本发明属于医学
技术领域：
，尤其涉及一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法。
背景技术：
：最新研究发现，股骨头缺血性坏死(ANFH)病人的骨髓间充质干细胞的活性和数量都出现下降，这提示该疾病的发病原因可能不是成骨细胞本身而是间充质干细胞的增殖或分化受到抑制。而干细胞移植又存在细胞表型变异失去成骨能力现象，股骨头缺血性坏死(avascularnecrosisoffemoralhead，ANFH)是临床上常见的骨科疾病，致残率极高。目前的治疗措施包针对早期病例的髓芯减压、钻孔植骨等,以及晚期病例的股骨头置换术。这些方法效果都不甚满意,且存在争议。近来的研究显示股骨头坏死病人的骨髓中间充质干细胞的活性和数量都出现下降，这表明该疾病的发病原因可能是间充质干细胞的增殖或定向分化受到抑制。因此，利用骨髓间充质干细胞移植将成为未来治疗股骨头缺血性坏死的研究热点。但人们用各种方法从自体红骨髓中提纯的骨髓间充质干细胞很难达到临床应用的细胞数量，且无论是体外培养扩增还是体内移植中发现均存在细胞表型变异问题，即细胞去分化成纤维细胞特征，失去成骨能力，导致细胞数量受到限制，达不到组织构建的要求。本发明在广西壮族自治区卫生厅计划项目《TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损》的分析中也发现，单纯的干细胞虽然具有很强的组织修复潜能，但其所修复的组织在3个月左右即出现退变，远期治疗效果不佳。选择合适的细胞生长支架是任何组织构建过程中必须面对的难题，也是本发明着力要解决的问题之一。广泛使用选取人骨形态发生蛋白-2作为目的基因，是考虑其具有很强的促成骨细胞增殖、分化的作用。在体外对骨髓间充质干细胞有强烈的成骨转化作用。在众多的骨生长因子中，骨形态发生蛋白2在促进骨缺损修复和骨折愈合过程中效果显著，已成为骨组织工程常用的生长因子。BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。本发明在桂林市科委的资助下对hBMP促进成骨作用在骨质疏松和椎体滑脱治疗的研究中也证实了hBMP-2的良好的成骨诱导活性。广泛使用的各种合成材料，即使进行了表面改性及修饰处理，但在生物学和力学性能上总是不尽人意。这使得近年来人们又将目光投向天然人工骨材料。迄今为止，研究同行在这一命题的研究多限于基因转染细胞的体外成骨效果，而对体内如何控制骨髓间充质干细胞移植到体内后的分化方向及细胞诱导因子的持续有效的释放等方面的研究还很不成熟，这离完整地理解并应用组织工程这一原理来修复病变组织相差甚远。结合国内外同行的研究报道和本发明的研究基础，不难推断，如能将使hBMP在整个组织修复过程中持续地对细胞发生作用，使之朝我们需要的组织细胞形态分化，必将把组织工程学理论在股骨头缺血性坏死的研究和治疗向前推进一大步。综上所述，本发明拟在股骨头缺血性坏死的研究中，重点研究腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓间充质干细胞与支架材料复合修复股骨头坏死的作用，并对其机理做更加深入的探讨，为这一理论成果最终在临床应用提供理论与实践基础。这一模式应用于临床的前景十分广阔。它将有力地促进我国在该领域的研究在世界上占有一席之地。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，旨在解决基因转染对BMSCs增殖的影响及基因转染的干细胞对ANFH的修复治疗作用和干细胞的增殖、分化及退变过程对ANFH影响，并且目前的细胞生长支架在组织构建过程中存在生物学和力学性能上缺陷的问题。本发明是这样实现的，一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，该腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法包括：将hBMP-2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad-hBMP-2转染骨髓基质干细胞BMSCs；根据病毒滴度以感染复数(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。转染48h后，荧光显微镜下观察，可见感染复数为100转染的细胞，转染效率达95％以上；感染复数为50转染的细胞状态良好，但细胞内出现绿色荧光蛋白相对比较少，转染效率约为60％左右；当感染倍数为200时的感染效率较感染倍数为100时的感染效率无明显增加，荧光显微镜下见EGFP的表达说明Ad-BMP-2/EGFP包装成功。并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合；选取脱钙骨基质24块，放入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液中浸泡12h，无菌滤纸吸干备用。选取BMP-2基因转染48h后的BMSCs与同期对照组细胞接种，细胞悬液充分渗入后放入37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中贴附4h，再缓慢加入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液静置培养，隔天换液。培养48h后倒置显微镜、荧光显微镜观察细胞黏附情况，材料与细胞复合培养第7天，取各组部分样品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后观察。通过扫描电镜观察到细胞与脱钙骨基质材料复合体外培养7天后扫描电镜观察可见脱钙骨表面的细胞粘连成片，细胞布满孔隙，呈伸展状、立体状生长。植入ANFH的动物模型并对所修复股骨头进行X线、透射电镜、组织学、免疫组化分析(半定量)及力学性能的检测。