一种重复性DNA的合成与组装方法及其应用与流程

文档序号:12346507阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:该方法包括如下步骤:

步骤(1)、重复性DNA序列分析:将需要合成的重复性DNA序列进行酶切位点分析和重复性分析;

步骤(2)、序列拆分与接口选择:根据步骤(1)的分析结果,将所述的重复性DNA序列分为多个亚片段,并确定每个所述的亚片段的接口序列;

步骤(3)、引物的设计:根据步骤(2)的所述的亚片段和所述的接口序列分别对每个所述的亚片段设计并合成引物;

步骤(4)、DNA片段的合成:根据步骤(3)设计并合成的引物进行多个DNA片段的合成;

步骤(5)、重复性DNA的组装:将步骤(4)合成的多个DNA片段、10X T4 DNA Ligase Buffer、T4 DNA 连接酶、II性限制性内切酶以及蒸馏水配置成反应体系,将所述的反应体系进行热循环反应完成重复性DNA产物的组装,其中,所述的热循环的步骤为:

1)、37℃反应4~6分钟;

2)、37℃反应2~4分钟,16℃反应4~6分钟,该步骤循环进行22~28次;

3)、37℃反应8~12分钟;

4)、50℃反应4~6分钟;

5)、80℃反应4~6分钟;

6)、4℃进行保存。

2.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:步骤(1)中,进行重复性DNA序列分析,确保所述的重复性DNA序列内部没有II型限制性酶切位点BsaI、BbsI与BsmBI,同时,找出重复性序列的边界位置,并以此作为步骤(2)中的接口序列选择的依据。

3.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:步骤(1)中,采用Lasergene软件套装的genequest模块进行重复性DNA序列分析。

4.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:步骤(2)中,亚片段为2~8个;每个所述的接口序列的内部不能出现镜像重复序列,并且,每两个所述的接口序列没有相同的序列,也没有完全反向互补的序列。

5.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:步骤(3)中,将步骤2中每一段拆分的序列进行接头序列的添加,以确保II型限制性酶切位点的正确性,并在引物末端序列上添加通用的扩增序列。

6.根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:步骤(4)中,进行DNA片段合成的方法包括:用长引物作为模板进行通用引物扩增、扩增模板得到、人工基因合成方法获得。

7. 根据权利要求1所述的重复性DNA的合成与组装方法,其特征在于:步骤(5)中,所述的反应体系中各组分的用量为:每个DNA片段各18~22ng;10X T4 DNA Ligase Buffer 1.5~2.5µL;T4 DNA 连接酶 0.8~1.2µL;II性限制性内切酶1.3~1.8µL;最后用蒸馏水补足20µL。

8.一种由权利要求1至7中任一项所述的合成与组装方法组装的重复性DNA在重复性DNA文库的PCR扩增制备与重复性DNA的PCR扩增制备中的应用。

9.一种重复性DNA的PCR扩增制备方法,其特征在于:包括如下步骤:

步骤(1)、根据权利要求1至7中任一项所述的合成与组装方法组装的重复性DNA产物设计上下游引物;

步骤(2)、将dNTPs混合物、10x Taq Buffer、上下游引物、权利要求1至7中任一项所述的合成与组装方法组装的重复性DNA产物、Taq酶配置成反应体系,然后将所述的反应体系进行热循环反应完成重复性DNA的PCR扩增,其中,所述的热循环的步骤为:

1)、95℃反应4~6分钟;

2)、95℃反应0.8~1.2分钟,58℃反应0.8~1.2分钟,72℃反应1.5~2.5分钟,该步骤循环进行28~32次;

3)、72℃反应8~12分钟;

4)、4℃进行保存。

10. 根据权利要求9所述的重复性DNA的PCR扩增制备方法,其特征在于:所述的反应体系中各组分的用量为:共计40mM 的dNTPs混合物0.8~1.2µL、10x Taq Buffer共4.5~5.5µL、浓度各为10mM的上下游引物各1.8~2.2µL、权利要求1至7中任一项所述的合成与组装方法组装的重复性DNA产物1.8~2.2µL、Taq酶共1.8~2.2µL。

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