一种皮肤精原细胞采集套装的制作方法

本发明涉及一种细胞采集套装，具体涉及一种皮肤精原细胞采集套装。

背景技术：

目前我国的临床和细胞研究实验中，细胞的采集、长期保存和使用是时空分离的，采集的细胞离体后对外部环境的要求非常苛刻，特别是细胞采集与长期保存之间的细胞转运时，由于细胞还没有经过长期保存处理外部环境不好会降低细胞活力，决定采集成功与否。同时采集后转运运输过程中环境温度变化不能方便、准确的监测，不知道运输过程中有没有因为环境温度不合格造成细胞失活。因此，方便、快捷的进行细胞采集，创造好的环境对细胞进行转运，并对之进行监测，是我国的临床和细胞研究实验中的一个很重要的课题。

技术实现要素：

本发明提供了一个采集套装，可以方便、快捷的进行细胞采集，并创造好的环境对细胞进行转运，采集套装中的保护液，进一步提供了皮肤精原细胞的适宜和稳定保存环境，可以显著提高皮肤精原细胞保存后的细胞活力。具体技术方案如下：

一种皮肤精原细胞采集套装，包含有采集盒和盒内采集部件；

所述采集盒包括采集盒外盖、采集盒内壳、设于采集盒外盖内侧的第一磁铁、与第一磁铁对应且设于采集盒内壳外侧的第二磁铁、和设于采集盒内壳内的盒内固定垫；

所述盒内采集部件包含采集管、与采集管匹配的双层金属环、试剂瓶、采集卡和冰盒、固定于双层金属环上的温度变色试纸；

所述盒内固定垫上设有采集管卡槽、双层金属环卡槽、试剂瓶卡槽、采集卡卡槽和设于盒内固定垫一端的冰盒卡槽。

优选的，所述的采集盒外盖和采集盒内壳材质为PC塑料。

优选的，所述的采集管为带刻度和管帽的PC试管。

优选的，所述双层金属环材质为铝。

优选的，所述盒内采集部件还包含有条形码一套。

优选的，所述盒内采集部件还包含有采集套装使用说明一份。

优选的，所述试剂瓶中装有细胞保护液，所述保护液主要是将氨基糖苷类抗生素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解所述氨基糖苷类抗生素50-200单位，所述DMEM培养基水溶液中DMEM培养基的浓度为10-25g/L,所述氨基糖苷类抗生素选自庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星或妥布霉素中的一种或多种。

优选的，所述保护液还包括氧合血红蛋白，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解所述氧合血红蛋白400-1000μg。

优选的，所述保护液还包括维生素E或谷胱甘肽中的一种或多种，每毫升DMEM培养基水溶液溶解维生素E0.25μmol和谷胱甘肽0.25μmol。

优选的，所述保护液还包括吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解吐温80 0.5μL、棕榈酰胺60μg、海藻酸钾30μg、月桂酰肌氨酸150μg。

优选的，所述保护液还包括柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶A，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解柠檬酸1-10μg、丙酮酸50-80μg、延胡索酸10-20μg和乙酰辅酶A80-150μg。

本发明的有益效果是：本发明提供的采集用套装使用方便，便于皮肤细胞或精原细胞的存储和运输，并且试剂瓶内的保护液充分模拟了体内环境，更适合皮肤细胞和精原细胞的生存，能够显著提高以上细胞的存活率。

附图说明

图1为实施例1采集盒外盖的仰视图；

图2为实施例1揭开采集盒外盖的采集套装俯视图； 图中，1采集盒外盖、2采集盒内壳、3第一磁铁、4第二磁铁、5盒内固定垫、11采集管卡槽、12双层金属环卡槽、13试剂瓶卡槽、14采集卡卡槽、15冰盒卡槽。

具体实施方式

实施例1

一种皮肤精原细胞采集套装，包含有采集盒和盒内采集部件；

所述采集盒包括采集盒外盖1、采集盒内壳2、设于采集盒外盖1内侧的第一磁铁3、与第一磁铁3对应且设于采集盒内壳外侧的第二磁铁4和盒内固定垫5；

所述盒内采集部件包含采集管、与采集管匹配的双层金属环、试剂瓶、采集卡、冰盒、和固定于双层金属环上的温度变色试纸；

所述盒内固定垫5上设有采集管卡槽11、双层金属环卡槽12、试剂瓶卡槽13、采集卡卡槽14和设于盒内固定垫5一端的冰盒卡槽15。

采集前打开皮肤精原细胞的采集套装采集盒外盖，取准备好的冰盒放入冰盒卡槽。

然后取出采集管，再将采集的皮肤精原细胞放入采集管中，每管25ml。将试剂瓶中的保护液按1:1的比例倒入采集管中，拧紧采集管盖。然后用记号笔在采集管上做好标记。

然后检查与采集管匹配的固定于双层金属环中的温度变色试纸，确认正常后，将固定有温度变色试纸的与采集管匹配的双层金属环装在采集管上，金属环紧贴采集管。

采集管需要暂时保存时，放入4℃冰箱，同时保证采集管管盖拧紧、采集管直立、稳定，可在12小时以内保存。

然后在采集卡上详细填写供体资料和采集信息。采集套装交接运输前，替换采集套冰盒卡槽中的冰盒，将采集管、填写完整的采集卡按原来位置放入采集套装中，盖上采集盒外盖，保证设于采集盒外盖内侧的第一磁铁和与第一磁铁对应的设于内壳外侧的第二磁铁相互吸引。

