一种茶树专用有机磷分解菌YP8及其菌剂制备方法与流程

本发明涉及一种茶树专用有机磷分解菌YP8及其菌剂制备方法，属于生物技术领域。

二、

背景技术：

磷元素是植物生长的一种主要营养元素，在土壤中主要以难溶的矿物形态存在。长期以来，人们为了提高农产品产量大量使用化肥和农药，磷肥在施用后往往很快就被固定形成无效态磷，造成了作物的低吸收和磷元素在土壤中的大量积累。现已有大量关于提高植物磷利用率的研究，其中能够使难溶磷溶解的微生物的作用研究被认为是至关重要的。筛选出具有解磷能力的微生物，从而生产出富含解磷功能有益菌的微生物肥料对解决植物磷素利用问题是一条很好的途径。

三、

技术实现要素：

本发明针对上述现有情况，提供了一种茶树专用有机磷分解菌YP8及其菌剂制备方法。

发明人首先从山东茶园土壤中分离得到一株有机磷分解菌，根据其形态学、生理生化特性和分子生物特征，将其命名为恶臭假单胞菌YP8(Pseudomonas putida YP8)；已于2016年6月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO:60053；其16S rDNA序列如SEQ.ID.NO 3所示。

一种茶树专用有机磷分解菌菌剂YP8的制备方法，其制备步骤如下：

(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的蒸馏水(蒸馏水pH＝7)，高温灭菌后得到固体复合载体；

(2)菌液种子的制备：首先挑取恶臭假单胞菌YP8将其接种到100mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后将达到OD值＝0.5的培养液和LB液体培养基按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到菌株液体种子。

(3)将液体种子接种到步骤(1)得到的固体复合载体中，接种量为12％(质量比)；30℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×10¹⁰cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用有机磷分解菌菌剂。

本发明分离得到的恶臭假单胞菌YP8具有分解有机磷化物(如核酸、磷脂等)的作用。将本发明中的有机磷分解菌制备成菌剂，每亩茶园沟施2公斤，即可有效地提高茶园土壤速效磷含量。

四、附图说明

(1)图1为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida YP8)的菌落形态图

图中菌株菌落为淡黄色圆形，其表面光滑，边缘整齐，不透明，菌落呈凸起状。

(2)图2为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida YP8)的个体形态图

图中菌株个体形态为卵圆形细菌，极生鞭毛，无荚膜。

五、具体实施方式

实施例1、以茶树专用有机磷分解菌的分离、鉴定为例

本发明的发明人采集山东茶园土样，放置于无菌袋中低温保存并带回实验室4℃保存。利用有机磷培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，CaCO₃ 5g，卵磷脂适量，定容至1000mL，调pH至7.0-7.5)从土壤中筛选目标菌株。以传统的形态学、生理生化特征和PCR为基础的现代技术相结合，对培养得到的菌株进行分类鉴定，最后筛选出一株有机磷分解菌。

经过形态学观察(如图1)，发现该有机磷分解菌菌落为淡黄色圆形，其表面光滑，边缘整齐，不透明，菌落呈凸起状。从个体形态来看(如图2)，菌株为卵圆形细菌，极生鞭毛，无荚膜。

经菌株生理生化特征试验发现，菌株为革兰氏阴性菌，好氧，接触酶、氧化酶均为阳性，可利用葡萄糖、蔗糖和半乳糖作为碳源使用，能水解酪素，不能液化明胶，能运动。

提取该菌株基因组DNA为模板进行PCR，扩增16S rDNA的序列：引物16S-8F：5ˊ-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3ˊ(SEQ ID NO.1)，和16S-1510-R：5ˊ-AGGGYTACCTTGTTACGACTT-3ˊ(SEQ ID NO.2)。

反应程序如下：①94℃预变性3min；②94℃变性1min；③46℃退火50s；④72℃延伸2min；⑤重复步骤②～④30次；⑥72℃延伸10min；⑦4℃终止反应。结束后，用1×TAE缓冲液制作1％琼脂糖凝胶检测PCR产物；用康为公司的DNA回收试剂盒回收PCR的产物并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段直接由华大基因测序完成。随后在BLAST上进行检索，发现目的片段与Pseudomonas putida strain NBFPALD_RAS137的16s rRNA的DNA序列(KJ819580)相似度最高，最终确定分离物为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，将其命名为恶臭假单胞菌YP8(Pseudomonas putida YP8)，并进行了生物保藏，其保藏号为GDMCC NO:60053，其16S rDNA序列为SEQ ID NO.3。

