一种动态循环细胞培养器及细胞培养方法与流程

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种动态循环细胞培养器及细胞培养方法。

背景技术：

T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。它可以直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞生长因子等，成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。

有关T细胞的演化以及它与癌症的研究在近几十年内取得了不少进展。特别是21世纪初人类开始的生命方舟计划对于T细胞的演化以及它与癌症的研究更是取得了突破性的进展。人体可天然产生T细胞，但数量较少。成功培育T细胞，并将这种细胞大量注入患者体内，以增强免疫系统成为可能。

现有的细胞培养方法主要有两类：第一类方法是使用细胞培养皿，高品位的层流罩和二氧化碳培养箱进行细胞培养，这类方法效率较低，不能满足临床需求；第二类方法是通过中空纤维反应器对细胞进行培养，参见图1，所述中空纤维反应器1包括中空纤维管以及安装所述中空纤维管的圆柱形外壳(图中未示出)，所述中空纤维管的内部用于输入培养液(图中箭头a所示)，为培养液通道11，所述中空纤维管的外部与所述外壳之间的空隙用于接种细胞，为细胞生长腔12，通过将培养液流经所述中空纤维管，并通过所述中空纤维管的孔径进入所述细胞生长腔12为细胞提供营养，所述细胞生长腔12内的细胞培养过程中不断产生废液并排至外部，这样不断地为细胞培养提供培养液，培养液的用量较大，并且在将废液排出时会将细胞培养过程中产生的有利于细胞生长的细胞生长因子一同排出，细胞培养环境不稳定，不利于细胞生长。

技术实现要素：

本发明的实施例提供一种动态循环细胞培养器及细胞培养方法，能够为所述细胞生长腔不定时地补充细胞生长因子，提高细胞培养效率。

为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供一种动态循环细胞培养器，包括：

中空纤维反应器，所述中空纤维反应器包括培养液通道和细胞生长腔；

细胞生长因子输送泵；所述细胞生长因子输送泵的输入端用于输入细胞生长因子，所述细胞生长因子输送泵的输出端与所述细胞生长腔的进口连通，所述细胞生长因子输送泵用于向所述细胞生长腔输送细胞生长因子。

优选的，所述培养器还包括细胞生长因子储罐，所述细胞生长因子储罐的出口与所述细胞因子输送泵的输入端连通，所述细胞生长因子储罐的底部设置有进口，所述细胞生长因子储罐的进口处设置有截止阀，所述截止阀用于在关闭时将所述细胞生长因子储罐内的细胞生长因子与外界隔离。

优选的，所述培养器还包括压力扩展箱和培养液输送泵，所述压力扩展箱内充有气体，所述压力扩展箱的底部与所述培养液通道或者所述细胞生长腔连通；

所述培养液输送泵的输入端用于输入培养液，输出端与所述培养液通道的进口连通，所述培养液输送泵用于将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道，使得所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力差正负交替变化，所述压力扩展箱用于通过气体容积的变化使得所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力平衡。

优选的，所述动态循环细胞培养器还包括废液储罐、废液输送泵和第一采样器，所述废液输送泵的输入端与所述培养液通道的出口连通，输出端与所述废液储罐连通，所述第一采样器的采集端与所述培养液通道的出口连通，第一采样器用于对流经所述培养液通道的培养液进行取样。

进一步优选的，所述动态循环细胞培养器还包括第二采样器，所述第二采样器的采集端与所述细胞生长腔连通，所述第二采样器用于对所述细胞生长腔内的细胞和培养液进行取样。

可选的，所述动态循环细胞培养器还包括细胞采集器，所述细胞采集器的进口与所述细胞生长因子储罐和所述细胞生长因子输送泵之间的管道连通，所述细胞采集器用于在所述细胞生长因子输送泵反向运转时将所述细胞生长腔中的细胞采集起来。

进一步优选的，所述动态循环细胞培养器还包括控制器，所述控制器分别与所述截止阀、培养液输送泵、细胞生长因子输送泵、废液输送泵电连接，用于控制所述截止阀、培养液输送泵、细胞生长因子输送泵和废液输送泵的开启和关闭，并控制所述培养液输送泵将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道，控制所述细胞生长因子输送泵正向运转或者反向运转。