X线检测：术后第4、8、12周，所有实验动物在全麻下拍摄双髋关节正位片，X线片拍摄在放射科完成，拍摄条件为45kV、125mA，投照距离为100cm，曝光时间为32ms，其结果示：A组术后4w时，实验侧股骨头钻孔清晰可见，边缘锐利，骨缺损区呈现低密度影，部分标本出现了小囊性变，股骨头轮廓欠规则，扁平塌陷，密度不均；术后8w时，低密度透光区仍然清晰可见，缺损区周围有骨吸收现象，股骨头关节面进一步塌陷，且骨小梁结构不清晰；12w时股缺损区仍然透亮，股骨头外形缩小，缺损严重，完全塌陷，B组术后4w时，股骨头骨密度降低，缺损区仍然存在，填充材料呈高密度影，未见明显吸收，周围见明显透光区，股骨头无塌陷；术后8w时，股骨头形态仍正常，填充材料周围透光区仍清晰，钻孔区密度高而均匀，钻孔边缘出现放射状骨小梁接合现象，但骨小梁结构比较紊乱；12w股骨头缺损区仍然存在，填充材料呈高密度影，体积较前略变小，与周围边界模糊，缺损区可见少许成骨反应及松散骨小梁结构，C组4、8、12w变化与B组大致相同，D组术后4w时，人工骨影模糊，钻孔区有密度增高影，质地均匀，钻孔边缘变得模糊；术后8w时，人工骨影缩小，边界不清，周围透光区影模糊；12w股骨头内出现规则连续骨小梁，钻孔边缘与人工骨交界区骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺损的低密度影，钻孔区骨密度接近周围骨质，未出现股骨头塌陷和关节间隙狭窄等骨性关节炎表现；Lane-SandhuX线评分整理各组动物X线检查结果，参照Lane-SandhuX线评分标准对各组股骨头修复情况进行评分；HE染色和镜检测：取出股骨头标本和一块正常股骨头，沿转子间连线锯断股骨头，行HE染色，其步骤如下：①股骨头标本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸馏水将固定标本冲洗3次，然后沿转子间连线锯断，投入体积分数10％硝酸溶液中进行脱钙5天。③用梯度酒精脱水：体积分数60％酒精脱水1h，体积分数70％酒精脱水1h，体积分数80％酒精脱水过夜，体积分数90％酒精脱水lh，体积分数95％酒精脱水30min，无水乙醇脱水1h，再无水乙醇脱水1h，纯氯仿中静置48h，使组织变得透明，5.5h后更换一次纯氯仿。④对上述标本进行浸蜡处理，第一蜡2h，第二蜡2h，然后用蜡块包埋标本，行5μm厚冠状切片，连续5张。A、B、C、D组及正常组(健侧股骨头)标本于倒置显微镜下观察观察骨小梁形态、成骨细胞并计算空骨陷窝率。空骨陷窝率＝空骨陷窝数/总骨陷窝数；其结果显示：股骨头正常结构可见大量骨髓组织，骨小梁规则，骨细胞形态正常，A组术后4w时骨小梁疏松，部分断裂，大量骨细胞坏死；8w时骨小梁结构紊乱、坏死，部分坏死骨小梁开始吸收，出现较多破骨细胞；12w时骨小梁广泛断裂、坏死、吸收，髓腔内出现大量坏死组织，空骨陷窝被挤压变形，B组术后4w骨小梁结构不规则，少许断裂，软骨细胞、骨细胞、骨髓细胞坏死量较A组少；8w时可见成骨反应，出现少许结构不规则的幼稚骨小梁；12w时缺损区周边有成骨反应，有向中心部生长的趋向，新生骨小梁较前增多，但仍为幼稚骨小梁，仍可见坏死骨组织，C组变化与B组大致相当，D组术后4w充填区周边出现反应带，周边为软骨性骨痂形成，孔隙内见纤维肉芽组织及毛细血管长入，未见淋巴细胞浸润等炎症反应；8w周边新骨带明显增宽，成骨反应向中心部推进,而中心部空腔面积明显减小，部分充填区基本为幼稚的骨小梁所占据,表面有较多的成骨细胞；12w时充填区广布相对较成熟的骨小梁,致密饱满，无硬化带形成，表面骨细胞数量较多且清晰可见，B和C组术后各时间点空陷细胞率、D组和正常侧组12W时差异无统计学意义；微观形貌观察与能谱分析：取4、8、12周的四组标本和一块正常兔股骨头标本，每个标本剖面随机挖取3块1mm×1mm×0.5mm的样本，浸入双蒸水震荡30min，共3次；4％多聚甲醛固定15min；25％、50％、75％、95％、100％酒精各脱水15min，自然晾干；真空镀膜仪喷金处理；置入Quanta200FEG场发射环境扫描电镜和X-射线能谱仪，电镜观察样品表面微观形貌，X线能谱分析仪(EnergyDispersiveSpectrometer，EDS)测定微区主要元素(碳、氮、氧、钙、硫、磷元素)的重量百分比和原子百分比百分含量，重复3次，然后计算钙磷比；其结果显示：电镜下正常骨组织板层结构致密、完整、排列方向一致，钙化良好，表面光滑，板层之间纤维成交交错，未见骨板断裂、扭曲等现象，4周时，A组骨板裂痕仍然清晰，出现纤维增生；8周时见骨小梁变细，部分断裂，纤维增生较前增加，欠规则，未见钙化颗粒；12周时见大量扭曲纤维增生充满视野，表面未见钙化物，骨小梁大部分消失，无明显新生成骨表现；B、C两组在4～8周时可见骨小梁变细，但未出现大量断裂现象，骨小梁表面出现“云翳状覆盖物”，覆盖物表面出现钙化颗粒沉积；12周时可见纤维表面钙化颗粒进一步增多，部分钙化颗粒堆积成团块，附着于骨小梁上，但是新生骨小梁形态欠佳，新生骨版结构不整，仍不成熟，D组在4周时出现大量新生胶原纤维，形态规则，方向一致，表面可见颗粒性钙化物，出现低钙化类骨质；8周时钙化物电子密度进一步增大，低密度类骨质逐渐融合成粗大骨小梁，骨小梁表面细胞渐丰富；12周时新生骨继续改建，新生骨板致密、规则，骨小梁结构趋向正常，并出现规则的骨陷窝及骨细胞，与正常骨组织形态大致相同；正常骨组织的主要成分为钙、磷酸盐沉积，Ca、P含量较高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆盖面积约为P元素峰覆盖面积的两倍，即Ca/P＝2.06，A组在4-12W的钙磷含量均较低，各元素水平未见明显变化，Ca/P为0.82，B、C两组在4W时钙磷含量较低；8W时Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12W时Ca、P元素含量进一步上升，P元素增速明显减慢，各元素含量处于比较稳定状态，Ca含量超过了P元素，B组Ca/P＝1.33,C组Ca/P＝1.52，D组在4W时即见到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加较快，呈双峰；8W时Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P达到2.85；12W时Ca、P含量增速变缓，各元素含量逐渐稳定，Ca/P＝1.99，与正常骨组织含量及钙磷比无较大差异，所述同种异体脱钙骨DBM支架材料为在体外构建具有生物活性的载体-细胞因子基因转染干细胞复合物，该同种异体脱钙骨DBM支架材料制备方法为：健康新西兰大白兔处死后取其四肢骨干骺端骨及椎体松质骨，根据Urist等方法经-80℃低温冻存72h，剔除骨组织以外组织，脱钙液脱钙72h，置乙醚、乙醇中脱脂各24h，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至浸泡液呈中性为止。