运输完成，打开皮肤精原细胞的采集套装，检查与采集管匹配的固定于金属环上的温度变色试纸，确认正常后，完成交接，测定细胞活力合乎要求后进行后续的长期保存或者增殖。若变色试纸显示温度高于对环境的要求温度，测定细胞活力不合乎要求则为采集失败，需要放弃采集的皮肤精原细胞。

本实施例的皮肤精原细胞的采集套装，使用方便，造价低廉。设于采集盒外盖内的第一磁铁和与第一磁铁对应的设于内壳外侧的第二磁铁相互吸引，降低了了运输过程中采集盒外盖因晃动或其它意外而被打开的概率。冰盒中的冰提供采集盒内的低温环境，冰盒卡槽位于盒内固定垫的一端而不是底部，如果运输时间较长，冰不够的情况下，可以在不拿出盒内固定垫的情况下进行冰盒的替换，可以更好的保障低温环境。温度变色试纸监测运输过程中的温度变化。护温度变色试纸很容易收到水或其它杂质污染而失效，不适宜直接贴在采集管上监测问题。普通的塑料保护层可以隔离保护温度变色试纸，但是同时也隔绝了热量，导热性不好，温度变色试纸的温度与采集管的温度有一定的差距。本实施例的双层金属环包夹保护温度变色试纸，隔离使其不受水或其它污染，同时紧贴采集管，更好的传递热量，使得温度变色试纸温度更接近与采集管的温度。

皮肤精原细胞的采集套装内部温度变化测量，先取制备好的冰盒，放入冰盒卡槽，放入温度计，预冷30分钟后，透过透明的采集盒观察温度计的温度并记录每30分钟记录一次温度。12小时内采集套装内部温度始终高于4摄氏度。

采集套装内皮肤精原细胞12小时活力曲线测定，MTT法测定细胞活力(《汪志荣，高琼，马传鑫，李燕妮.MTT法测定大肠杆菌活菌数实验研究，环境科学学报，2011，31(12)：2642-1650.)，每30分钟采样一次，以第一次取样的活力为100％。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，所述盒内采集部件还包含有条形码一套。

使用时，直接将条形码贴在采集管上，这样可以节省时间、加快速度，还避免了记号笔标记在运输中被误擦的风险。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，所述盒内采集部件还包含有采集套装使用说明一份。

对于以前没有使用过本皮肤精原细胞的采集套装的人，可以按照使用说明进行熟练的操作。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，所述的采集管为带刻度和管帽的PC试管，所述双层金属环材质为铝，所述试剂瓶中装有细胞保护液。

实施例5保护液的配制、使用和细胞活力测定

保护液1

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解庆大霉素100单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液2

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将卡那霉素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解卡那霉素100单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液3

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将阿米卡星用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解阿米卡星100单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液4

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、卡那霉素20单位、妥布霉素20单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液5

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将妥布霉素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解妥布霉素100单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为10.0g/L。

保护液6

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解庆大霉素100单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为25.0g/L。

保护液7

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和氧合血红蛋白用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白400μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液8

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和氧合血红蛋白用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液9

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和氧合血红蛋白用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白1000μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液10

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和维生素E用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、维生素E0.1μmol，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液11

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、维生素E和谷胱甘肽用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、维生素E0.3μmol、谷胱甘肽0.3μmol，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液12

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素E和谷胱甘肽用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素E0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液13

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素C和维生素E用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素C0.5μmol、维生素E0.5μmol，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液14

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、吐温80 0.5μg、棕榈酰胺80μg、海藻酸钾50μg、月桂酰肌氨酸100μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液15

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、吐温80 1.0μg、棕榈酰胺20μg、海藻酸钾10μg、月桂酰肌氨酸200μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液16

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素E、谷胱甘肽、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600mg、维生素E0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol、吐温80 0.5μg、棕榈酰胺60μg、海藻酸钾30μg、月桂酰肌氨酸150μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液17

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶A用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解分别庆大霉素100单位、柠檬酸10μg、丙酮酸80μg、延胡索酸10μg和乙酰辅酶A 80μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液18

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素E、谷胱甘肽、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶A用DMEM培养基水溶液 溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素E0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol、柠檬酸1μg、丙酮酸50μg、延胡索酸20μg和乙酰辅酶A 150μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