另一方面，本发明实施例提供一种动态循环细胞培养方法，应用于如上所述的动态循环细胞培养器，包括：

通过所述细胞生长因子输送泵向所述细胞生长腔输送细胞生长因子，使得所述细胞生长腔内的细胞生长因子含量保持在第一预设范围内。

可选的，所述方法还包括：每隔第一预设时间，通过所述第一采样器对流经所述培养液通道的培养液进行取样检测，若所述培养液中代谢产物浓度大于等于第一预设值时，则通过所述控制器控制所述废液输送泵开启，将流经所述培养液通道的培养液排至所述废液储罐内。

进一步地，所述方法还包括：每隔第二预设时间，通过所述第二采样器对所述细胞生长腔的细胞和培养液进行取样对其中的细胞密度进行检测，若所述细胞密度大于等于第二预设值，则通过所述控制器控制所述细胞生长因子输送泵反向运转，将所述细胞生长腔中的细胞输送至所述细胞采集器中。

可选的，所述通过所述控制器控制所述细胞生长因子输送泵反向运转，将所述细胞生长腔中的细胞输送至所述细胞采集器中之后还包括：通过所述控制器控制所述细胞生长因子输送泵正向运转，通过所述细胞采集器向所述细胞生长腔接种细胞。

本发明实施例提供的一种动态循环细胞培养器及细胞培养方法，在细胞培养过程中，随着细胞生长，生长因子会不断被消耗，同时随着废液的不断排出，所述细胞生长腔的细胞生长因子含量会降低，通过设置细胞生长因子输送泵，通过所述细胞生长因子输送泵能够不定时地向所述细胞生长腔输送细胞生长因子，保持所述细胞生长因子含量保持在一定的范围内，从而能够提高细胞培养效果。

附图说明

图1为现有技术提供的一种细胞培养反应器的结构示意图；

图2为本发明实施例提供的一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图3为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图4为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图5为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图6为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图7为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图8为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图；

图9为本发明实施例提供的另一种动态循环细胞培养器的结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明实施例提供的一种动态循环细胞培养器及细胞培养方法进行详细描述。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

需要说明的是，本发明实施例提供的动态循环细胞培养器适用于各种细胞的培养，根据细胞种类的不同仅通过改变各种细胞生长所需的环境参数即可，例如，培养液中各营养物质的浓度参数，细胞因子浓度参数等；本发明实施例尤其适用于悬浮细胞和贴壁细胞的培养。

一方面，本发明实施例提供一种动态循环细胞培养器，参见图2，包括：

中空纤维反应器1，所述中空纤维反应器1包括培养液通道11和细胞生长腔12；

细胞生长因子输送泵02；所述细胞生长因子输送泵02的输入端用于输入细胞生长因子，所述细胞生长因子输送泵02的输出端与所述细胞生长腔12的进口连通，所述细胞生长因子输送泵02用于向所述细胞生长腔12输送细胞生长因子。

本发明实施例提供的一种动态循环细胞培养器，在细胞培养过程中，随着细胞生长，生长因子会不断被消耗，同时随着废液的不断排出，所述细胞生长腔12的细胞生长因子含量会降低，通过设置细胞生长因子输送泵02，通过所述细胞生长因子输送泵02能够不定时地向所述细胞生长腔12输送细胞生长因子，保持所述细胞生长因子含量保持在一定的范围内，从而能够提高细胞培养效果。

本发明的一实施例中，参见图3，所述培养器还包括细胞生长因子储罐3，所述细胞生长因子储罐3的出口与所述细胞因子输送泵02的输入端连通，所述细胞生长因子储罐3的底部设置有进口，所述细胞生长因子储罐3的进口处设置有截止阀a，所述截止阀a用于在关闭时将所述细胞生长因子储罐3与外界隔离。

在本发明实施例中，通过设置截止阀a，能够避免外界细菌进入所述细胞生长因子储罐3内。

其中，需要说明的是，由于中空纤维反应器通常包括容器以及设置在所述容器内的至少一个中空纤维管，所述中空纤维管的内部与外部分别为所述培养液通道11和所述细胞生长腔12，例如，当所述中空纤维管的内部为所述培养液通道11时，则所述中空纤维管的外部为所述细胞生长腔12，当所述中空纤维管的外部为培养液通道11时，则所述中空纤维管的内部为所述细胞生长腔12。