此时松质骨块呈白色海绵状，能压缩变形并自动恢复至原状。去酸处理后的骨块继续在蒸馏水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脱钙骨基质,环氧乙烷消毒，4℃保存备用。倒置显微镜下观察支架材料有良好的孔隙结构，取部分样品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后观察。通过扫描电镜观察脱钙骨基质材料表面较平整，可见脱钙骨基质呈现疏松多孔结构，孔径大小不一，形状不规则并相互交通。脱钙骨基质的孔隙直径为215±86μm，孔隙率达76±3.51％，所述同种异体脱钙骨DBM支架材料为具有天然网状孔隙系统的原骨盐支架三维结构。本发明按照计划，掌握了密度梯度离心法提取兔BMSCs的实验方法，并成功完成了兔BMSCs培养、传代工作，之后对其表型进行了鉴定。通过探讨冻存技术对细胞的影响，本发明得出短期冻存(30天以内)对细胞生物活性的影响没有统计学意义，同时通过检测ALP、Ⅰ型胶原蛋白实验证明兔BMSCs在体外诱导作用下能够像成骨细胞分化。通过病毒转染实验，本课题组采用腺病毒MOI为50、100、200三种实验组进行比较，发现MOI50转染率猪油60％，MOI100时转染率为96％，且细胞形状未见明显改变，当MOI200时，转染率也为96％，但是此时细胞形状发生明显改变，病毒对细胞产生了较强的细胞毒性。因此认为腺病毒的最佳MOI为100。转染后运用PCR、Weston-blot。免疫组化方法检测BMP-2基因在BMSCs内能够稳定表达。本课题组根据Urist法成功构建DBM，并运用SEM检测发现其孔隙率接近正常骨组织，最为支架材料其性能明显优于其他支架材料。BMSCs复合DBM后，运用倒置显微镜、荧光显微镜和SEM检测，发现BMSCs与DBM复合情况良好，且复合BMSCs能在DBM表面生存，并产生细胞分泌物,证明很课题组成功构建组织工程骨。将组织工程骨进行体成骨诱导，通过茜素红染色、SEM、EDS方法检测钙结节、表面微观形貌、能谱分等指标，证明体外组织工程骨具有良好的成骨效应。经过试验，本课题组成功掌握兔缺血性股骨头坏死模型的制作方法，并成功制造合格的股骨头坏死模型。将组织工程骨植入兔股骨头坏死模型后，通过PCR、TRFQ-PCR和Wseton-blot方法检测hBMP-2表达情况，证明hBMP-2基因能够在异种体内表达，为后续实验奠定了基础。组织工程骨植入动物模型后，同意标准化饲养，尽量排出外界因素对实验结果的影响，运用X线、解剖学观察、HE染色、SEM、EDS方法检测股骨头坏死修复情况，发现植入组织工程骨的实验组比未植入组织工程的对照组有明显的修复效果。证明本发明的Ad-BMP-2/BMSCs/DBM对缺血性股骨头坏死有明显的修复效果。本发明用腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2基因(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein-2gene,Ad-hBMP-2)转染MSCs并与同种异体脱钙骨(demineralizedbonematrix，DBM)支架材料在体外复合，植入股骨头缺血性坏死(ANFH)的动物模型，期望成功修复缺血坏死的股骨头，并使其具备正常关节所需的生物学及力学特性。基因转染细胞后合成的蛋白经过自身细胞翻译后修饰，能更有效地同细胞表面受体结合，调控靶细胞的生长分化。腺病毒表达载体因具有转染效率高、目的基因高水平表达、免疫排斥反应低、安全系数高等优点，亦成为临床基因治疗的主要载体。因为骨修复是一个阶段性过程，不需要转染的目的基因长久表达，因此利用其将目的基因导入干细胞促进骨再生比较理想。选取人骨形态发生蛋白-2作为目的基因，是考虑其具有很强的促成骨细胞增殖、分化的作用。在体外对骨髓间充质干细胞有强烈的成骨转化作用。在众多的骨生长因子中，骨形态发生蛋白2在促进骨缺损修复和骨折愈合过程中效果显著，已成为骨组织工程常用的生长因子。BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。选择合适的细胞生长支架是任何组织构建过程中必须面对的难题，也是本发明着力要解决的问题之一。广泛使用选取人骨形态发生蛋白-2作为目的基因，是考虑其具有很强的促成骨细胞增殖、分化的作用。在体外对骨髓间充质干细胞有强烈的成骨转化作用。在众多的骨生长因子中，骨形态发生蛋白2在促进骨缺损修复和骨折愈合过程中效果显著，已成为骨组织工程常用的生长因子。BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。本发明在桂林市科委的资助下对hBMP促进成骨作用在骨质疏松和椎体滑脱治疗的研究中也证实了hBMP-2的良好的成骨诱导活性。广泛使用的各种合成材料，即使进行了表面改性及修饰处理，但在生物学和力学性能上总是不尽人意。这使得近年来人们又将目光投向天然人工骨材料。因此，本发明选择同种异体脱钙骨基质材料在体外构建具有生物活性的载体-细胞因子基因转染干细胞复合物将有助于解决细胞增殖及细胞因子持续发挥作用这一难题。通过体内植入法证实同种异体脱钙骨基质(demineralizedbonematrix,DBM)与MSCs具有良好的生物相容性，且具有体内成骨及成软骨能力。用同种异体或异种骨制备的生物衍生骨支架材料具有天然网状孔隙系统，原骨盐支架的三维结构，其组成及结构符合生理要求，具有良好的组织相容性，有利于细胞的粘附生长与分化。天然骨从形态学和力学的观点来看，都具有合成材料无法比拟的优势。脱钙松质骨的吸收与新骨的形成基本同步,既为新骨生成提供支架,又不影响新骨的塑形，具有较好的细胞界面，利于细胞贴附、迁移与增殖。本发明也对脱钙骨材料的生物学特征以及与干细胞的生物相容性方面进行了比较系统的分析，已证实它是一种比较理想的生物支架材料。在细胞增殖的整个周期，其降解速度与细胞增殖及分泌细胞外基质的速度相吻合，其降解率及生物黏附性能均能满足骨髓间充质干细胞的增殖需要。迄今为止，研究同行在这一命题的研究多限于基因转染细胞的体外成骨效果，而对体内如何控制骨髓间充质干细胞移植到体内后的分化方向及细胞诱导因子的持续有效的释放等方面的研究还很不成熟，这离完整地理解并应用组织工程这一原理来修复病变组织相差甚远。通过本发明使hBMP在整个组织修复过程中持续地对细胞发生作用，使之朝需要的组织细胞形态分化，必将把组织工程学理论在股骨头缺血性坏死的研究和治疗向前推进一大步。