实施例2、制备一种茶树专用有机磷分解菌菌剂

(1)固体复合载体的制备：将麦麸、草炭、硅藻土按质量百分比70％：20％：10％混匀，然后加入麦麸、草炭和硅藻土总体积1.5倍的蒸馏水(蒸馏水pH＝7)，120℃高温灭菌后得到固体复合载体；

(2)菌液种子的制备：首先挑取恶臭假单胞菌YP8将其接种到100mL LB液体培养基(胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠10g)中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后将达到OD值＝0.5的培养液和LB液体培养基按照体积比1:25的比例混匀，于30℃下震荡培养24小时，得到菌株液体种子。

(3)将液体种子接种到步骤1)得到的固体复合载体中，接种量为12％(质量比)；30℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×10¹⁰cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用有机磷分解菌菌剂。

试验例1、以茶树专用有机磷分解菌剂对有机磷分解作用的影响为例

首先挑取恶臭假单胞菌YP8接种到100mL LB液体培养基中，于30℃下震荡培养，培养至菌液OD值＝0.5。然后吸取40mL OD值＝0.5的有机磷分解菌培养液，注入到盛有1000mL LB液体培养基的中，于30℃下震荡培养24小时，得到菌株液体种子。然后将液体种子接种到已高温灭菌的固体复合载体(麦麸：草炭：硅藻土＝70％：20％：10％)中，接种量为12％(质量比)；35℃恒温培养24-48小时，至固体复合载体中的活菌数达到4.0×10¹⁰cfu/g。将达到活菌数要求的菌剂在40℃下干燥至含水量≤5％，即可得到茶树专用无机磷分解菌菌剂。

处理一：称取1g茶树专用无机磷分解菌菌剂放入灭菌的500mL所述有机磷培养基中；处理二：以不加菌剂的有机磷培养基为对照；将两个处理30℃培养48小时后，采用钼锑抗比色法进行有效磷含量测定。首先将两个处理的菌株培养液进行离心，吸取4mL离心上清液并将其移至50ml容量瓶中，用水稀释至总体积约3/5处，加入二硝基酚指示剂1～2滴，并用100g/L碳酸钠(或氢氧化钠)溶液或50ml/L硫酸(或盐酸)溶液调节至溶液刚呈微黄色，准确加入5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，室温15℃以上放置30min(8h内)，测定OD700值，并计算有效磷含量。

测定结果：处理一中有效磷浓度为0.41mg/mL，处理二中有效磷浓度为0.26mg/mL。处理一有效磷浓度是处理二中的1.57倍，可见加入茶树专用有机磷分解菌菌剂后能够提高有效磷的浓度。

试验例2、以茶树专用有机磷分解菌剂对茶园土壤磷含量的影响为例

采用小区实验方式，设置3个处理，分别为本发明制备的茶树专用有机磷分解菌剂+普通有机肥(处理一)、普通有机肥(处理二)、不施肥(处理三)。每个处理设2个小区，每个小区面积为60m²。施用菌剂量均为2公斤/亩，普通有机肥均为400公斤/亩。施肥方法采用常规的开沟方式(开沟深度为20cm左右)。各小区水分管理、病虫害防治等均相同。

测定结果：处理一小区茶园土壤有效磷含量为278.2mg/kg；处理二小区茶园土壤有效磷含量为269.6mg/kg；处理三小区茶园土壤有效磷含量为240.9mg/kg。处理一有效磷比处理二增加3％，比处理三增加16％。结果证明在茶园中施用本发明得到的茶树专用有机磷分解菌剂可提高土壤磷素肥力。

试验例3、以茶树专用有机磷分解菌剂对茶树产量的影响为例

采用小区实验方式，设置3个处理，分别为本发明制备的茶树专用有机磷分解菌剂+普通有机肥(处理一)、普通有机肥(处理二)、不施肥(处理三)。每个处理设2个小区，每个小区面积为60m²。施用菌剂量均为2公斤/亩，普通有机肥均为400公斤/亩。施肥方法采用常规的开沟方式(开沟深度为20cm左右)。各小区水分管理、病虫害防治等均相同。

测定结果：处理一小区茶树百芽重为73.29g；处理二小区茶树百芽重为71.64g；处理三小区茶树百芽重为69.11g。处理一百芽重比处理二增加2％，比处理三增加6％。结果证明本发明得到的茶树专用有机磷分解菌剂具有良好的增产作用。