还需要说明的是，在对悬浮细胞进行培养时，可以直接将悬浮细胞接种于细胞生长腔12内，细胞呈悬浮状态，而在对贴壁细胞进行培养时，需要对细胞生长腔12的表面进行预处理，例如，当所述中空纤维管的内部为细胞生长腔12时，则在所述中空纤维管的内壁上铺设一层蛋白，使得细胞能够附着于所述中空纤维管的内壁进行贴壁培养。反之亦然。

本发明的一实施例中，所述培养器还包括压力扩展箱2和培养液输送泵01，所述压力扩展箱2内充有气体，所述压力扩展箱2的底部与所述培养液通道11或者所述细胞生长腔12连通；

所述培养液输送泵01的输入端用于输入培养液，输出端与所述培养液通道11的进口连通，所述培养液输送泵01用于将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道11，使得所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力差正负交替变化，所述压力扩展箱2用于通过气体容积的变化使得所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力平衡。

通过设置压力扩展箱2，并在所述压力扩展箱2内充入一定量的气体，将所述压力扩展箱2与所述培养液通道11或者细胞生长腔12连通，并通过所述培养液输送泵01以脉冲波的形式向所述培养液通道11输送培养液，使得所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力差正负交替变化，当所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力差为正时，培养液通道11的培养液进入所述细胞生长腔12，所述压力扩展箱2内的气体容积被压缩至所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力平衡，当所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力差为负时，所述细胞生长腔12的废液进入所述培养液通道11，所述压力扩展箱2内的气体容积增大直至所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力平衡，从而能够实现培养液和废液的动态交换；对所述细胞生长腔12的培养液进行更新的同时模拟体内培养，为细胞生长提供稳定的生理环境，减少培养液的消耗。

其中，还需要说明的是，针对不同的细胞种类，培养液和废液的交换量也有所不同，并且需要施加给所述培养液通道11和所述细胞生长腔12之间的压力差也会有所不同，例如，所述贴壁细胞与所述悬浮细胞相比，由于贴壁细胞贴附在所述中空纤维管的管壁上，或多或少会对培养液和废液的交换产生阻挡，因此，通常贴壁细胞培养时所述培养液通道11和所述细胞生长腔12之间的压力差略大于悬浮细胞培养时的压力差。

本发明的又一实施例中，参见图4，所述动态循环细胞培养器还包括培养液储罐4，所述培养液储罐4的出口与所述培养液输送泵01的输入端连通，所述培养液通道11的出口与所述培养液储罐4的进口连通。

在本发明实施例中，通过设置培养液储罐4，能够形成培养液循环回路，在培养液和废液进行交换的过程中，流经所述培养液通道11的培养液能够不断将排出的废液带回所述培养液储罐4，并用于不断供液，对培养液进行动态循环利用，减少培养液浪费，并能够保留废液中的有利于细胞生长的营养物质，有利于细胞培养。

本发明的一实施例中，参见图5，所述动态循环细胞培养器还包括废液储罐5、废液输送泵03和第一采样器04，所述废液输送泵03的输入端与所述培养液通道11的出口连通，输出端与所述废液储罐5连通，所述第一采样器04的采集端与所述培养液通道11的出口之间的管道连通，第一采样器04用于对流经所述培养液通道11的培养液进行取样。

通过第一采样器04对所述培养液通道11流出的培养液进行取样，能够对循环回路中的培养液的代谢产物浓度进行及时检测，从而能够根据检测结果对所述循环回路中的培养液进行及时处理，例如，当检测该循环回路中的培养液的代谢产物浓度较高，不利于细胞生长时，可以将所述废液输送泵03开启，从而将该培养液收集在所述废液储罐5中。

本发明的又一实施例中，参见图6，所述动态循环细胞培养器还包括第二采样器05，所述第二采样器05的取样端与所述细胞生长腔12连通，所述第二采样器05用于对所述细胞生长腔12内的细胞和培养液进行取样。

通过所述第二采样器05对所述细胞生长腔12的细胞和培养液进行取样，能够对所述细胞生长腔12的细胞密度进行检测，从而能够根据检测结果来确定继续培养还是对细胞进行采集，当然，还可以对所述细胞生长腔12的培养液中的代谢产物浓度进行检测，并根据检测结果对其进行相应的处理，例如：当所述细胞生长腔的培养液中代谢产物浓度过高，不利于细胞生长时，可以通过控制所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力差交替变化频率，来促进废液与培养液的交换，从而降低所述细胞生长腔12的代谢产物浓度，示例性的，所述培养液通道11和所述细胞生长腔12的压力差正负交替变化的频率可以通过控制所述培养液输送泵01的脉冲频率来实现。