综上所述，本发明拟在股骨头缺血性坏死的研究中，重点研究腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染骨髓间充质干细胞与支架材料复合修复股骨头坏死的作用，并对其机理做更加深入的探讨，为这一理论成果最终在临床应用提供理论与实践基础。这一模式应用于临床的前景十分广阔。它将有力地促进我国在该领域的研究在世界上占有一席之地。通过本发明，阐明干细胞的增殖、定向分化及退变的条件及影响因素；通过体外测试，选择最适合的细胞移植浓度并制定相应参数，为干细胞治疗ANFH提供细胞学理论支持。通过本发明，证实干细胞的基因修饰对维持其细胞表型、控制其定向分化的重要性。通过对Ad-hBMP-2转染MSCs复合DBM体内植入后所修复坏死股骨头的数据分析，成功论证骨髓间充质干细胞的数量、分化及退变等与股骨头缺血性坏死的关系，阐明这一模式治疗ANFH的机理，为干细胞治疗股骨头缺血性坏死这一理论成果最终向临床过渡提供依据与支持。通过本发明，培养研究生掌握组织工程学理论的实验技术，为他们以后的研究奠定扎实的基础。附图说明图1是本发明实施例提供的腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法流程图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合试验对本发明的应用原理作进一步描述。1.自体MSCs的体外分离、培养、扩增、细胞表型的鉴定及体外定向诱导分化试验。1.1骨髓液提取：0.7％无巴比妥1ml/Kg耳缘静脉注射，待兔子麻醉后剔除剔除股骨粗隆周围毛发，用碘伏消毒，用12号骨穿针外接10ml注射器，注射器内含稀释的肝素103U/L0.2ml，从股骨大转子处穿刺抽取骨髓7ml，加入含有5mlDMEM培养基的离心管中充分混匀，在转速为1500rap/min离心5min。弃上清，加入3mlDMEM培养基重悬浮。1.2原代细胞培养：将重悬浮的骨髓液用吸管缓慢注入预置有等体积70％的percoll分离液，在转速2500r/min离心20min。提取中间絮状层，加入DMEM培养基至5ml，在转速为1500r/min的转速下离心5min，弃上层清液加入含有15％胎牛血清的DMEM培养基7ml重悬浮接种于60mm培养皿中。放入CO2浓度为5％，温度为37℃的恒温箱中培养。接种24小时在倒置显微镜下观察，见呈圆形的单核细胞，未见贴壁细胞。接种72小时后，在倒置显微镜下观察见好量细胞贴壁，成短梭性。在接种后的第5天弃原培养基，PBS洗涤3次。加入含15％FBS的DMEM5ml，以后每周换液两次。在接种后的第10天，在显微镜下观察见细胞的大部分贴壁，并且呈旋涡状，生长状态良好。原代骨髓间充质干细胞1.3传代细胞培养：接种后7天，将细胞从培养箱取出，在倒置显微镜下观察见细胞生长良好，并且呈现长梭状，融合率达80％。将原培养基弃除，用PBS洗涤3次。加入0.25％含有EDTA的胰蛋白酶0.5ml，放置于温室孵育箱3～5min后，在倒置显微镜下观察见大部分细胞呈圆形脱落，随液体流动。加入5mlDMEM终止消化，用吸管反复吹打，使贴壁细胞尽可能的完全脱落下来，移入离心管中，1500rap/min，离心5min后，弃上层清液，加入5ml含有15％FBS的DMEM反复吹打，使细胞呈单个细胞。将细胞液按1:2接种于新的60mm培养皿中进行传代培养。记为P1放置于培养箱中继续培养。以后的传代细胞记为P2，P3…代细胞。第20代BMSCs1.4MTT检测：取生长状态良好地P2，P4代细胞，弃培养基，PBS洗涤3次后，加入0.25％含有EDTA的胰蛋白酶0.5ml，放置于温室孵育箱1～2min后，在倒置显微镜下观察见大部分细胞呈圆形脱落，随液体流动。加入4mlDMEM终止消化，用吸管反复吹打，使贴壁细胞尽可能的完全脱落下来，移入离心管，1500rap/min，离心5min后，弃上层清液，加入4mlDMEM,用吸管反复吹打使细胞呈单细胞悬液，滴加10ul在细胞计数板上，在显微镜下进行细胞计数。细胞浓度＝(A1+A2+A3+A4)÷4×10000.所需细胞悬液体积＝细胞数÷细胞浓度。以2.5×103个细胞/孔移入7个96孔板(一天用一块96孔板防止污染)，每孔100μl，每组设5孔，再在每孔加入含5％FBS的DMEM培养基。分别于接种后1、2、3、4、5、6、7天加MTT液(MTT用PBS溶解浓度为5mg/ml，过滤灭菌，4℃避光保存)10μl，37℃孵育4小时，小心弃除培养液，加入DMSO150μl，振荡待甲臜产物充分溶解，置酶标仪测定OD值(波长490nm)，计算每组5个孔OD的平均值，以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞增殖。1.5流式细胞仪检测细胞周期：取生长状态良好的P1,P4代细胞，加入0.25％的胰蛋白酶(含有EDTA)0.5ml，放置在温室孵育箱孵育3～5分钟。在倒置显微镜下观察，见大部分细胞脱落，呈圆形并随液体流动，加入5mlDMEM培养基终止消化，1500rap/min，离心5min，弃上层清液。加入3mlPBS洗涤3遍，1500rap/min，离心5min。离心后弃上层清液，加入1mlPBS重悬浮，震荡加入9ml70％冰乙醇。放置于4℃冰箱固定30min。1500rap/min，离心5min，离心后去上层清液，加入冷PBS洗涤1次，加入400ulPI染液，室温避光放置15min。1.6BMSCs表型检测：取第10代兔BMSCs约1.5×106个，胰酶消化，1500转/min离心5min，PBS洗涤2次，加入100ul的PBS重悬细胞；分别加一抗鼠抗兔CD44、CD45，室温放置30min；用PBS洗涤2次，100ulPBS重悬细胞，加入相应二抗山羊抗小鼠PerCP标记单克隆抗体，室温避光放置30min；加PBS洗涤3次，以300ulPBS重悬细胞，上机。1.7探究冻存技术对BMSCs的影响以及体外定向诱导分化实验：1.7.1冻存与复苏：取对数生长期的第5代兔BMSCs消化、离心，加入冻存保护液，程序降温过夜后转入液氮中30d复苏，冻存后细胞复苏后24小时内细胞可贴壁，但不贴壁细胞数目较对照组增加，细胞梭形，较瘦长，部分细胞出现老化，传代时间延长，多次传代后细胞可逐渐恢复冻存前状态，1.7.2.BMSCs复苏后计算细胞存活率、MTT吸光度发现：短期冻存后BMSCs的存活率为(84.38士3.78)％，实验组细胞生长潜伏期延长，MTT吸光值从第3天开始增加(即细胞增殖速度)，第4天后增殖速度能够与对照组持平(P>0.05，n＝8)，随后进入平台期。