保护液19

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、氧合血红蛋白、维生素E、谷胱甘肽、吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾、月桂酰肌氨酸、柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶A用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、氧合血红蛋白600μg、维生素E0.25μmol、谷胱甘肽0.25μmol、吐温80 0.5μg、棕榈酰胺60μg、海藻酸钾30μg、月桂酰肌氨酸150μg、柠檬酸4μg、丙酮酸60μg、延胡索酸15μg和乙酰辅酶A 120μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液1

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将青霉素用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液溶解青霉素100单位，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液2

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素和转铁蛋白用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、转铁蛋白400μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液3

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、维生素E和谷胱甘肽用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、维生素E0.1μmol、谷胱甘肽0.9μmol，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液4

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、司盘80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、司盘80 0.5μg、棕榈酰胺80μg、枸橼酸钾50μg、月桂酰肌氨酸100μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液5

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、吐温80、棕榈酰胺和海藻酸钾用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、吐温80 0.5μg、棕榈酰胺80μg、海藻酸钾50μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液6

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、柠檬酸钾、丙酮酸钠、延胡索酸和乙酰辅酶A用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、柠檬酸钾10μg、丙酮酸钠80μg、延胡索酸10μg和乙酰辅酶A 80μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

对照液7

一种皮肤精原干细胞保护液，该保护液主要是将庆大霉素、柠檬酸、丙酮酸和延胡索酸用DMEM培养基水溶液溶解而成，每毫升所述DMEM培养基水溶液分别溶解庆大霉素100单位、柠檬酸10μg、丙酮酸80μg和延胡索酸10μg，所述DMEM培养基水溶液的浓度为16.9g/L。

试验例1

取存储于4℃冰箱的灭菌保护液，与刚采集的皮肤细胞或精原细胞按1:1体积比例混合均匀，置于4℃环境，不同的时间点各采样一次，以MTT法测定细胞活力，以第一次取样的活力为100％。

本组试验主要考察氨基糖苷类抗生素和DMEM浓度的影响，以对照液1分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照1组，以保护液2-6分别保存的皮肤细胞和精原细胞为实验1-5组，各实验组和对照组的皮肤细胞和精原细胞分别在24h后进入试验程序，调整皮肤细胞和精原细胞的密度均为1×106cells/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20μL细胞悬液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器检测各实验组和对照组保护液内表皮干细胞和精原干细胞的活率，结果如

表1所示。

表1试验例1各保护液与对照液的细胞活率结果

由表1可知，保护液1-6分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用对照液1组使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；保护液4使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用保护液1-3、5-6使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高。

由此得出，本发明提供的保护液中的氨基糖苷类抗生素换成了青霉素等抗生素后，皮肤细胞或精原细胞的活率显著降低，并且氨基糖苷类抗生素采用庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的混合物后，保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率更高。

试验例2

本组试验主要考察氧合血红蛋白的影响，以对照液2分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照2组，以保护液1、7和8分别保存的皮肤细胞和精原细胞为实验7-9组，检测过程如试验例1，保存24h后的检测结果如表2。

表2试验例2各保护液与对照液的细胞活率结果

由表2可知，保护液7、8分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用对照液2组使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；保护液8分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用保护液7分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高。

由此得出，本发明提供的保护液中的氧合血红蛋白换成了转铁蛋白后，皮肤细胞或精原细胞的活率显著降低，而氧合血红蛋白的浓度为600μg/mL时，保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高更高。

试验例3

本组试验主要考察抗氧化剂的影响，以对照液3分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照组，保护液7、10-12为实验组，检测过程如试验例1，保存48h后的检测结果

如表2。

表3试验例3各保护液与对照液的细胞活率结果

由表3可知，保护液10-12分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用保护液7、对照液3组使用的保护液分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；

保护液12分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用保护液10、11分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高。

由此得出，本发明提供的保护液中的抗氧化剂可以显著提高皮肤细胞或精原细胞的活率。

试验例4

以对照液4-7分别保存的皮肤细胞和精原细胞为对照组，保护液4、保护液7、保护液10、保护液14、16、保护液17和保护液19为实验组，各实验组和对照组的皮肤细胞和精原细胞分别在24h、48h、96h、240h、480h后进入试验程序，调整皮肤细胞和精原细胞的密度均为1×106cells/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20μL细胞悬液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器检测各实验组和对照组保护液内表皮干细胞和精原干细胞的活率，结果如表4所示。

表4试验例4各保护液与对照液的细胞活率结果

由表4可知，保护液14、16-17和保护液19分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率要比使用保护液1、保护液7和保护液10对照液4-7分别保存的皮肤细胞和精原细胞的细胞活率高；保护液17和保护液19分别保存的皮肤细胞和精原细胞的时间要比使用保护液14和16的保存时间长。

由此得出，本发明提供的保护液中的吐温80、棕榈酰胺、海藻酸钾和月桂酰肌氨酸组合物可以显著提高皮肤细胞或精原细胞的活率，柠檬酸、丙酮酸、延胡索酸和乙酰辅酶A组合物可以显著提高保护液对皮肤细胞或精原细胞的保存时间。