本发明的一实施例中，参见图7，所述动态循环细胞培养器还包括细胞采集器06，所述细胞采集器06的进口与所述细胞生长因子储罐3和所述细胞生长因子输送泵02之间的管道连通，所述细胞采集器06用于在所述细胞生长因子输送泵02反向运转时将所述细胞生长腔12中的细胞采集起来。

在本发明实施例中，通过第二采样器05对所述细胞生长腔12的细胞和培养液进行取样，检测其细胞密度之后，若所述细胞密度达到一定值，则可以通过将所述细胞生长因子输送泵02反向运转，将所述细胞生长腔12中的细胞采集起来。

本发明的一实施例中，参见图8，所述细胞生长因子储罐3和所述细胞生长因子输送泵02之间的管道上还设置有加热器6，所述加热器6用于对流经所述管道的细胞生长因子进行加热。

通过设置加热器6，能够对进入所述细胞生长腔12的细胞生长因子的温度进行调节，提高所述细胞生长因子的活性，从而提高细胞培养效果。

本发明的一实施例中，所述动态循环细胞培养器还包括控制器(图中未示出)，所述控制器分别与所述截止阀a、培养液输送泵01、细胞生长因子输送泵02、废液输送泵03电连接，用于控制所述截止阀a、培养液输送泵01、细胞生长因子输送泵02、废液输送泵03的开启与关闭，并控制所述培养液输送泵01以脉冲波的形式向所述培养液通道11输送培养液，控制所述细胞生长因子输送泵02正向运转或者反向运转。通过设置控制器，能够对细胞培养的整个过程进行自动化控制。

本发明的一实施例中，参见图9，所述培养液储罐4的进口处设置有第一阀门b，所述培养液储罐4的顶部还设置有排气孔，所述细胞生长腔12与所述第一阀门b和所述培养液通道11之间的管道通过第一管道连通，且所述第一管道上靠近所述细胞生长腔12处设置有排气阀c，所述第一阀门b和所述培养液通道11之间的管道上还设置有第二阀门d，所述第一管道的出口与所述第二阀门d的输出端一侧连通。

在细胞培养过程中会产生废气，一部分废气会进入所述压力扩展箱2内，另外一部分废气可在所述排气阀c开启、第一阀门b开启、所述第二阀门d关闭时顺利进入所述培养液储罐4中，所述培养液储罐4能够将废气通过排气孔排至外部。

另一方面，本发明实施例提供一种动态循环细胞培养方法，应用于如上所述的动态循环细胞培养器，包括：

通过所述细胞生长因子输送泵向所述细胞生长腔输送细胞生长因子，使得所述细胞生长腔内的细胞生长因子含量保持在第一预设范围内。

本发明实施例提供的一种动态循环细胞培养方法，通过设置细胞生长因子输送泵，并随着细胞的培养，不定时地向所述细胞生长腔内输送细胞生长因子，能够防止因细胞生长而不断消耗细胞生长因子以及废液不断排出使得所述细胞生长腔的细胞生长因子含量降低，使得所述细胞生长因子的含量保持在一定的范围内，能够提高细胞培养效果。

在本发明的又一实施例中，所述方法还包括：通过所述培养液输送泵将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道，使得所述中空纤维管内外的压力差正负交替变化，在所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力差为正时，所述培养液通道的培养液进入所述细胞生长腔，所述压力扩展箱的气体容积被压缩至所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力平衡；在所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力差为负时，所述细胞生长腔的废液进入所述培养液通道，所述压力扩展箱的气体容积增大至所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力平衡。能够促进所述培养液和废液的交换，较少培养液的消耗，防止废液中对细胞生长有利的营养物质的快速流失。

其中，需要说明的是，针对不同的细胞种类，所述培养液通道和所述细胞生长腔之间的压力差需求有所不同，例如，所述贴壁细胞与所述悬浮细胞相比，由于贴壁细胞贴附在所述中空纤维管的管壁上，或多或少会对培养液和废液的交换产生阻挡，因此，通常贴壁细胞培养时所述培养液通道11和所述细胞生长腔12之间的压力差略大于悬浮细胞培养时的压力差。