1.7.3细胞周期检测实验组对照组各选1皿细胞消化、离心、洗涤，流式细胞仪进行细胞周期检测。实验组对照组G1、S、G2/M期的细胞比例及增殖指数(PI)差异无统计学意义(P>0.05，n＝9)。1.7.4BMSCs表面标志实验组对照组表面抗原阳性率(％)分别为CD44：93.62±1.05、93.95±0.71；CD45：0.24±0.11、0.29±0.10，经统计学处理差异无统计学意义(P>0.05，n＝3)，冻存复苏对BMSCs表面抗原无明显影响，细胞并未因冻存而发生变异。1.7.5.ALP表达情况实验组和对照组经成骨诱导后7d、14d后ALP含量，随诱导时间增加，ALP含量呈递增趋势，两个时间点，实验组和对照组ALP含量变化均无统计学差异(P>0.05，n＝9)。1.7.6Ⅰ型胶原免疫组织化学染色成骨诱导14d，实验组和对照组Ⅰ型胶原染色均呈阳性表达，细胞胞浆出现棕黄色颗粒，大小形态均一，经冻存后BMSCsⅠ型胶原蛋白表达量(平均光密度分析)变化与未冻存组相比无统计学意义(P>0.05，n＝9)。1.7.7钙结节茜素红染色实验组和对照组成骨诱导分化培养到约10d左右细胞呈梭形表面粗糙，细胞间隙紧密，细碎颗粒、扁平样改变，14d左右漩涡中心形成细胞团，21d形成钙化结节，肉眼可见培养皿底散在白色状物，染色后均为红色，两组钙结节面积差异无统计学意义(P>0.05，n＝9)。2.Ad-hBMP-2转染MSCs的试验，转染后检测目的基因骨形态发生蛋白-2的表达。2.1Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs根据病毒滴度以感染复数(MOI)50、100、200感染兔BMSCs。转染48h后，荧光显微镜下观察，可见感染复数为100转染的细胞，转染效率达95％以上，感染复数为50转染的细胞状态良好，但细胞内出现绿色荧光蛋白相对比较少，转染效率约为60％左右，当感染倍数为200时的感染效率较感染倍数为100时的感染效率无明显增加，荧光显微镜下见EGFP的表达说Ad-BMP-2/EGFP包装成功。Ad-BMP-2/GFP染兔BMSCsa:MOI:50,b:MOI:100,c:MOI:200。2.2免疫组化取Ad-BMP-2转染48h后的细胞消化后爬片，按S-P免疫组化试剂盒进行操作，DAB显色，封片，倒置显微镜观察，未转染组当对照。转染后BMP-2、免疫组化检测结果示兔BMSCs细胞胞浆呈阳性表达，可见棕黄色染色，而未转染细胞呈阴性，可能由于细胞内分泌的BMP-2蛋白量较少，抗原抗体结合量不足，估胞浆无染色，2.3Westen-blot检测转染后细胞BMP-2的表达转染后48h，分别提取转染48h后及未转染的细胞蛋白，Western-blot检测到约Mr30000大小的阳性条带，而Ad-EGFP组及未转染组的条带较弱，说明Ad-BMP-2/EGFP转染兔BMSCs后BMP2目的蛋白在细胞内有高表达。3.同种异体DBM材料的制备、生物相容性检测及力学性能分析。健康新西兰大白兔处死后取其四肢骨干骺端骨及椎体松质骨，根据Urist等方法经-80℃低温冻存72h，剔除骨组织以外组织，脱钙液(桂林医学院附属医院病理科提供)脱钙72h，置乙醚、乙醇中脱脂各24h，以无菌蒸馏水反复冲洗、浸泡，直至浸泡液呈中性为止。此时松质骨块呈白色海绵状，能压缩变形并自动恢复至原状。去酸处理后的骨块继续在蒸馏水中浸泡24h，取出后自然晾干,制成4mm×4mm×3mm脱钙骨基质,环氧乙烷消毒，4℃保存备用。倒置显微镜下观察支架材料有良好的孔隙结构，取部分样品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后观察。通过扫描电镜观察脱钙骨基质材料表面较平整，可见脱钙骨基质呈现疏松多孔结构，孔径大小不一，形状不规则并相互交通。脱钙骨基质的孔隙直径为215±86μm，孔隙率达76±3.51％，4.Ad-hBMP-2转染MSCs与DBM的体外复合试验，掌握两者之间最佳复合条件。选取脱钙骨基质24块，放入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液中浸泡12h，无菌滤纸吸干备用。选取BMP-2基因转染48h后的BMSCs与同期对照组细胞接种，细胞悬液充分渗入后放入37℃、5％CO2、饱和湿度孵箱中贴附4h，再缓慢加入体积分数为15％胎牛血清的DMEM培养液静置培养，隔天换液。培养48h后倒置显微镜、荧光显微镜观察细胞黏附情况，所示。材料与细胞复合培养第7天，取各组部分样品，PBS漂洗，2％戊二醛固定，丙酮依次梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，喷金后观察。通过扫描电镜观察到细胞与脱钙骨基质材料复合体外培养7天后扫描电镜观察可见脱钙骨表面的细胞粘连成片，细胞布满孔隙，呈伸展状、立体状生长，5.DBM/Ad-hBMP-2转染MSCs的体内植入试验，并对所修复股骨头进行放射学(X线及MRI)、解剖学、组织学、电镜扫描、能谱分析检测，评估其对股骨头坏死的修复效果。5.1制造兔股骨头坏死模型：实验动物均右侧参与实验，参照髓芯减压术联合液氮冰冻的操作步骤，实验动物取俯卧位，10％水合氯醛水溶液耳缘静脉注射(3ml/kg)麻醉。找到股骨头体表投影位置，横线为脊柱位置，“●”为股骨大转子，“+”为股骨头体表投影。由臀大肌与阔筋膜张肌的间隙进入，暴露臀小肌及髓关节外旋肌群，并贴骨面将其切断，暴露关节囊以后小十字口切开，外旋股骨头，使股骨头暴露而不使其脱位，在骨与软骨的交界处用直径为3.5mm的无菌钻头，向股骨头方向打孔，深度为4mm，用小刮匙刮除股骨头内骨质，造成约50％的缺损，然后用液氮持续冷冻股骨头，约5min，手术后饲养四周，X线确认造模是否成功，5.2将组织工程骨植入动物模型体内，用RT-PCR、RTFQ-PCR和Westen-blot检测hBMP-2在动物体内的活性：5.2.1选取36只造模成功实验动物，随机分为A、B、C三组，分别向股骨头坏死部位填塞DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，然后用医用凝胶海绵封闭隧道口，逐层关闭切口；术后各组实验动物臀大肌处注射青霉素钠注射液预防感染(40万单位/只·天，连续3天)。