煮5min。

1.3叶片UDPG提取

取不同时期或不同部位的野生型、突变体ugp8-1、ugp8-2叶片，用液氮研磨。迅速称取研磨后的粉末约0.1g于20mL离心管中，加入4mL蒸馏水，置于沸水中煮30min。取出，冷却至室温，8000rpm离心10min，吸取上清液，用去离子水定容至5mL，即为提取液。先吸取提取液3mL，37℃抽真空，浓缩至0.5mL(约5～6h)， 然后用0.22μm滤膜过滤除杂UDPG含量测定：

1.4UDPG含量测定

用HPLC检测UDPG含量。色谱条件为：色谱柱:Agilent Zorbax Carbohydrate(4.6*250mm 5μm)；流动相：0.125mol/L KH2PO4缓冲液(pH3.6)-乙腈(体积比为40:60)溶液，流速1mL/min；检测波长262nm；柱温：30℃；进样体积：10μL。

1.5UDPG对类病变的发生的影响

一周龄野生型Kitaake和突变体ugp8-2分别用0.2mg/mL、0.5mg/mL UDPG喷施处理7天，每天2次，观察并统计有表型的植株及病斑的严重程度。

2.结果与分析

2.1OsUAP1酶活性及点突变对酶活性的影响

2.1.1体外酶活性

将OsUAP1及其点突变构建到带His标签的原核表达载体pET-28a上，16℃经0.1mM IPTG诱导OsUAP1及0.02mM IPTG诱导OsUAP1^G280E各8小时，均表达出分子量约55kD可溶性重组蛋白(图1A)，并通过Ni-NTA亲和层析进行纯化(图1B)。用His-tag抗体进行Western Blot检测，鉴定此重组蛋白为目的蛋白。为了验证OsUAP1重组蛋白能否表现出可逆催化活性，一方面用UDPG和PPi为底物，将重组蛋白分别与上述底物在37℃孵育不同时间(0～15min)，高温终止反应后，利用HPLC检测UDPG剩余含量，用反应前后UDPG减少量来表示该酶催化UDPG降解活力 的高低。结果发现OsUAP1和OsUAP1^G280E重组蛋白均能催化UDPG分解生成Glc-1-P和UTP，但OsUAP1^G280E重组蛋白的催化活性显著降低(图1C)，推测G280可能是OsUGP8活性中心的关键氨基酸残基之一。另一方面，用Glc-1-P和UTP作为底物，将重组蛋白分别与上述底物在37℃孵育，再经HPLC检测UDPG含量，结果发现反应液中没有产物UDPG生成，表明OsUAP1不能催化UDPG合成反应(图1D)。由以上结果推测OsUAP1只具有单向催化能力。

A：重组蛋白的体外表达(M：蛋白Marker；1：诱导前；2-3：红色箭头所示分别为诱导后OsUAP1、OsUAP1^G280E)；

B：重组蛋白的亲和层析纯化(M：Marker；1：OsUAP1；2：OsUAP1^G280E)；

C：重组蛋白OsUAP1和OsUAP1^G280E催化UDPG分解反应的时间进程分析；

D：HPLC测定UDPG含量；

E：野生型和突变体总蛋白利用抗体Anti-OsUAP1进行Western Blot检测；

F：野生型和突变体叶片UGPases酶活性分析。

2.1.2体内酶活性

体外酶活性分析表明OsUAP1氨基酸点突变会降低酶活性，进一步在水稻 体内验证。首先提取野生型和OsUAP1突变体水稻叶片总蛋白，用兔多克隆抗体Anti-OsUAP1进行Western Blot测，结果发现野生型和突变体水稻OsUAP1蛋白含量没有发生明显变化，说明点突变不影响体内OsUAP1蛋白含量。UGPases活性分析发现，突变体中UGPases催化UDPG降解的总酶活性明显低于野生型，而其催化UDPG合成的活性几乎没有发生变化，表明点突变导致OsUAP1酶活性降低而引起体内UGPases催化能力的显著下降。该结果也进一步证实OsUAP1只具有单向催化UDPG降解的活性。

2.2OsUAP1突变导致UDPG代谢失调

2.2.1OsUAP1突变导致UDPG积累

鉴于UDPG是糖代谢过程中重要的中间化合物，进一步比较OsUAP1突变体在不同时期(类病变发生前、初始期、较严重期和极严重期)叶片UDPG含量。结果发现在坏死斑出现前后，UDPG含量均高于同一生长时期的野生型(图2A)，表明OsUAP1突变造成UDPG的积累。

2.2.2OsUAP1过表达导致UDPG含量降低

2.2.2.1转基因材料的鉴定

通过农杆菌介导转化越光(籼稻品种)愈伤组织，获得了OsUAP1编码区序列的过表达转基因株系25份，用OE表示。首先在DNA水平进行鉴定，提取各个株系的基因组DNA，通过跨内含子设计引物进行扩增。发现，与野生型相比，OE1、OE2、OE3、OE4、OE6、OE8能扩增获得一条约890bp亮带(图2B)。在转录水平对这几个株系进行qPCR检测，结果显示这些株系中OE2的OsUAP1表达 量最高，是野生型2.85倍，OE1、OE4、OE8表达量均为野生型1.5倍以上(图2C)。

2.2.2.2转基因材料的UDPG含量测定

为进一步证实OsUAP1在UDPG代谢中重要作用，测定了过表达阳性株系OE1、OE2、OE4、OE8中UDPG含量。结果显示它们均低于野生型(图2D)，表明OsUGP8过表达会促进UDPG降解。

A：突变体和野生型叶片UDPG含量；

B：转基因材料DNA水平鉴定；

C：转基因材料RNA水平鉴定；

D：野生型和过表达材料UDPG含量。

2.3UDPG促进突变体类病变的发生

在类病变发生前期突变体中UDPG大量积累。为了深入剖析UDPG对类病变发生的影响，用外源UDPG(0.2mg/mL和0.5mg/mL)喷施一周龄野生型水稻Kitaake和OsUAP1突变体幼苗处理7天，统计并观察出现类病斑的植株数以及病斑发生和发展的严重程度。结果发现突变体出现类病斑的株数高于对照组，且病斑坏死程度明显严重，特别是0.5mg/mL UDPG处理时，类病斑株数达到80％以上，且叶片均较早出现了病斑(图3A-B)，表明外源UDPG能加速和加重突变体类病变的发生。但UDPG处理野生型Kitaake没有产生叶片细胞坏死的表型。证实UDPG积累是诱发类病变坏死斑产生的一个重要因素。

A：一周龄突变体用UDPG(0.5mg/mL)溶液喷施处理7天， 观察类病斑发生的情况(红色箭头表示病斑集中出现的部位)，对照组(CK)喷施蒸馏水；

B：0.2mg/mL和0.5mg/mL UDPG喷施处理后病斑出现率的统计分析。

本发明中发现类病变基因OsUAP1具有尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性，能催化UDPG分解；氨基酸点突变OsUAP1^G280E导致酶活性降低；OsUAP1是UDPG代谢的关键酶之一，且UDPG积累是诱发水稻类病变产生的一个重要因素。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。