其中，脉冲是指一个物理量在短持续时间内突变后迅速回到其初始状态的过程。对所述脉冲波的具体形式不做限定，所述脉冲波可以为方形波，可以为正弦波，也可以为其他形状的波形。

本发明的一实施例中，所述通过培养液输送泵将培养液以脉冲波的形式流经所述培养液通道具体包括：

控制所述培养液输送泵以第一预设速度和第二预设速度交替向所述培养液灌注侧输送培养液。

在本发明实施例中，通过控制流经所述培养液灌注侧的培养液流速，能够对所述培养液灌注侧的压力进行控制，所述培养液通道和所述细胞生长腔的压力差以方形波的形式变化，所述培养液输送泵的速度在所述方形波的波峰时，所述培养液通道的压力大于所述细胞生长腔的压力，培养液进入所述细胞生长腔直至压力平衡，接着，所述培养液输送泵的速度迅速转换到所述方形波的波谷，所述细胞生长腔的压力大于所述培养液通道的压力，废液进入所述培养液通道直至压力平衡。

其中，对所述第一预设速度和第二预设速度交替变化的频率不做限定，所述第一预设速度和第二预设速度交替变化的频率可以由接种的细胞种类来确定，由于不同的细胞种类，培养时所需要的营养物质的浓度有所差异，因此，对培养液和废液的交换频率也会有所不同。

本发明的一实施例中，所述方法还包括：每隔第一预设时间，通过所述第一采样器对流经所述培养液通道的培养液进行取样检测，若所述培养液中代谢产物浓度大于等于第一预设值时，则通过所述控制器控制所述废液输送泵开启，将流经所述培养液通道的培养液排至所述废液储罐内。

在通过培养液对所述细胞进行循环培养的过程中，随着细胞的生长会产生大量的代谢产物，通过对所述培养液通道流出的培养液进行取样检测，并在代谢产物浓度过高时控制循环回路关闭，将所述培养液排至废液储罐内，能够对细胞培养的环境进行及时更新，提高细胞培养的效率。

本发明的一实施例中，所述方法还包括：每隔第二预设时间，通过所述第二采样器对所述细胞生长腔的细胞和培养液进行取样对其中的细胞密度进行检测，若所述细胞密度大于等于第二预设值，则通过所述控制器控制所述细胞生长因子输送泵反向运转，将所述细胞生长腔中的细胞输送至所述细胞采集器中。

本发明的又一实施例中，所述通过所述控制器控制所述细胞生长因子输送泵反向运转，将所述细胞生长腔中的细胞输送至所述细胞采集器中之后还包括：通过所述控制器控制所述细胞生长因子输送泵正向运转，通过所述细胞采集器向所述细胞生长腔接种细胞。在本发明实施例中，通过所述细胞采集器还能够对所述细胞生长腔进行接种细胞，促进下一轮细胞的持续培养。

本发明的一实施例中，所述方法还包括：每隔第三预设时间，控制所述第一阀门开启、排气阀开启和第二阀门关闭，将所述细胞生长腔所产生的部分废气排入所述培养液储罐中。

通过将所述第二阀门关闭，能够使所述细胞生长腔产生的部分废气顺利排至所述培养液储罐中，并通过所述培养液储罐顶部的排气孔排至外部。

当然，所述方法还可以包括：每隔第四预设时间，通过所述第二采样器对所述细胞生长腔的培养液进行取样，并检测其细胞生长因子含量，若所述细胞生长因子含量与第一预设范围的下限之间的差值小于等于第一预设阈值，则控制所述细胞生长因子输送泵开启，通过细胞生长因子储罐向所述细胞生长腔输送第二预设量的细胞生长因子，使得所述细胞生长因子含量保持在所述第一预设范围内。

随着细胞生长不断消耗细胞生长因子以及培养液与废液的不断交换，细胞生长腔的细胞生长因子含量会减少，通过对所述细胞生长腔的细胞生长因子含量进行检测，在所述细胞生长因子含量不足时通过截止阀隔绝外界感染，向所述细胞生长腔补充无菌细胞生长因子，促进细胞良好地生长。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。