5.2.2PCR检测hBMP-2基因的表达:术后1、2、3周各组分别处死4只兔子，取部分股骨头样品放入研钵，加入液氮，研磨成粉末后加入1.5mlEP管，然后按照总RNA提取试剂盒(离心柱型)操作步骤操作，并通过凝胶电泳进行质量检测，使用分光光度计进行纯度浓度测定，计算出RT-PCR反应体系(20μl体系)中所需1μgRNA所需的体积量。使用PCR仪与M-MLVFirstStrandKit试剂盒合成cDNA。根据hBMP-2的基因序列利用primer5.0合成引物，使用PCR仪与2×TaqPCRMasterMix试剂盒进行PCR扩增，扩增产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测，用培清JS-780全自动凝胶成像分析系统进行拍照、分析。结果显示：凝胶成像分析系统显示:DNAMarker大小为100-600bp，GAFDH大小为221bp，目的条带(hBMP-2)大小为180bp。术后1、2、3周，A组和B组hBMP-2目的基因均为阴性表达，C组在植入后第1、2、3W后hBMP-2目的基因均为阳性表达，5.2.3RTFQ-PCR技术检测hBMP-2基因的表达:取1.2.3中C组1、2、3WRNA1μg，逆转录合成为cDNA。逆转录产物用7500Fast实时荧光定量PCR仪检测分析。结果显示：RTFQ-PCR:C组兔子植入hBMP-2/BMSCs/DBM后，第1、2、3周时hBMP-2基因均有表达。设C组术后1周时hBMP-2基因的相对表达量为(RQ)＝1，2、3WRQ值分别为0.947±0.025、0.895±0.059。1周与2周比较P＝0.072＞0.05，2周与3周比较P＝0.081＞0.05，无统计学差异。5.2.4WesternBlot检测hBMP-2蛋白的表达:术后1、2、3周各组分别处死4只兔子，取部分股骨头样品放入研钵，加入液氮，研磨成粉末后按照总蛋白提取盒步骤提取总蛋白。提取物用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，转膜，一抗，二抗，显影，Bio-RadChemiDocXRS+化学发光成像系统曝光，以内参为标准，计算出每组蛋白的相对表达量。其结果显示：术后1、2、3周A组和B组hBMP-2蛋白均为阴性表达，C组hBMP-2蛋白均为阳性表达，凝胶成像系统灰度分析显示:C组术后1、2、3周hBMP-2蛋白目的/内参表达量的值分别为0.530±0.056、0.507±0.066、0.475±0.086，且1周与2周、1周与3周、2周与3周两两比较的P值分别为:0.702、0.382、0.607，均大于0.05，无统计学差异，5.3将组织工程骨植入动物模型，评估其对股骨头坏死的修复效果。5.3.1选取48只动物模型，随机分为A、B、C、D组，每组12只。A组为造模组，不做处理，复温后立即逐层关闭切口；B、C、D各组动物在造模复温后沿向钻孔内分别填塞体积为3mm×3mm×3mm大小的DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，医用凝胶海绵封闭隧道口，逐层关闭切口；术后各组动物臀大肌注射青霉素钠预防感染(40万U/只/d，连续3d)。5.3.2X线检查：术后第4、8、12周，所有实验动物在全麻下拍摄双髋关节正位片，X线片拍摄在桂林医学院附属医院医院放射科完成，拍摄条件为45kV、125mA，投照距离为100cm，曝光时间为32ms。其结果示：A组术后4w时，实验侧股骨头钻孔清晰可见，边缘锐利，骨缺损区呈现低密度影，部分标本出现了小囊性变，股骨头轮廓欠规则，扁平塌陷，密度不均；术后8w时，低密度透光区仍然清晰可见，缺损区周围有骨吸收现象，股骨头关节面进一步塌陷，且骨小梁结构不清晰；12w时股缺损区仍然透亮，股骨头外形缩小，缺损严重，完全塌陷，B组术后4w时，股骨头骨密度降低，缺损区仍然存在，填充材料呈高密度影，未见明显吸收，周围见明显透光区，股骨头无塌陷；术后8w时，股骨头形态仍正常，填充材料周围透光区仍清晰，钻孔区密度高而均匀，钻孔边缘出现放射状骨小梁接合现象，但骨小梁结构比较紊乱；12w股骨头缺损区仍然存在，填充材料呈高密度影，体积较前略变小，与周围边界模糊，缺损区可见少许成骨反应及松散骨小梁结构，C组4、8、12w变化与B组大致相同，D组术后4w时，人工骨影模糊，钻孔区有密度增高影，质地均匀，钻孔边缘变得模糊；术后8w时，人工骨影缩小，边界不清，周围透光区影模糊；12w股骨头内出现规则连续骨小梁，钻孔边缘与人工骨交界区骨小梁接合很好，界限模糊，看不到骨缺损的低密度影，钻孔区骨密度接近周围骨质，未出现股骨头塌陷和关节间隙狭窄等骨性关节炎表现，5.3.3Lane-SandhuX线评分整理各组动物X线检查结果，参照Lane-SandhuX线评分标准对各组股骨头修复情况进行评分，其标准见表1：表1.Lane-SandhuX线评分标准含义分值骨形成无骨形成0骨形成占缺损25％1骨形成占缺损50％2骨形成占缺损75％3骨形成充满缺损4骨连接骨折线清楚0骨折线消失2骨折线部分存在4骨塑形未见骨塑形0骨髓腔形成2皮质骨塑形45.3.4股骨头大体观察术后4周、8周、12周行X线检查后，每组随机选取4只实验动物，以空气栓塞法处死，取出双侧股骨，清除表面组织，观察股骨头形态，测量钻孔孔径，测量完毕后置入-80℃超低温冰箱保存，以备后续实验使用。其结果显示：A组术后4w钻孔存在，孔径(3.200±0.163)mm，钻孔周围可见少许纤维组织，股骨头部分塌陷；8w孔径(3.225±0.150)mm，纤维组织继续增生；12w钻孔依然存在，孔径(3.275±0.096)mm，股骨颈缩短，周围可见大量鲜红色纤维组织覆盖，股骨头完全塌陷，B组术后4w钻孔清晰可见，孔径(3.000±0.141)mm，股骨头未见塌陷；8w时孔径呈椭圆形，周围可见少许成骨，股骨头无塌陷；12w时钻孔呈不规则形，长径(2.500±0.141)mm，股骨头无塌陷，C组术后4w仍可见钻孔，孔径(3.200±0.163)mm，股骨头无塌陷；8w时孔径(2.825±0.126)mm，钻孔周围有少许成骨，股骨头未见塌陷；12w时钻孔径(2.475±0.170)mm，可见成骨反应，股骨头无塌陷，D组术后4w可见钻孔不规则改变，孔径(2.475±0.170)mm，周围可见少许成骨反应，股骨头未见塌陷；8w时孔径(1.500±0.216)mm，周边可见明显成骨反应，开始有新生骨长入缺损区，色泽近似周围组织；12w钻孔已经完全消失，完全被新生骨替代，钻孔区仅残留少许结节样修复痕迹，新生骨色泽与正常组织无明显差异，股骨头完好，5.3.5HE染色和镜检：取出1.2.6中股骨头标本和一块正常股骨头，沿转子间连线锯断股骨头，行HE染色，其步骤如下：①股骨头标本用4％多聚甲醛固定5天。②用蒸馏水将固定标本冲洗3次，然后沿转子间连线锯断，投入体积分数10％硝酸溶液中进行脱钙5天。③用梯度酒精脱水：体积分数60％酒精脱水1h，体积分数70％酒精脱水1h，体积分数80％酒精脱水过夜，体积分数90％酒精脱水lh，体积分数95％酒精脱水30min，无水乙醇脱水1h，再无水乙醇脱水1h，纯氯仿中静置48h，使组织变得透明，5.5h后更换一次纯氯仿。④对上述标本进行浸蜡处理，第一蜡2h，第二蜡2h，然后用蜡块包埋标本，行5μm厚冠状切片，连续5张。A、B、C、D组及正常组(健侧股骨头)标本于倒置显微镜下观察观察骨小梁形态、成骨细胞并计算空骨陷窝率。空骨陷窝率＝空骨陷窝数/总骨陷窝数。其结果显示：股骨头正常结构可见大量骨髓组织，骨小梁规则，骨细胞形态正常，A组术后4w时骨小梁疏松，部分断裂，大量骨细胞坏死；8w时骨小梁结构紊乱、坏死，部分坏死骨小梁开始吸收，出现较多破骨细胞；12w时骨小梁广泛断裂、坏死、吸收，髓腔内出现大量坏死组织，空骨陷窝被挤压变形，B组术后4w骨小梁结构不规则，少许断裂，软骨细胞、骨细胞、骨髓细胞坏死量较A组少；8w时可见成骨反应，出现少许结构不规则的幼稚骨小梁；12w时缺损区周边有成骨反应，有向中心部生长的趋向，新生骨小梁较前增多，但仍为幼稚骨小梁，仍可见坏死骨组织，C组变化与B组大致相当，D组术后4w充填区周边出现反应带，周边为软骨性骨痂形成，孔隙内见纤维肉芽组织及毛细血管长入，未见淋巴细胞浸润等炎症反应；8w周边新骨带明显增宽，成骨反应向中心部推进,而中心部空腔面积明显减小，部分充填区基本为幼稚的骨小梁所占据,表面有较多的成骨细胞；12w时充填区广布相对较成熟的骨小梁,致密饱满，无硬化带形成，表面骨细胞数量较多且清晰可见，B和C组术后各时间点空陷细胞率、D组和正常侧组12W时差异无统计学意义，见表2。术后12w骨小梁观察(HE，×100)a～e分别为正常组织、A、B、C及D组；箭头示骨小梁；表42空骨陷窝率(n＝12,x±s)；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a与A组比较，b与B组比较，c与C组比较，d与D组，P＜0.055.3.6微观形貌观察与能谱分析：取4、8、12周的四组标本和一块正常兔股骨头标本，每个标本剖面随机挖取3块1mm×1mm×0.5mm的样本，浸入双蒸水震荡30min，共3次；4％多聚甲醛固定15min；25％、50％、75％、95％、100％酒精各脱水15min，自然晾干；真空镀膜仪喷金处理；置入Quanta200FEG场发射环境扫描电镜和X-射线能谱仪，电镜观察样品表面微观形貌，X线能谱分析仪(EnergyDispersiveSpectrometer，EDS)测定微区主要元素(碳、氮、氧、钙、硫、磷元素)的重量百分比和原子百分比百分含量，重复3次，然后计算钙磷比。其结果显示：电镜下正常骨组织板层结构致密、完整、排列方向一致，钙化良好，表面光滑，板层之间纤维成交交错，未见骨板断裂、扭曲等现象，4周时，A组骨板裂痕仍然清晰，出现纤维增生；8周时见骨小梁变细，部分断裂，纤维增生较前增加，欠规则，未见钙化颗粒；12周时见大量扭曲纤维增生充满视野，表面未见钙化物，骨小梁大部分消失，无明显新生成骨表现。B、C两组在4～8周时可见骨小梁变细，但未出现大量断裂现象，骨小梁表面出现“云翳状覆盖物”，覆盖物表面出现钙化颗粒沉积；12周时可见纤维表面钙化颗粒进一步增多，部分钙化颗粒堆积成团块，附着于骨小梁上，但是新生骨小梁形态欠佳，新生骨版结构不整，仍不成熟，D组在4周时出现大量新生胶原纤维，形态规则，方向一致，表面可见颗粒性钙化物，出现低钙化类骨质；8周时钙化物电子密度进一步增大，低密度类骨质逐渐融合成粗大骨小梁，骨小梁表面细胞渐丰富；12周时新生骨继续改建，新生骨板致密、规则，骨小梁结构趋向正常，并出现规则的骨陷窝及骨细胞，与正常骨组织形态大致相同，正常骨组织的主要成分为钙、磷酸盐沉积，Ca、P含量较高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆盖面积约为P元素峰覆盖面积的两倍，即Ca/P＝2.06，A组在4-12W的钙磷含量均较低，各元素水平未见明显变化，Ca/P为0.82，B、C两组在4W时钙磷含量较低；8W时Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12W时Ca、P元素含量进一步上升，P元素增速明显减慢，各元素含量处于比较稳定状态，Ca含量超过了P元素，B组Ca/P＝1.33,C组Ca/P＝1.52，D组在4W时即见到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加较快，呈双峰；8W时Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P达到2.85；12W时Ca、P含量增速变缓，各元素含量逐渐稳定，Ca/P＝1.99，与正常骨组织含量及钙磷比无较大差异；本发明描述了密度梯度离心法提取兔BMSCs的实验方法，并成功完成了兔BMSCs培养、传代工作，之后对其表型进行了鉴定。通过探讨冻存技术对细胞的影响，我课题组得出短期冻存(30天以内)对细胞生物活性的影响没有统计学意义，同时通过检测ALP、Ⅰ型胶原蛋白实验证明兔BMSCs在体外诱导作用下能够像成骨细胞分化。通过病毒转染实验，本课题组采用腺病毒MOI为50、100、200三种实验组进行比较，发现MOI50转染率猪油60％，MOI100时转染率为96％，且细胞形状未见明显改变，当MOI200时，转染率也为96％，但是此时细胞形状发生明显改变，病毒对细胞产生了较强的细胞毒性。因此认为腺病毒的最佳MOI为100。转染后运用PCR、Weston-blot。免疫组化方法检测BMP-2基因在BMSCs内能够稳定表达。本发明根据Urist法成功构建DBM，并运用SEM检测发现其孔隙率接近正常骨组织，最为支架材料其性能明显优于其他支架材料。BMSCs复合DBM后，运用倒置显微镜、荧光显微镜和SEM检测，发现BMSCs与DBM复合情况良好，且复合BMSCs能在DBM表面生存，并产生细胞分泌物,证明很课题组成功构建组织工程骨。将组织工程骨进行体成骨诱导，通过茜素红染色、SEM、EDS方法检测钙结节、表面微观形貌、能谱分等指标，证明体外组织工程骨具有良好的成骨效应。经过试验，本课题组成功掌握兔缺血性股骨头坏死模型的制作方法，并成功制造合格的股骨头坏死模型。将组织工程骨植入兔股骨头坏死模型后，通过PCR、TRFQ-PCR和Wseton-blot方法检测hBMP-2表达情况，证明hBMP-2基因能够在异种体内表达，为后续实验奠定了基础。组织工程骨植入动物模型后，同意标准化饲养，尽量排出外界因素对实验结果的影响，运用X线、解剖学观察、HE染色、SEM、EDS方法检测股骨头坏死修复情况，发现植入组织工程骨的实验组比未植入组织工程的对照组有明显的修复效果。证明本发明设计的Ad-BMP-2/BMSCs/DBM对缺血性股骨头坏死有明显的修复效果。下面结合附图1对本发明进一步说明。一种腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法，该腺病毒介导基因转染自体骨髓间充质干细胞的检测方法包括：S101：将hBMP-2基因以重组缺陷型腺病毒表达载体Ad-hBMP-2转染骨髓基质干细胞BMSCs；S102：并将转染后的细胞与同种异体脱钙骨DBM支架材料在体外复合；S103：植入ANFH的动物模型并对所修复股骨头进行X线、透射电镜、组织学、免疫组化分析(半定量)及力学性能的检测。下面结合实施例对本发明的应用原理作进一步描述。本发明提供的旨在探讨基因转染对BMSCs增殖的影响及基因转染的干细胞对ANFH的修复治疗作用，阐明干细胞的增殖、分化及退变过程与ANFH的关系及其影响因素，为基因组织工程治疗ANFH提供实验依据。该课题是在总结国内外体外实验基础上的一个大胆尝试和创新。本发明在广西壮族自治区卫生厅计划项目《TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损》的分析中也发现，单纯的干细胞虽然具有很强的组织修复潜能，但其所修复的组织在3个月左右即出现退变，远期治疗效果不佳。本发明针对这一问题，用腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2基因(adenovirusmediatedhumanbonemorphogeneticprotein-2gene,Ad-hBMP-2)转染MSCs并与同种异体脱钙骨(demineralizedbonematrix，DBM)支架材料在体外复合，植入股骨头缺血性坏死(ANFH)的动物模型，期望成功修复缺血坏死的股骨头，并使其具备正常关节所需的生物学及力学特性。基因转染细胞后合成的蛋白经过自身细胞翻译后修饰，能更有效地同细胞表面受体结合，调控靶细胞的生长分化。腺病毒表达载体因具有转染效率高、目的基因高水平表达、免疫排斥反应低、安全系数高等优点，亦成为临床基因治疗的主要载体。因为骨修复是一个阶段性过程，不需要转染的目的基因长久表达，因此利用其将目的基因导入干细胞促进骨再生比较理想。选取人骨形态发生蛋白-2作为目的基因，是考虑其具有很强的促成骨细胞增殖、分化的作用。在体外对骨髓间充质干细胞有强烈的成骨转化作用。在众多的骨生长因子中，骨形态发生蛋白2在促进骨缺损修复和骨折愈合过程中效果显著，已成为骨组织工程常用的生长因子。BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。选择合适的细胞生长支架是任何组织构建过程中必须面对的难题，也是本发明着力要解决的问题之一。广泛使用选取人骨形态发生蛋白-2作为目的基因，是考虑其具有很强的促成骨细胞增殖、分化的作用。在体外对骨髓间充质干细胞有强烈的成骨转化作用。在众多的骨生长因子中，骨形态发生蛋白2在促进骨缺损修复和骨折愈合过程中效果显著，已成为骨组织工程常用的生长因子。BMP-2位于骨形成过程级联反应的上游，调控胞核内相关基因的表达，诱导细胞的成骨向分化，且成骨过程中间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等又不断合成、分泌BMP，通过正反馈机制不断促进成骨。本发明在桂林市科委的资助下对hBMP促进成骨作用在骨质疏松和椎体滑脱治疗的研究中也证实了hBMP-2的良好的成骨诱导活性。广泛使用的各种合成材料，即使进行了表面改性及修饰处理，但在生物学和力学性能上总是不尽人意。这使得近年来人们又将目光投向天然人工骨材料。因此，本发明选择同种异体脱钙骨基质材料在体外构建具有生物活性的载体-细胞因子基因转染干细胞复合物将有助于解决细胞增殖及细胞因子持续发挥作用这一难题。ZhengD等通过体内植入法证实同种异体脱钙骨基质(demineralizedbonematrix,DBM)与MSCs具有良好的生物相容性，且具有体内成骨及成软骨能力。用同种异体或异种骨制备的生物衍生骨支架材料具有天然网状孔隙系统，原骨盐支架的三维结构，其组成及结构符合生理要求，具有良好的组织相容性，有利于细胞的粘附生长与分化。天然骨从形态学和力学的观点来看，都具有合成材料无法比拟的优势。脱钙松质骨的吸收与新骨的形成基本同步,既为新骨生成提供支架,又不影响新骨的塑形，具有较好的细胞界面，利于细胞贴附、迁移与增殖。本发明在过去的几年中，在广西卫生厅计划《TGF-β1诱导骨髓间充质干细胞修复全层关节软骨缺损》的研究中，也对脱钙骨材料的生物学特征以及与干细胞的生物相容性方面进行了比较系统的研究，已证实它是一种比较理想的生物支架材料。在细胞增殖的整个周期，其降解速度与细胞增殖及分泌细胞外基质的速度相吻合，其降解率及生物黏附性能均能满足骨髓间充质干细胞的增殖需要。迄今为止，研究同行在这一命题的研究多限于基因转染细胞的体外成骨效果，而对体内如何控制骨髓间充质干细胞移植到体内后的分化方向及细胞诱导因子的持续有效的释放等方面的研究还很不成熟，这离完整地理解并应用组织工程这一原理来修复病变组织相差甚远。结合国内外同行的研究报道和本发明的研究基础，不难推断，如能将使hBMP在整个组织修复过程中持续地对细胞发生作用，使之朝我们需要的组织细胞形态分化，必将把组织工程学理论在股骨头缺血性坏死的研究和治疗向前推进一大步。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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